CN116751197B - 卡波林生物碱或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、卡波林生物碱药物组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物药物技术领域，具体涉及卡波林生物碱或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、卡波林生物碱药物组合物及应用。卡波林生物碱或其药学上可接受的盐，对Aβ42和pTau217的活性均具有显著的抑制性；卡波林生物碱或其药学上可接受的盐或卡波林生物碱药物组合物对AD、PD、亨廷顿症、传染性海绵状脑病、肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病具有良好的治疗效果，是具有发展潜力的治疗神经退行性疾病候选药物。本发明的卡波林生物碱的制备方法不需要化学合成，以骆驼蓬种子为原料进行提取得到，原料来源广泛、成本较低，避免使用大量的有机原料以及复杂的制备过程，绿色环保，操作简单，得率高。
Description
技术领域
本发明属于生物药物技术领域，具体涉及卡波林生物碱或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、卡波林生物碱药物组合物及应用。
背景技术
神经退行性疾病，包括一系列神经系统组织或器官的结构或功能逐步恶化的疾病，常见的包括阿尔兹海默症(AD)、帕金森病(PD)等，是危害人类健康的一类主要疾病。神经退行性疾病通常使患者逐步丧失认知能力、行为能力和日常生活能力，给患者的生理和心理带来极大的痛苦，同时给患者家庭和社会带来重大的负担。目前全球罹患各类神经退行性疾病的人数、比例都呈逐年增长的趋势，但对于该类疾病仍缺少有效的治疗方法和药物。
神经退行性疾病的一个重要特征是相关蛋白的错误折叠及由此导致的蛋白质聚集。阿尔茨海默病中，淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)蛋白聚集形成淀粉样沉淀，Tau蛋白聚集形成神经纤维缠结，这也是AD两个最重要的病理学特征，但目前尚未发现同时针对这两个靶点的药物。现已被批准的用于治疗AD的药物主要都是针对乙酰胆碱酯酶的抑制剂，如利凡斯的明、多奈哌齐和加兰他敏等。它们主要是用于中期AD患者的治疗，用于改善患者的认知能力，但是这些药物的治疗效果并不理想。因此，针对联合Aβ和Tau蛋白磷酸化的两个主要靶点开发抗AD药物具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了卡波林生物碱或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用、卡波林生物碱药物组合物及应用，本发明提供的卡波林生物碱或其药学上可接受的盐对Aβ42和pTau217具有显著的活性抑制性，对治疗神经退行性疾病具有良好效果。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种卡波林生物碱，具有式I所示的结构：
其中，R1包括氢、羟基、卤素或C1-10烷氧基；
R2包括氢、C1-10醛基、C1-10酰基或C1-10烷氧基酯基。
优选的，所述卡波林生物碱具有式I-1、式I-2或式I-3所示结构：
本发明还提供了上述技术方案所述卡波林生物碱的制备方法，包括以下步骤：
将骆驼蓬种子和提取剂混合，依次进行提取和浓缩，得到浸膏；
将所述浸膏依次进行调节pH值至酸性、第一萃取、调节所述第一萃取得到的有机相的pH值至碱性、第二萃取、对所述第二萃取得到的有机相进行第一硅胶柱层析和后处理，得到所述卡波林生物碱；
所述后处理包括依次进行的第二硅胶柱层析、反相色谱分离、Sephadex LH-20分离和高效液相色谱分离；
所述第一硅胶柱层析为梯度洗脱，
第二硅胶柱层析用洗脱液为石油醚和丙酮的混合溶液，所述石油醚和丙酮的体积比为1～3:1；
所述反相色谱分离采用的洗脱液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为30～70％；所述Sephadex LH-20分离采用的溶剂为甲醇；所述高效液相色谱分离采用的色谱柱为CHIRALPAKAD-H，所述高效液相色谱分离采用的流动相为异丙醇和正己烷的混合溶液，所述异丙醇和正己烷的混合溶液中异丙醇和正己烷的体积比为20:80。
优选的，所述提取剂包括醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂；
所述第一萃取所用的有机溶剂包括酯类溶剂、醚类溶剂和卤代烷类溶剂中的一种或多种；
所述第二萃取所用的有机溶剂包括酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂；
所述调节pH值至酸性是将体系的pH值调节为2～3；
所述调节pH值至碱性是将体系的pH值调节为9～10。
本发明还提供了一种卡波林生物碱的药学上可接受的盐，包括上述技术方案所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐或具有式II～V所示结构中的任意一种的卡波林生物碱的药学上可接受的盐；
优选的，所述药学上可接受的盐包括有机酸盐或无机酸盐。
本发明还提供了上述技术方案所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐的制备方法，其特在于，包括以下步骤：
将卡波林生物碱和酸混合，进行中和反应，得到卡波林生物碱的药学上可接受的盐；
所述酸为有机酸或无机酸。
本发明还提供了一种卡波林生物碱药物组合物，包括上述技术方案所述的卡波林生物碱和/或上述技术方案所述的卡波林生物碱的药学上可接受的盐。
优选的，还包括可药用载体和/或赋形剂。
本发明还提供了上述技术方案所述卡波林生物碱、上述技术方案中具有式II～V任一项所示结构的卡波林生物碱、上述技术方案所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐或上述技术方案所述卡波林生物碱药物组合物在制备治疗神经退行性相关疾病药物中的应用。
本发明提供的卡波林生物碱或其药学上可接受的盐以及具有式Ⅱ～IV所示结构的卡波林生物碱及其药学上可接受的盐，对Aβ42和pTau217的活性均具有显著的抑制性，是具有发展潜力的治疗神经退行性疾病的药物。发明还提供的卡波林生物碱或其药学上可接受的盐或卡波林生物碱药物组合物对AD、PD、亨廷顿症、传染性海绵状脑病、肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病具有良好的治疗效果，是具有发展潜力的治疗神经退行性疾病候选药物。
本发明提供的卡波林生物碱的制备方法不需要化学合成，以骆驼蓬种子为原料进行提取得到，原料来源广泛、成本较低，避免使用大量的有机原料以及复杂的制备过程，绿色环保，操作简单，得率高。
附图说明
图1为卡波林生物碱或其药学上可接受的盐化合物对Aβ42积累抑制活性评估对比图；
图2为卡波林生物碱或其药学上可接受的盐化合物对pTau217抑制活性评估对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种卡波林生物碱，具有式I所示的结构：
其中，R1包括氢、羟基、卤素或C1-10烷氧基，优选为氢或C1-10烷氧基。在本发明中，所述卤素优选包括氟、氯、溴或碘。在本发明中，所述C1-10烷氧基优选包括甲基氧基、乙基氧基或丙基氧基，更优选为甲基氧基。
在本发明中，R2包括氢、C1-10醛基、C1-10酰基或C1-10烷氧基酯基，优选为氢。在本发明中，所述C1-10醛基优选为甲醛基(-CHO)；所述C1-10酰基优选为乙酰基(CH3CO-)；所述C1-10烷氧基酯基优选为甲酸甲酯基(HCOO-CH2-)。
在本发明中，所述卡波林生物碱优选具有式I-1、式I-2或式I-3所示结构：
本发明还提供了上述技术方案所述卡波林生物碱的制备方法，包括以下步骤：
将骆驼蓬种子和提取剂混合，依次进行提取和浓缩，得到浸膏；
将所述浸膏依次进行调节pH值至酸性、第一萃取、调节第一萃取得到的有机相的pH值至碱性、第二萃取、对所述第二萃取得到的有机相进行第一硅胶柱层析和后处理，得到所述卡波林生物碱；
所述后处理包括依次进行的第二硅胶柱层析、反相色谱分离、Sephadex LH-20分离和高效液相色谱分离；
所述第一硅胶柱层析为梯度洗脱；
所述第二硅胶柱层析用洗脱液为石油醚和丙酮的混合溶液，所述石油醚和丙酮的体积比为1～3:1；
所述反相色谱分离采用的洗脱液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为30～80％；所述Sephadex LH-20分离采用的溶剂为甲醇；所述高效液相色谱分离采用的色谱柱为CHIRALPAKAD-H，所述高效液相色谱分离采用的流动相为异丙醇和正己烷的混合溶液，所述异丙醇和正己烷的混合溶液中异丙醇和正己烷的体积比为20:80。
本发明将骆驼蓬种子和提取剂混合，依次进行提取和浓缩，得到浸膏。在本发明中，所述提取剂优选包括醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂，更优选为醇类溶剂。在本发明中，所述醇类溶剂优选包括C1～6醇，更优选为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、环戊醇、正己醇或环己醇，更进一步优选为甲醇或乙醇；所述酮类溶剂优选包括C3～6酮，更优选为丙酮、甲乙酮或甲基异丁酮；所述酯类溶剂优选包括C3～6酯，更优选为甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸乙酯；所述醚类溶剂优选包括C2～6醚，更优选为甲醚或乙醚；所述卤代烷类溶剂优选包括C1～6卤代烷，更优选为二氯甲烷、三氯甲烷或四氯乙烷。
在本发明中，所述混合前还优选包括：将骆驼蓬种子进行干燥。本发明对于所述干燥的温度和时间没有特殊限定，采用本领域熟知的干燥温度和时间即可。
在本发明中，所述骆驼蓬种子的质量和提取剂的体积比优选为1g:3～10mL，更优选为1g:3～5mL。
本发明对所述混合无特殊要求，只要能够混合均匀即可。
在本发明中，所述提取的温度优选为60～70℃，更优选为65～70℃；所述提取的时间优选为3～4h，更优选为3h；所述提取的次数优选为3～4次，更优选为3次。
本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域熟知的浓缩方式即可，具体为减压蒸馏。
得到浸膏后，本发明将所述浸膏依次进行调节pH值至酸性、第一萃取、调节所述第一萃取得到的有机相的pH值至碱性、第二萃取、对所述第二萃取得到的有机相进行第一硅胶柱层析和后处理，得到所述卡波林生物碱。在本发明中，所述调节pH值至酸性优选是将体系的pH值调节为2～3，更优选为2.5～3。本发明对于所述调节pH值至酸性采用的酸没有特殊限定，采用本领域熟知的酸即可，具体可为盐酸、硫酸或硝酸，优选为盐酸；所述酸的质量浓度优选为5～10wt％，更优选为5wt％。
在本发明中，所述第一萃取所用的有机溶剂优选包括酯类溶剂、醚类溶剂和卤代烷类溶剂中的一种或多种，更优选为醚类溶剂和酯类溶剂。在本发明中，当第一萃取所用的有机溶剂包括两种以上上述具体物质时，所述第一萃取包括依次在两种以上上述具体物质中进行萃取。在本发明中，所述酯类溶剂优选包括C3～6酯，更优选为甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸乙酯；所述醚类溶剂优选包括C2～6醚或石油醚，更优选为甲醚、乙醚或石油醚；所述卤代烷类溶剂优选包括C1～6卤代烷，更优选包括二氯甲烷、三氯甲烷或四氯乙烷。在本发明中，所述浸膏的质量和第一萃取采用的有机溶剂的体积比优选为1g:20～30mL，更优选为1g:20～25mL。在本发明的实施例中，所述第一萃取用有机溶剂为石油醚和乙酸乙酯；以石油醚为萃取剂进行萃取的次数为3次，以乙酸乙酯作为萃取剂进行萃取的次数为2次。
在本发明中，所述调节pH值至碱性优选是将体系的pH值调节为9～10，更优选为9.5～10。本发明对于所述调节pH值至碱性采用的碱没有特殊限定，采用本领域熟知的碱溶液即可，具体可为碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，更优选为碳酸钠溶液。在本发明中，所述碱溶液的质量浓度优选为5～10％，更优选为8～10％。
在本发明中，所述第二萃取所用的有机溶剂优选包括酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂，更优选为酯类溶剂。在本发明中，所述酯类溶剂优选包括C3～6酯，更优选为甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸乙酯，更进一步优选为乙酸乙酯；所述醚类溶剂优选包括C2～6醚或石油醚，更优选为甲醚、乙醚或石油醚；所述卤代烷类溶剂优选包括C1～6卤代烷，更优选包括二氯甲烷、三氯甲烷或四氯乙烷。在本发明中，所述浸膏的质量和第二萃取采用的有机溶剂的体积比优选为1g:20～30mL，更优选为1g:20～25mL。
在本发明中，所述第一硅胶柱层析优选为梯度洗脱方式。在本发明中，所述梯度洗脱用洗脱液为石油醚和丙酮的混合液，所述混合液中石油醚和丙酮的体积比优选为0:1～1:0。在本发明中，所述梯度洗脱优选包括依次洗脱出来的FrA、FrB、FrC、FrD和FrE五部分。
在本发明中，所述后处理包括依次进行的第二硅胶柱层析、反相色谱分离、Sephadex LH-20分离和高效液相色谱分离。在本发明中，具有式I-1、式I-2和式I-3所示结构的卡波林生物碱优选从所述FrA部分提取得到。本发明优选对FrA部分依次进行第二硅胶柱层析、反相色谱分离和Sephadex LH-20分离得到具有式I-1所示结构的卡波林生物碱；本发明优选对具有式I-1所示结构的卡波林生物碱进行高效液相色谱分离得到具有式I-2和式I-3所示结构的卡波林生物碱；本发明在高效液相色谱分离保留时间为28min处分离得到式I-2所示结构的卡波林生物碱，在高效液相色谱分离保留时间为32min处分离得到式I-3所示结构的卡波林生物碱。在本发明中，所述第二硅胶柱层析用洗脱液为石油醚和丙酮的混合溶液，所述石油醚和丙酮的体积比为1～3:1，优选为1～2:1。
在本发明中，所述反相色谱分离采用的洗脱液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为30～70％。在本发明中，所述反相色谱分离采用的色谱柱优选为C-18柱。
在本发明中，所述Sephadex LH-20分离采用的溶剂为甲醇。
本发明对于所述第二硅胶柱层析、反相色谱C-18分离和Sephadex LH-20分离的操作没有特殊限定，采用本领域常规操作方式即可。
在本发明中，所述高效液相色谱分离采用的色谱柱为CHIRALPAK AD-H，所述CHIRALPAKAD-H色谱柱的尺寸优选为10mm×250mm，型号优选为USP L51。在本发明中，所述高效液相色谱分离采用的流动相为异丙醇和正己烷的混合溶液，所述异丙醇和正己烷的混合溶液中异丙醇和正己烷的体积比为20:80；所述流动相的流速优选为2.5～3.5mL/min，更优选为3mL/min。
本发明优选对FrB部分进行第三硅胶柱层析，得到具有式Ⅱ～IV所示结构的卡波林生物碱。在本发明中，所述第三硅胶柱层析优选为梯度洗脱，所述第三硅胶柱层析用洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，所述二氯甲烷和甲醇的混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为1～20:1。
本发明优选对FrC部分进行第四硅胶柱层析，得到具有式V所示结构的卡波林生物碱。在本发明中，所述第四硅胶柱层析用洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合溶液，所述二氯甲烷和甲醇的混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比优选为1～10:1。
本发明得到的FrD部分和FrE部分中不含有生物碱，在这里不再详述具体处理过程。
本发明还提供了一种卡波林生物碱的药学上可接受的盐，包括上述技术方案所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐或具有式II～V所示结构中的任意一种的卡波林生物碱的药学上可接受的盐；
在本发明中，所述药学上可接受的盐包括有机酸盐或无机酸盐。在本发明中，所述有机酸盐优选为卡波林生物碱的酒石酸盐、卡波林生物碱的柠檬酸盐、卡波林生物碱的甲酸盐、卡波林生物碱的乙酸盐或卡波林生物碱的乙二酸盐；所述卡波林生物碱的无机酸盐优选为卡波林生物碱的盐酸盐、卡波林生物碱的氢溴酸盐、卡波林生物碱的硝酸盐或卡波林生物碱的硫酸盐。
本发明还提供了上述技术方案所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐的制备方法，包括以下步骤：
将卡波林生物碱和酸混合，进行中和反应，得到卡波林生物碱的药学上可接受的盐。
在本发明中，所述酸为有机酸或无机酸；所述有机酸优选为酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸或乙二酸；所述无机酸优选为盐酸、氢溴酸、硝酸或硫酸。在本发明中，所述酸的质量浓度优选为3～5％，更优选为4％。
在本发明中，所述卡波林生物碱和酸的摩尔比优选为1:1～1.5，更优选为1:1.2。
本发明对所述混合无特殊要求只要能够混合均匀即可。在本发明中，所述中和反应的温度优选为常温，所述常温的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃。在本发明中，所述中和反应的时间优选为55～65min，更优选为60min。在本发明中，所述中和反应优选伴随搅拌。本发明对所述搅拌无特殊要求。
本发明优选对中和反应后体系进行浓缩，得到所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐。本发明对所述浓缩的方式无特殊要求，采用本领域常规的方式即可。
本发明还提供了一种卡波林生物碱药物组合物，包括上述技术方案所述的卡波林生物碱和/或上述技术方案所述的卡波林生物碱的药学上可接受的盐。
在本发明中，所述卡波林生物碱药物组合物优选还包括可药用载体和/或赋形剂。
在本发明中，所述波林生物碱药物组合物中波林生物碱和/或其药学上可接受的盐的质量百分含量优选为0.1～99％，更优选为0.5～90％，更进一步优选为9～90％。在本发明中，所述卡波林生物碱药物组合物中药用载体和/或赋形剂的质量百分含量优选为0.5～10％，更优选为0.9～1％。
本发明对于所述药用载体或所述赋形剂没有特殊限定，采用本领域熟知的药用载体或赋形剂即可，具体可以为固体、半固体或液体稀释剂，填料或药物制品辅剂中的一种或多种。在本发明中，所述卡波林生物碱药物组合物的制剂种类优选包括液体制剂、固体制剂、喷剂或雾剂；所述液体制剂优选包括注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂或糖浆剂；所述固体制剂优选包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂或冲剂。本发明中对于所述卡波林生物碱药物组合物的制备方法没有特殊限定，采用本领域熟知的制备方法即可。
在本发明中，所述卡波林生物碱药物组合物的给药方式优选为注射、口服、舌下给药或粘膜透析；所述注射优选包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
在本发明中，所述卡波林生物碱药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所述卡波林生物碱药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所述单位体重服用量优选为0.5～20mg/kg。
本发明还提供了上述技术方案所述卡波林生物碱、具有式II～V任一项所示结构的卡波林生物碱、上述技术方案所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐或上述技术方案所述卡波林生物碱药物组合物在制备治疗神经退行性相关疾病药物中的应用。在本发明中，所述神经退行性相关疾病优选包括阿尔兹海默症(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿症、传染性海绵状脑病或肌萎缩侧索硬化症。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将33kg干燥的骆驼蓬(Peganum harmala L.)种子和100L乙醇混合后于70℃下回流提取三次，每次3h，合并三次提取得到的提取液后进行减压蒸馏回收乙醇，得到浸膏；
用质量浓度为10％的盐酸水溶液和浸膏混合调节其pH值为2～3，用石油醚萃取三次后用乙酸乙酯萃取两次，收集有机相；用质量浓度为10％的NaOH溶液调节有机相的pH值为9～10后用乙酸乙酯萃取得到87.5g卡波林生物碱有机相；对卡波林生物碱有机相进行硅胶柱层析，利用石油醚-丙酮洗脱液进行梯度洗脱依次得到得到7g FrA、6g FrB、20g FrC、25g FrD和22gFrE；
对FrA依次进行硅胶柱层析(石油醚和丙酮的体积比为3:1到1:1，v/v)、反相色谱C-18分离(以质量浓度为30：70→80：20的甲醇水溶液作为洗脱液)和Sephadex LH-20分离(以甲醇作为溶剂)得到25mg具有式Ⅰ-1所示结构的卡波林生物碱，记为HPH7；对具有式Ⅰ-1所示结构的卡波林生物碱进一步手性柱拆分(色谱柱：CHIRALPAKAD-H 5μm；10mm×250mmUSP L51，异丙醇/正己烷＝20：80，总流速：3mL/min)得到10mg具有式I-2所示结构的卡波林生物碱，记为HPH7a(收率0.011％，纯度98％，淡黄色油状，tR＝28min)和10mg具有式I-3所示结构的卡波林生物碱，记为HPH7b(收率0.011％，纯度98％，淡黄色油状，tR＝32min)；
对FrB进行硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1→1:1，v/v)，进行梯度洗脱得到4g具有式Ⅳ所示结构的卡波林生物碱，记为HPH1(收率4.571％，淡黄色结晶)，1g具有式Ⅲ所示结构的卡波林生物碱，记为HPH4(收率1.142％，白色粉末)和15mg具有式Ⅱ所示结构的卡波林生物碱，记为HPH3(收率0.017％，黄色粉末)；
对FrC进行硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇10:1→1:1，v/v)得到3.5g具有式V所示结构的卡波林生物碱，记为HPH5(收率4.000％，淡黄色结晶)。
实施例1得到的卡波林生物碱的结构表征数据：
HPH7a:淡黄色油状；23(c 0.08,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(1.01),219(0.90),344(0.53)nm；ECD(0.001M,MeOH)λmax(Δε)206(0.88),215(-0.34),265(1.93)nm；IR(KBr)vmax 3430,2923,2852,1721,1628,1461,1380,1260cm–1；ESIMS 271[M+H]+；HRESIMSm/z 271.1441(calcd for C16H18N2O2[M+H]+,271.1441).
HPH7b：-15(c 0.08,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)206(1.01),219(0.90),344(0.53)nm；ECD(0.0006M,MeOH)λmax(Δε)206(-0.26),215(1.23),265(-1.43)nm；IR(KBr)vmax 3430,2923,2852,1721,1628,1461,1380,1260cm–1；ESIMS 271[M+H]+；HRESIMS m/z271.1441(calcd for C16H18N2O2[M+H]+,271.1441).
HPH1:Harmine；黄色晶体；C13H12N2O；ESI+-MS[M+H+]:m/z 213；13C NMR(DMSO-d6,125MHz)δC 141.9(C-1,s),137.7(C-3,d),114.7(C-4,d),122.6(C-5,d),109.1(C-6,d),160.1(C-7,s),94.7(C-8,d),141.3(C-10,s),111.9(C-11,s),127.1(C-12,s),134.5(C-13,s),20.3(C-14,q),55.3(7-OMe,q)。
HPH3:Isoharmine，黄色粉末；C13H12N2O；ESI+-MS[M+H+]:m/z 213；13C NMR(methanol-d4,125MHz)：δC 147.2(C-1,s),129.6(C-3,d),117.8(C-4,d),125.2(C-5,d),159.8(C-6,s),107.5(C-7,d),101.7(C-8,d),143.6(C-10,s),118.6(C-12,s),129.1(C-13,s),130.5(C-13,s),19.8(C-14,q),55.8(6-OMe,q)。
HPH4:Vasicine，白色粉末；C11H12N2O；ESI+-MS[M+H+]:m/z 189；13C NMR(DMSO-d6,125MHz)：δC 49.6(C-1,t),29.0(C-2,t),70.6(C-3,d),163.1(C-3a,s),142.9(C-4a,s),125.7(C-5,d),128.7(C-6,d),119.0(C-7,d),126.8(C-8,d),117.8(C-8a,s),46.0(C-9,t)。
HPH5：harmaline，黄色晶体；C13H14N2O；ESI+-MS[M+H+]:m/z 215；13C NMR(CDCl3,125MHz)：δC 142.3(C-1,s),47.7(C-3,t),22.1(C-4,t),114.8(C-5,d),110.4(C-6,d),161.2(C-7,s),94.7(C-8,d),137.9(C-10,s),119.6(C-11,s),120.5(C-12,s),128.6(C-13,s),18.6(C-14,q),55.3(7-OMe,q)。
对实施例1得到的具有式Ⅰ-1所示结构的卡波林生物碱进行核磁共振检测，得到数据列于表1中
表1具有式Ⅰ-1所示结构的卡波林生物碱的NMR数据
a500MHz,Chloroform-d；b125MHz,Chloroform-d；.
由表1可知，实施例1成功制备得到具有式I-1所示结构的卡波林生物碱。
实施例2
将实施例1制备的卡波林生物碱和注射用水混合均匀，依次进行精滤、灌封灭菌，得到卡波林生物碱注射液。
实施例3
在实施例1制备的卡波林生物碱中加入物质浓度为12mol/L的盐酸(当量1:1.2)，常温搅拌反应60min,减压蒸发得到卡波林生物碱的盐酸盐。
实施例4
制备卡波林生物碱的医学上可接受的盐：
将实施例1制备的卡波林生物碱分别和质量浓度为4％的酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸反应(伴随搅拌)，分别得到卡波林生物碱的酒石酸盐、卡波林生物碱的柠檬酸盐、卡波林生物碱的甲酸盐、卡波林生物碱的乙酸盐、卡波林生物碱的乙二酸盐、卡波林生物碱的盐酸盐、卡波林生物碱的氢溴酸盐、卡波林生物碱的硝酸盐、卡波林生物碱的硫酸盐。
实施例5
将实施例1制备的卡波林生物碱溶于无菌注射用水中，搅拌至卡波林生物碱溶解，经无菌抽滤漏斗过滤和无菌精滤后分装于安瓿中，然后低温冷冻干燥后无菌熔封，得到卡波林生物碱药物组合物粉针剂。
实施例6
将实施例1制备的卡波林生物碱与赋形剂按照质量比为9:1混合均匀，进行低温冷冻干燥和灭菌，得到卡波林生物碱药物组合物粉剂。
实施例7
将实施例1制备的卡波林生物碱和赋形剂按照质量比分别为1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10混合均匀，制粒压片，得到卡波林生物碱药物组合物片剂。
实施例8
将实施例1制备的卡波林生物碱采用常规口服液的制备方法，制备得到卡波林生物碱药物组合物口服液。
实施例9
将实施例1制备的卡波林生物碱和赋形剂按照质量比为5:1混合均匀，分别采用常规的胶囊剂、颗粒剂和冲剂的制备方法，制备得到卡波林生物碱药物组合物胶囊、卡波林生物碱药物组合物颗粒剂和卡波林生物碱药物组合物冲剂。
实施例10
将实施例1制备的卡波林生物碱和赋形剂按照质量比为3:1混合均匀，分别采用常规的胶囊剂、颗粒剂和冲剂的制备方法，制备得到卡波林生物碱药物组合物胶囊、卡波林生物碱药物组合物颗粒剂和卡波林生物碱药物组合物冲剂。
实施例11
化合物的活性评价。
细胞培养和处理。
U251-APP细胞在Roswell RPMI-1640培养基中，37℃的潮湿空气下培养(空气中含有5％的CO2，湿度为95％)，培养基中含有10％的胎牛血清(Gibco-BRL，10099-141)；将细胞接种在预热的6孔培养皿中，化合物直接加入培养基(Dinaciclib作为阳性对照)，共孵育24小时。
蛋白酶联免疫吸附实验(ELISA)分析
使用商业ELISA试剂盒(Elabscience，E-EL-H0543c检测Aβ42；E-EL-H5314c检测pTau217)进行测量，具体实验方法参照ELISA试剂盒出厂商的操作说明。简要步骤如下：
1.对应板孔中加入100μL标准品工作液或样本，37℃孵育90分钟；
2.弃掉板内液体后，立即加入100μL生物素化抗体工作液，37℃孵育60分钟；
3.弃掉板内液体，洗板3次；
4.每孔加入100μL HRP酶结合物工作液，37℃孵育30分钟，弃掉板内液体，洗板5次；
5.每孔加入90μL底物溶液，37℃孵育15分钟左右；
6.每孔加入50μL终止液；
7.立即在450nm波长下读数，处理数据，得到图1和图2，其中图1为卡波林生物碱或其药学上可接受的盐化合物对Aβ42积累抑制活性评估对比图，图2为卡波林生物碱或其药学上可接受的盐化合物对pTau217抑制活性评估对比图。
由图1可以看出，卡波林生物碱HPH3、HPH7、HPH7a、HPH7b和卡波林生物碱盐酸盐HPH1·HCl、HPH5·HCl对Aβ42的积累具有显著抑制作用。由图2可以看出卡波林生物碱HPH3、HPH4、HPH7、HPH7a、HPH7b和卡波林生物碱盐酸盐HPH1·HCl、HPH5·HCl、对pTau217具有明显的抑制活性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种卡波林生物碱，其特征在于，具有式I-1、式I-2或式I-3所示结构：
2.权利要求1所述卡波林生物碱的制备方法，包括以下步骤：
将骆驼蓬种子和提取剂混合，依次进行提取和浓缩，得到浸膏；所述提取剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂；
将所述浸膏依次进行调节pH值至酸性、第一萃取、调节所述第一萃取得到的有机相的pH值至碱性、第二萃取、对所述第二萃取得到的有机相进行第一硅胶柱层析和后处理，得到所述卡波林生物碱；所述调节pH值至酸性是将体系的pH值调节为2～3；所述第一萃取所用的有机溶剂选自酯类溶剂、醚类溶剂和卤代烷类溶剂中的一种或多种；所述调节pH值至碱性是将体系的pH值调节为9～10；所述第二萃取所用的有机溶剂选自酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂；所述第一硅胶柱层析为梯度洗脱，所述梯度洗脱用洗脱液为石油醚和丙酮的混合液，所述混合液中石油醚和丙酮的体积比为0:1～1:0；所述梯度洗脱包括依次洗脱出来的FrA、FrB、FrC、FrD和FrE五部分；
所述后处理包括依次进行的第二硅胶柱层析、反相色谱分离、Sephadex LH-20分离和高效液相色谱分离；
所述第二硅胶柱层析用洗脱液为石油醚和丙酮的混合溶液，所述石油醚和丙酮的体积比为1～3:1；
所述反相色谱分离采用的洗脱液为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为30～70％；所述Sephadex LH-20分离采用的溶剂为甲醇；所述高效液相色谱分离采用的色谱柱为CHIRALPAK AD-H，所述高效液相色谱分离采用的流动相为异丙醇和正己烷的混合溶液，所述异丙醇和正己烷的混合溶液中异丙醇和正己烷的体积比为20:80；
对所述FrA部分依次进行第二硅胶柱层析、反相色谱分离和Sephadex LH-20分离得到具有式I-1所示结构的卡波林生物碱；对具有式I-1所示结构的卡波林生物碱进行高效液相色谱分离得到具有式I-2和式I-3所示结构的卡波林生物碱；在高效液相色谱分离保留时间为28min处分离得到式I-2所示结构的卡波林生物碱，在高效液相色谱分离保留时间为32min处分离得到式I-3所示结构的卡波林生物碱。
3.一种卡波林生物碱的药学上可接受的盐，其特征在于，为权利要求1所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的卡波林生物碱的药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐选自有机酸盐或无机酸盐。
5.权利要求3或4所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐的制备方法，其特在于，包括以下步骤：
将卡波林生物碱和酸混合，进行中和反应，得到卡波林生物碱的药学上可接受的盐；
所述酸为有机酸或无机酸。
6.一种卡波林生物碱药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的卡波林生物碱和/或权利要求3或4所述的卡波林生物碱的药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的卡波林生物碱药物组合物，其特征在于，还包括可药用载体和/或赋形剂。
8.权利要求1所述卡波林生物碱、权利要求3或4所述卡波林生物碱的药学上可接受的盐或权利要求6或7所述卡波林生物碱药物组合物在制备治疗神经退行性相关疾病药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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