CN116746572A - 一种皮肤干细胞专用冻存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种皮肤干细胞专用冻存液及其制备方法，属于细胞冻存复苏技术领域。包括以下组分：冷冻保护剂、生物膜保护剂和抗氧化剂；生物膜保护剂包括附子多糖、抑制剂Y‑27632、人血清白蛋白、胶原蛋白和基础细胞培养基。本发明的皮肤干细胞专用冻存液通过生物膜保护剂中的附子多糖和抑制剂Y‑27632协同作用提高生物膜疏水性和降低生物膜的流动性，使皮肤干细胞的生物膜在冷冻和复苏的过程中受到冰晶的损伤减到最低，显著提高皮肤干细胞在复苏后的细胞活率。本发明的皮肤干细胞专用冻存液使用简便、复苏率高、皮肤干细胞质量维持效果好，在皮肤干细胞冻存以及移植、转染等领域有着广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于干细胞冻存复苏技术领域，涉及一种皮肤干细胞专用冻存液及其制备方法。
背景技术
干细胞是具有自我复制和多向分化能力的细胞，可以不断地自我更新，并在特定条件下分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞，可使组织恢复再生能力，修复其功能。研究者在人皮肤真皮下发现一种新的成体干细胞，将其命名为皮肤干细胞。
皮肤干细胞具有强大的自我更新能力，在体外培养时呈克隆性生长。通常情况下，皮肤干细胞通过不对称分裂产生一个子代干细胞和一个定向祖细胞即短暂增殖细胞。子代干细胞具有高度的增殖潜能，但分化较慢。短暂增殖细胞增殖潜能有限，但可不断增加分化细胞数量，产生终末分化细胞。表皮干细胞及其产生的短暂增殖细胞、终末分化细胞构成一个表皮增殖单位，分布在表皮不同的空间。表皮更新时，由基底层表皮干细胞分化产生的短暂增殖细胞失去对基底膜的黏附，向上迁移，最后经过一系列生物化学和形态学变化，达到表皮最外层，形成角质化表皮细胞，角质化表皮细胞最终脱落为皮屑。表皮受到外来损伤时，还可通过对称分裂产生两个干细胞或两个祖细胞，增加干细胞或分化细胞的数量，从而更好地适应机体的需要。
随着现代医学的深入发展，皮肤干细胞干预疗法的应用越来越广，简单地说，就是当皮肤出现衰老松弛、皱纹增多等现象时或者受到损伤而又因为年龄原因导致机体修复能力变弱修复速度变慢时，为皮肤补充相应的皮肤干细胞，通过利用皮肤干细胞强大的自我更新能力来达到延缓皮肤衰老或是治疗皮肤疾病的目的。
目前，皮肤干细胞在临床上可以用于治疗几种皮肤病包括系统性硬化症，系统性红斑狼疮，硬化粘液水肿、脱发、默克尔细胞癌、寻常性天疱疮、银屑病、伤口愈合以及医美领域。
但目前现有的干细胞冻存液如间充质干细胞冻存液或人多能干细胞冻存液，二者冻存对象均为多能干细胞，而皮肤干细胞属于专能干细胞，它们之间结构形态特性存在一定差异，所以现有的干细胞冻存液如间充质干细胞冻存液或人多能干细胞冻存液在用于皮肤干细胞冻存时容易导致复苏后其细胞活率较低，细胞形态尤其是细胞生物膜受到冻存时冰晶的一定程度的影响，导致后续皮肤干细胞的使用效果不理想。因此开发能够满足临床应用和工业生产关键质量属性需求的皮肤干细胞专用冻存液和制备方法迫在眉睫。
专利CN109644981A公开了一种间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法。其中，所述冻存液由配合使用的A液和B液组成；所述A液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基70-80％；PSG1-2％；FBS20-30％；β-巯基乙醇0.1-0.3％；所述B液按照体积百分比计算，包括如下成分：DMEM培养基78-80％；PSG 1-2％；DMSO20％。该冻存液使用时可以避免含DMSO的冻存液直接混匀细胞沉淀，缩短二甲基亚砜与细胞的接触时间，降低其对于细胞的毒性，从而有效的提高细胞冻存后，细胞复苏时的得率和存活率。该发明公开了DMEM培养基、β-巯基乙醇、DMSO成分，其技术效果是提高细胞存活率。
专利CN115974081A公开了一种NK细胞冻存液及其制备方法和应用，所述NK细胞冻存液包括人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12、氯化钠和水。本发明创造性地发现使用人血白蛋白、聚乙二醇、二甲基亚砜、右旋糖酐、维生素B12和氯化钠组成的NK细胞冻存液冻存细胞，可以提高细胞的存活率，减少NK细胞在冻存复苏过程中受到的伤害，且细胞复苏后具有良好增殖和杀伤能力。该专利公开了人血白蛋白、二甲基亚砜成分，其技术效果是提高复苏后细胞的增殖和杀伤能力。
专利CN114794088A公开了一种人多能干细胞冻存液，包括基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物，所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR 99021，ID 8和Y27632，且人多能干细胞冻存液不含有任何蛋白质成分。本发明的人多能干细胞冻存液，通过3种信号通路抑制剂的协同作用，在不含有蛋白质成分的情况下，冻存细胞后复苏，具有较高的复苏后细胞活率。此外，本发明的人多能干细胞冻存液冻存时不需要程序性降温，更加快速简便。本发明的人多能干细胞冻存液质量研究充分，产品性能高，成本低廉，适用于不同培养基。该发明公开了抑制剂Y-27632成分，其技术效果是提高复苏后的细胞活率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皮肤干细胞专用冻存液及其制备方法，皮肤干细胞专用冻存液包括以下组分：冷冻保护剂、生物膜保护剂和抗氧化剂；生物膜保护剂包括附子多糖、抑制剂Y-27632、人血清白蛋白、胶原蛋白和基础细胞培养基，附子多糖在冻存液中的浓度为22~88mg/L，抑制剂Y-27632占冻存液的体积百分比为0.002~0.008%，人血清白蛋白在冻存液中的浓度为2~4g/L，胶原蛋白在冻存液中的浓度为150~250mg/L；冷冻保护剂包括二甲基亚砜和基础细胞培养基，二甲基亚砜占冻存液的体积百分比为5~10%；抗氧化剂包括巯基乙醇、维生素C和基础细胞培养基，巯基乙醇占冻存液的体积百分比为0.05~0.1%，维生素C在冻存液中的浓度为9~35mg/L；所述基础细胞培养基均为DMEM/F12培养基。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种皮肤干细胞专用冻存液，包括以下组分：
冷冻保护剂、生物膜保护剂和抗氧化剂；
所述生物膜保护剂包括附子多糖、抑制剂Y-27632、人血清白蛋白、胶原蛋白和基础细胞培养基，所述抗氧化剂包括巯基乙醇、维生素C和基础细胞培养基，所述冷冻保护剂包括二甲基亚砜和基础细胞培养基，所述基础细胞培养基为DMEM/F12培养基；
所述附子多糖在冻存液中的浓度为22~88mg/L，抑制剂Y-27632占冻存液的体积百分比为0.002~0.008%，人血清白蛋白在冻存液中的浓度为2~4g/L，胶原蛋白在冻存液中的浓度为150~250mg/L，所述巯基乙醇占冻存液的体积百分比为0.05~0.1%，维生素C在冻存液中的浓度为9~35mg/L，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分比为5~10%；
将附子多糖、抑制剂Y-27632、人血清白蛋白、胶原蛋白以及DMEM/F12培养基混合，搅拌，过滤除菌，得到生物膜保护剂；将巯基乙醇、维生素C以及DMEM/F12培养基混合，搅拌，过滤除菌，得到抗氧化剂；将二甲基亚砜以及DMEM/F12培养基混合，搅拌，过滤除菌，得到冷冻保护剂；将生物膜保护剂、抗氧化剂、冷冻保护剂分别封装，置于4℃冰箱储存。
作为本发明的一种优选技术方案，所述附子多糖在冻存液中的浓度为44~66mg/L，抑制剂Y-27632在冻存液中的浓度为1.6~6.4mg/L，人血清白蛋白在冻存液中的浓度为2.8~3.6g/L，胶原蛋白在冻存液中的浓度为175~225mg/L。
作为本发明的一种优选技术方案，所述巯基乙醇占冻存液的体积百分比为0.075~0.1%，维生素C在冻存液中的浓度为18~27mg/L。
作为本发明的一种优选技术方案，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分比为7~9%。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的搅拌是指将混合液置于磁力搅拌器进行搅拌。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的搅拌中磁力搅拌器的转速为35r/min。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的搅拌中磁力搅拌器的搅拌时间为8分钟。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的过滤是指用孔径为0.2~0.3μm的滤器进行过滤除菌。
本发明的有益效果：
（1）本发明中的生物膜保护剂由附子多糖、抑制剂Y-27632、人血清白蛋白、胶原蛋白和基础细胞培养基组成，开创性地发现使用含有附子多糖与抑制剂Y-27632的生物膜保护剂可以有效降低冻存时冰晶对皮肤干细胞生物膜的损伤，大大提高复苏后的细胞活率。
（2）本发明为皮肤干细胞专用冻存液，解决了现有冻存液用于冻存皮肤干细胞时的一些弊端，填补了目前干细胞冻存复苏技术领域专用于皮肤干细胞冻存方面的空白。
（3）本发明质量研究充分、冻存效果好、稳定性好，使用本发明皮肤干细胞专用冻存液可在液氮条件下稳定冻存皮肤干细胞长达48个月。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下。
实施例1
皮肤干细胞专用冻存液各组分含量如下：
附子多糖44mg/L，抑制剂Y-27632 3.2mg/L，人血清白蛋白3g/L，胶原蛋白175mg/L，巯基乙醇0.08%，维生素C 13mg/L，二甲基亚砜7%。
皮肤干细胞专用冻存液配制方法如下：
以总体积1000ml为例，
（1）将44mg附子多糖、3.2mg抑制剂Y-27632、3g人血清白蛋白、175mg胶原蛋白以及350ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到生物膜保护剂；
（2）将0.8ml巯基乙醇、13mg维生素C以及250ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到抗氧化剂；
（3）将70ml二甲基亚砜以及250ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到冷冻保护剂；
（4）将生物膜保护剂、抗氧化剂、冷冻保护剂分别封装，置于4℃冰箱储存；
（5）用上述皮肤干细胞专用冻存液对皮肤干细胞进行冻存复苏操作，并记录其复苏后的细胞活率。
实施例2
皮肤干细胞专用冻存液配制方法如下：
以总体积1000ml为例，
（1）将66mg附子多糖、4.8mg抑制剂Y-27632、3.2g人血清白蛋白、200mg胶原蛋白以及330ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到生物膜保护剂；
（2）将0.9ml巯基乙醇、22mg维生素C以及250ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到抗氧化剂；
（3）将80ml二甲基亚砜以及250ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到冷冻保护剂；
（4）将生物膜保护剂、抗氧化剂、冷冻保护剂分别封装，置于4℃冰箱储存；
（5）用上述皮肤干细胞专用冻存液对皮肤干细胞进行冻存复苏操作，并记录其复苏后的细胞活率。
实施例3
皮肤干细胞专用冻存液配制方法如下：
以总体积1000ml为例，
（1）将88mg附子多糖、6.4mg抑制剂Y-27632、4g人血清白蛋白、250mg胶原蛋白以及300ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到生物膜保护剂；
（2）将1ml巯基乙醇、35mg维生素C以及250ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到抗氧化剂；
（3）将100ml二甲基亚砜以及250ml DMEM/F12培养基混合，置于磁力搅拌器设置转速为35r/min，搅拌时间为8min进行搅拌，使用孔径为0.2μm的滤器过滤除菌，得到冷冻保护剂；
（4）将生物膜保护剂、抗氧化剂、冷冻保护剂分别封装，置于4℃冰箱储存；
（5）用上述皮肤干细胞专用冻存液对皮肤干细胞进行冻存复苏操作，并记录其复苏后的细胞活率。
对比例1
不添加附子多糖，抑制剂Y-27632的添加量调整为70.8mg，其余配置及操作方法参照实施例2。
对比例2
不添加抑制剂Y-27632，附子多糖的添加量调整为70.8mg，其余配置及操作方法参照实施例2。
对比例3
不添加抑制剂Y-27632、附子多糖，其余配置及操作方法参照实施例2。
对比例4
以未冻存的相同代次皮肤干细胞为对照细胞，以冻存复苏后的皮肤干细胞为受试细胞并冻存12个月后进行复苏，按照本发明中实施例1~3的实验方法在复苏后传代1次、传代2次、传代3次、传代5次和传代5次进行活细胞计数，计算细胞群体倍增时间。
其中实施例1~3和对比例1~3中对皮肤干细胞进行冻存复苏操作后细胞活率记录如下表1所示，从表中可以明显看出，利用本发明提供的皮肤干细胞专用冻存液独特的配方设计组合获得了更佳的冻存复苏效果，实施例1~3的皮肤干细胞在分别冻存了6、12、24、36、48个月再进行复苏后的细胞存活率均能保持在80%以上，其中实施例2中的细胞活率最高，在冻存了48个月复苏后的细胞活率依然能够保持在88%，冻存复苏效果最好，达到了本发明的预期目的；对比例1~3的皮肤干细胞在仅冻存6个月复苏后其细胞活率均低于80%，在冻存36个月复苏后其细胞活率均低于50%，冻存复苏效果明显差于实施例1~3。上述实验充分表明附子多糖和抑制剂Y-27632可以通过协同作用显著提高皮肤干细胞冻存复苏后的细胞活率。
使用配对t检验对表2数据进行统计学分析，使用实施例1~3冻存皮肤干细胞，复苏后细胞群体倍增时间与未冻存的皮肤干细胞无显著差异，可长期体外扩增。
表1 冻存复苏后细胞活率记录结果
| 细胞活率（%）实验组 | 6个月 | 12个月 | 24个月 | 36个月 | 48个月 |
| 实施例1 | 95.5 | 94.4 | 92.3 | 89.1 | 85.4 |
| 实施例2 | 96.3 | 95.7 | 93.6 | 91.4 | 88.1 |
| 实施例3 | 95.1 | 93.2 | 90.4 | 86.2 | 82.7 |
| 对比例1 | 84.4 | 78.2 | 69.2 | 56.4 | 48.9 |
| 对比例2 | 84.8 | 78.4 | 69.6 | 56.9 | 49.8 |
| 对比例3 | 70.2 | 64.2 | 52.8 | 41.5 | 29.9 |
表2 冻存12个月复苏后多次传代后皮肤干细胞的细胞群体倍增时间
| 倍增时间（h）实验组 | 复苏后传代1次 | 复苏后传代2次 | 复苏后传代3次 | 复苏后传代4次 | 复苏后传代5次 |
| 对照组 | 23.4 | 21.1 | 20.4 | 19.7 | 19.1 |
| 实施例1 | 24.6 | 22.4 | 21.7 | 21.1 | 20.7 |
| 实施例2 | 23.8 | 21.9 | 20.8 | 20.1 | 19.5 |
| 实施例3 | 25.2 | 23.6 | 22.2 | 21.8 | 21.2 |
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种皮肤干细胞专用冻存液，其特征在于，所述皮肤干细胞专用冻存液包括以下组分：冷冻保护剂、生物膜保护剂和抗氧化剂；所述生物膜保护剂包括附子多糖、抑制剂Y-27632、人血清白蛋白、胶原蛋白和基础细胞培养基，所述附子多糖在冻存液中的浓度为22~88mg/L，所述抑制剂Y-27632在冻存液中的浓度为1.6~6.4mg/L，所述人血清白蛋白在冻存液中的浓度为2~4g/L，所述胶原蛋白在冻存液中浓度为150~250mg/L。
2.根据权利要求1所述的皮肤干细胞专用冻存液，其特征在于，所述附子多糖在冻存液中的浓度为44~66mg/L，所述抑制剂Y-27632在冻存液中的浓度为3.2~4.8mg/L，所述人血清白蛋白在冻存液中的浓度为2.8~3.6g/L，所述胶原蛋白在冻存液中浓度为175~225mg/L。
3.根据权利要求1所述的皮肤干细胞专用冻存液，其特征在于，所述抗氧化剂包括巯基乙醇、维生素C和基础细胞培养基，所述巯基乙醇占冻存液的体积百分比为0.05~0.1%，所述维生素C在冻存液中浓度为9~35mg/L。
4.根据权利要求3所述的皮肤干细胞专用冻存液，其特征在于，所述巯基乙醇占冻存液的体积百分比为0.075~0.1%，所述维生素C在冻存液中的浓度为18~27mg/L。
5.根据权利要求3所述的皮肤干细胞专用冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂包括二甲基亚砜和基础细胞培养基，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分比为5~10%。
6.根据权利要求5所述的皮肤干细胞专用冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分比为7~9%。
7.根据权利要求5所述的皮肤干细胞专用冻存液，其特征在于，所述基础细胞培养基为DMEM/F12培养基。
8.一种如权利要求7所述的皮肤干细胞专用冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将附子多糖、抑制剂Y-27632、人血清白蛋白、胶原蛋白以及DMEM/F12培养基混合，搅拌，过滤除菌，得到生物膜保护剂；
（2）将巯基乙醇、维生素C以及DMEM/F12培养基混合，搅拌，过滤除菌，得到抗氧化剂；
（3）将二甲基亚砜以及DMEM/F12培养基混合，搅拌，过滤除菌，得到冷冻保护剂；
（4）将生物膜保护剂、抗氧化剂、冷冻保护剂分别封装，置于4℃冰箱储存。
9.根据权利要求8所述的皮肤干细胞专用冻存液的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和（3）中的搅拌是指置于磁力搅拌器中搅拌5~10min，转速为20~40r/min。
10.根据权利要求8所述的皮肤干细胞专用冻存液的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和（3）中的过滤除菌是指用孔径为0.2~0.3μm的滤器进行过滤除菌。
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