CN116735884A - 检测pla2r抗体的试纸条、检测卡及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测PLA2R抗体的试纸条、检测卡及制备方法,其特征在于:所述PLA2R抗体试纸条包括底板以及在所述底板长度方向上依次搭接的样本垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上划有检测线和封闭液线,所述检测线包被抗人IgG抗体,所述封闭液线包被PLA2R‑蛋白时间分辨荧光微球偶联物,所述封闭液线相对于所述检测线更接近于所述样本垫。本发明将PLA2R‑蛋白时间分辨荧光微球偶联物划线在硝酸纤维素膜上,检测时间可缩短至5min,变异系数CV值可控制在7%以内。此外,本发明不必使用结合物垫,节省成本,提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测领域,具体涉及一种PLA2R(磷脂酶A2受体)抗体定量检测试纸条、检测卡及制备方法。
背景技术
膜性肾病常规诊断方法包括临床表现、肾脏穿刺术的组织学检查或肾组织电镜检查。研究发现特发性膜性肾病的自身免疫实质是自身抗体与PLA2R反应的结果,已经确认了PLA2R是自身抗体的主要靶抗原。
目前报道的抗PLA2R抗体检测技术主要有免疫印迹法、间接免疫荧光法和时间分辨荧光法。免疫印迹法耗时较久,灵敏度、特异性相对较低,仍处于实验室阶段。间接免疫荧光法只能定性不能定量;ELISA法重复性差,容易出现假阳。化学发光法所需的检测仪器价格昂贵;这些方法都不适合临床快速诊断。相对于以上方法,时间分辨荧光法具有定量、便捷的优点。已有公司完成这种方法的开发,但都是采取将时间分辨荧光微球偶联物喷涂在结合垫上的方式,这种方式由于喷金仪器限制,重复性较差。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
为了提高PLA2R抗体检测的灵敏度、特异性,能够定量检测且试剂成本低,简单,操作简便的方法,本发明提供一种抗PLA2R抗体检测卡及制作、检测方法。
根据本发明的一个方面,提供了一种检测PLA2R抗体的试纸条,所述PLA2R抗体试纸条包括底板以及在所述底板长度方向上依次搭接的样本垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上划有检测线和封闭液线,所述检测线包被抗人IgG抗体,所述封闭液线包被PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物,所述封闭液线相对于所述检测线更接近于所述样本垫。所述硝酸纤维素膜上还设有质控线,所述质控线包被PLA2R抗体,并且所述质控线相对于所述检测线更接近于所述吸水垫。
所述试纸条的宽度可为3.0-4.0mm。
所述吸水纸、所述样本垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫之间相邻部位部分重叠区域的重叠长度为1-5mm。所述吸水可纸搭接在所述硝酸纤维素包被膜上侧。
所述底板可为聚苯乙烯构件、聚氯乙烯构件或者聚乙烯构件。所述样品垫可为表面活性剂和阻断剂的缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
根据本发明的另一个方面,提供了一种检测PLA2R抗体的检测卡,包括所述试纸条以及包覆所述试纸条的外壳;所述外壳进一步包括底座和卡盖,所述卡盖上设置有观察口和加样口,所述加样口开口于所述样品垫上部,以露出部分或全部所述样品垫区域;所述观察口开口于所述硝酸纤维素膜上侧,以露出全部所述检测带和所述质控带。所述卡盖和所述底座分别为塑料上壳和塑料下壳,所述塑料上壳扣合所述塑料下壳上后形成卡壳。
根据本发明的第三个方面,提供了一种PLA2R抗体检测卡的制作方法,包括以下步骤:
a.在硝酸纤维素膜上从上至下划PLA2R抗体构成的C线、抗人IgG抗体构成的T线、封闭液线并烘干;
b.在所述封闭液划线的同一位置划线PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物并干燥;
c.将样品垫搭接在所述硝酸纤维素膜靠近封闭液线的底端,之后粘贴在底板上。
所述封闭液包含:50-200mM的HEPES、0.5-2%的BSA、1-5%的蔗糖和0.5-2%的PVP-K30。
所述C、T线划线浓度为1-2mg/ml,所述封闭液划线浓度为2.5-3.5mg/ml。优选地,所述封闭液划线浓度为2.5mg/ml。
所述PLA2R蛋白时间分辨荧光微球偶联物划线浓度低于所述封闭液划线浓度。
步骤a中烘干时间是0.5-2小时。优选地,步骤a中烘干时间是1小时。
不同于传统的技术方案中将量子点偶联的PLA2R喷涂在结合垫上,本发明将PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物划在硝酸纤维素膜上,避免了因为喷金导致的误差,优化了精密度。本发明试纸条,检测时间可缩短至5min,变异系数CV值可控制在7%以内。此外,本发明不必使用结合物垫,节省成本,提高了生产效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明试剂条的结构示意图;
图2是本发明检测卡的结构示意图。
附图标记:1.样品垫 2.硝酸纤维素膜 3.底板 4.吸水垫 5.封闭液线
6.检测线 7.质控线 8.卡盖 9.底座 10.加样口 11.观察口
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
本发明使用的化学品和设备等信息如表1所示:
表1试剂和设备信息
本发明使用的各种试剂配方如下:
MES反应液:10-100mM的MES,pH 4-7
HEPES反应液:10-100mM的HEPES,pH 6-8
荧光微球保存液:10-100mM的HEPES,含1-10%BSA、1-10%蔗糖、0.1-5%PVPK30,pH 6.0-8.0
包被液:20-200mM的HEPES,含1-10%蔗糖、1-10%海藻糖、0.04-0.2%的Procline-300,pH 6.0-8.0
封闭液:50-200mM HEPES,0.5-2%BSA,1-5%蔗糖,0.5-2%PVP-K30。
如图1所示,本发明检测PLA2R抗体的试纸条包括底板3以及在所述底板长度方向上依次搭接的样本垫1、硝酸纤维素膜2和吸水垫4;所述硝酸纤维素膜上划有封闭液线5、检测线6和质控线7,所述检测线6包被抗人IgG抗体,所述封闭液线5包被PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物,所述封闭液线7相对于所述检测线6更接近于所述样本垫。所述硝酸纤维素膜上还设有质控线7,所述质控线包被PLA2R抗体,并且所述质控线7相对于所述检测线6更接近于所述吸水垫4。
如图2所示,本发明的检测PLA2R抗体的检测卡,包括所述试纸条以及包覆所述试纸条的外壳;所述外壳进一步包括底座9和卡盖8,所述卡盖上设置有观察口11和加样口10,所述加样口10开口于所述样品垫1上部,以露出部分或全部所述样品垫区域;所述观察口11开口于所述硝酸纤维素膜2上侧,以露出全部检测线6和质控线7。所述卡盖8和底座9分别塑料上壳和塑料下壳,所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
本发明检测PLA2R抗体的检测卡制备方法如下:
实施例1制备试剂条和检测卡
一、制作包被板
1、将吸水纸及NC膜(硝酸纤维素膜)粘在PVC背板上,粘贴好的NC膜置于温度15-25℃,湿度45-65%环境中平衡1h。
2、配制包被工作液,用包被溶液将PLA2R抗体(C线)和抗人IgG抗体(T线)稀释至0.5-1mg/mL备用。
3、配制封闭液。
对封闭液的配方进行了优化,分别加入不同浓度的PVP-K30,实验结果如表2所示。可以看到加入0.5%-2%的PVP-K30后重复性都得到了优化,2%的PVP-K30结果最优。确定封闭液最终配方为:50-200mM HEPES,0.5-2%BSA,1-5%蔗糖,0.5-2%的PVP-K30。
表2含不同浓度的PVP-K30的封闭液的CV值
4、NC膜从上至下排列为C线、T线、封闭液线。将C线(质控线)放入1#泵吸样端,T线(检测线)放入2#泵吸样端,封闭液放入3#泵吸样端,封闭液距离T线5mm,吸液后进行划线。C、T线划线浓度为1-2mg/ml。
对封闭液划线浓度进行优化,不同浓度封闭液浓度优化结果如表3所示。封闭液划线浓度优选2.5mg/ml。
表3封闭液不同划线浓度的CV值
5、烘干:划线完成后置于37℃干燥箱1h,干燥完成后放入铝箔袋中干燥密封备用。烘干时间优化结果如表4所示。由表4可知,封闭液烘干0.5h重复性结果相较于1h和2h较差,时间较短不能充分烘干。烘干1h和2h的结果相近,考虑到长时间高温对封闭液中蛋白的影响以及时间成本,认为1h为最优选。
表4封闭液不同烘干时间的CV值
二、制作PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物
1、活化:在MES反应液体系中加入EDC、NHS和时间分辨荧光微球,在恒温摇床上反应30min。(注:全程避光)
2、清洗:4℃,14000rpm离心30min,去除上清,加入HEPES反应液复溶。
3、偶联:加入PLA2R蛋白,混匀,在恒温摇床上反应3h。
4、封闭:加入20%BSA进行封闭,恒温摇床中反应1h。
5、清洗:4℃,14000rpm离心30min,去除上清。
6、重悬:加入荧光微球保存液重悬,用移液器吹打混匀,再使用细胞破碎仪冰浴超声,功率10%,时间10min。
7、划线:将上述备用的已划线包被板取出,在与封闭液划线的同一位置划PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物,从而有利于荧光微球附着在NC膜上的再释放。划线量需低于封闭液划线量,以便荧光微球完全附着在封闭液处理过的膜上,否则荧光微球在膜上的附着面积就会超过封闭液的处理面积,影响实验结果的准确性。
8、干燥:划线完成后置于37℃干燥箱18-20h,干燥完成后放入铝箔袋中干燥密封备用。
三、组装
1、试剂条组装:将样品垫、吸水垫依次搭接在硝酸纤维素膜底端,粘贴在PVC底板上,组成试剂条。
2、试剂条切割:切割宽度为3.0-4.0mm。
3、装条:将切好的试纸条放入塑料下壳的卡槽中,盖上塑料上壳。
4、压壳:放置压壳机中间位置进行压壳,制成检测卡。
实施例2检测卡检测
使用荧光分析仪检测PLA2R抗体浓度,步骤为:
1、用试剂盒上的标定芯片标定荧光分析仪。
2、取4ul血清/血浆样本加入样品缓冲液混匀,加入实施例1制备的试剂板的加样孔。
3、5分钟后放入荧光分析仪,读取PLA2R抗体浓度值。
一、对上述试剂盒分别进行精密性检测、准确性检测,来判定该试剂盒的精度和准确性,并与CN104880560A公开的方法进行了对比。
1、临界值的确定:共检测235份正常人血清,抗PLA2R抗体浓度的平均值为11.5RU/mL,标准差为2.1RU/mL,以平均值加3倍标准差之和为临界值,则临界值为17.8RU/mL。
2、精密性检测:通过使用欧蒙医学诊断(中国)有限公司的抗磷脂酶A2受体抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法),注册证编号:国械注进20142405768,对样本进行浓度测定,选取低值、高值共6份样本作为质控血清,在同次试验内每份重复测定10次,分别计算平均值、标准差,计算试验内变异系数CV(%);每天测定一次,连续测定10天,计算试验间CV(%),计算公式为:CV(%)=标准差/平均值*100%
表5列出了实施例与对比例的CV值结果,从表5可以看出,本发明的试剂板在各个检测浓度的CV值显著低于对比例CN104880560A。
表5本发明的方法(实施例)和对比例(CN104880560A)方法检测的CV值
3、准确性检测:
选择抗PLA2R抗体浓度分别为28RU/mL和314RU/mL的两份血清,分别以1∶1、1∶5,5∶1的比例混合,得到三份浓度不同的血清,理论值分别为75.7RU/mL、171RU/mL和266.3RU/mL,回收率计算公式为:回收率(%)=测试值/理论值*100%
表6为本发明回收率计算结果,从表6可以看出,本发明试剂板回收率较高且未超过100%,说明本试剂条检测结果稳定可靠。
表6本发明试剂板的回收率
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种PLA2R抗体检测卡的制作方法,包括以下步骤:
a.在硝酸纤维素膜上从上至下划PLA2R抗体构成的C线、抗人IgG抗体构成的T线、封闭液线并烘干;
b.在所述封闭液划线的同一位置划线PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物并干燥;
c.将样品垫搭接在所述硝酸纤维素膜靠近所述封闭液线的底端,之后粘贴在底板上。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述封闭液包含:50-200mM的HEPES、0.5-2%的BSA、1-5%的蔗糖和0.5-2%的PVP-K30。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述C、T线划线浓度为1-2mg/ml,所述封闭液划线浓度为2.5-3.5mg/ml。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述封闭液划线浓度为2.5mg/ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其中,所述PLA2R蛋白时间分辨荧光微球偶联物划线浓度低于所述封闭液划线浓度。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其中,步骤a中烘干时间是0.5-2小时。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其中,步骤a中烘干时间是1小时。
8.一种检测PLA2R抗体的试纸条,所述PLA2R抗体试纸条包括底板以及在所述底板长度方向上依次搭接的样本垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上划有封闭液线、检测线和质控线,所述检测线包被抗人IgG抗体,所述质控线包被PLA2R抗体,所述封闭液线包被PLA2R-蛋白时间分辨荧光微球偶联物,所述封闭液线相对于所述检测线更接近于所述样本垫,所述质控线相对于所述检测线更接近于所述吸水垫。
9.根据权利要求8所述的试纸条,所述C、T线划线浓度为1-2mg/ml,所述封闭液划线浓度为2.5-3.5mg/ml。
10.一种检测PLA2R抗体的检测卡,其特征在于:包括权利要求8或9所述的试纸条以及包覆所述试纸条的外壳;所述外壳进一步包括底座和卡盖,所述卡盖上设置有观察口和加样口,所述加样口开口于所述样品垫上部,以露出部分或全部所述样品垫区域;所述观察口开口于所述硝酸纤维素膜上侧,以露出全部所述检测带和所述质控带。
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CN117434276A (zh) * | 2023-12-12 | 2024-01-23 | 南京羿检医学科技有限公司 | 一种thsd7a抗体检测试剂盒及其用途 |
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- 2023-05-19 CN CN202310566802.8A patent/CN116735884A/zh active Pending
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