CN116732069A - 酸性α-葡萄糖苷酶变体及其用途 - Google Patents

酸性α-葡萄糖苷酶变体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酸性α‑葡萄糖苷酶变体及其用途。所述变体是序列优化过的和/或被连接到异源信号肽。

Description

酸性α-葡萄糖苷酶变体及其用途
本申请是国际申请日2017年9月12日、国际申请号PCT/EP2017/072942于2019年3月7日进入中国国家阶段、申请号201780055025.3、发明名称“酸性α-葡萄糖苷酶变体及其用途”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及酸性α-葡萄糖苷酶的变体及其用途。所述变体是序列优化过的和/或被连接到异源信号肽。
背景技术
庞贝氏病(Pompe disease)，也被称为II型糖原贮积病(GSD)和酸性麦芽糖酶缺乏症，是一种由溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的缺乏引起的常染色体隐性代谢性肌病。GAA是一种外切-1,4和1,6-α-葡萄糖苷酶，其在溶酶体中将糖原水解成葡萄糖。GAA的缺乏导致溶酶体中糖原积累，并引起呼吸肌、心肌和骨骼肌的渐进性损伤。所述疾病的范围从通常在1-2岁之前致死的快速发展的婴儿期过程，到在儿童和成年人中引起显著发病和早期死亡的发展更慢的非均相过程。Hirschhorn RR，遗传病的代谢和分子基础(The Metabolicand Molecular Bases of Inherited Disease),3:3389-3420(2001,McGraw-Hill)；Vander Ploeg和Reuser，Lancet 372:1342-1351(2008)。
当前用于治疗庞贝氏病的人类疗法包括给药重组人类GAA，也被称为酶替代疗法(ERT)。已证实ERT对严重的婴儿期GSD II有效。然而，酶疗法的益处受到需要频繁输注和产生针对重组hGAA的抑制性抗体的限制(Amalfitano,A.等，(2001)Genet.In Med.3:132-138)。此外，ERT不能高效地校正整个身体，可能是由于所述蛋白质在外周静脉递送后的不良生物分配、几种组织摄入的不足和高免疫原性的组合。
作为ERT的可替选或附属方案，研究了基因治疗方法治疗GSD-II的可行性。(Amalfitano,A.等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8861-8866；Ding,E.等，(2002)Mol.Ther.5:436-446；Fraites,T.J.等，(2002)Mol.Ther.5:571-578；Tsujino,S.等，(1998)Hum.Gene Ther.9:1609-1616)。然而，用于校正遗传缺陷的肌肉定向基因转移必须面对疾病的系统性本质和转入基因的肌肉表达与其他组织相比倾向于免疫原性更高这一事实的限制。
Doerfler等，2016公开了编码人类密码子优化的GAA的两种构建物的组合给药，一种构建物在肝特异性启动子的控制之下，另一种在肌肉特异性启动子的控制之下。肝特异性启动子驱动的GAA表达被用于在Gaa-/-小鼠模型中促进对GAA的免疫耐受性，而肌肉特异性启动子驱动的GAA表达在疗法所靶向的一部分组织中提供治疗性蛋白的表达。然而，这种策略不完全令人满意，因为它需要使用多个构建物，并且它不产生GAA的全身性表达。
过去已提出使用修饰的GAA蛋白来改进溶酶体贮积病治疗。具体来说，申请WO2004064750和Sun等，2006，公开了一种包含可操作连接到GAA的信号肽的嵌合GAA多肽，作为提高所述蛋白质向分泌途径的靶向的一种方式。
然而，患者可用的疗法并不完全令人满意，并且在本领域中仍需要改进的GAA多肽和GAA生产。具体来说，对使用GAA的治疗的长期功效、高水平的GAA生产、对产生的GAA多肽的提高的免疫耐受性和GAA被需要它的细胞和组织的增加的摄取，仍存在着需求。此外，在WO2004064750和Sun等，2006中，其中公开的嵌合GAA多肽的组织分布不完全令人满意。因此，对允许在如果不是全部也是大多数目标组织中校正糖原积累的全面治疗性GAA多肽，仍存在需求。
发明内容
本发明涉及GAA变体，其与野生型GAA蛋白相比以更高的水平表达和分泌，引发对全身范围的糖原病理性积累的改进的校正，并引起对GAA的免疫耐受性的诱导。
根据一个方面，本发明涉及一种核酸分子，其包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，并编码功能性GAA多肽。在这一方面的特定实施方式中，所述核酸分子包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中示出的核苷酸序列。
根据另一个方面，本发明提供了一种编码嵌合GAA多肽的核酸分子，其中所述GAA蛋白的内源信号肽用人类α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)蛋白的信号肽代替。因此，所述核酸分子编码包含融合到功能性GAA多肽的hAAT信号肽的嵌合GAA多肽。所编码的嵌合多肽是功能性GAA蛋白，其中对应于GAA的天然信号肽的氨基酸序列被所述hAAT信号肽的氨基酸序列代替。在特定实施方式中，本发明的核酸分子编码一种嵌合多肽，其是一种功能形式的GAA多肽，包含与天然GAA信号肽不同的信号肽即hAAT信号肽，并在其N-端末端处融合在所述信号肽上。根据特定实施方式，本发明的核酸分子包含编码SEQ ID NO：4的hAAT信号肽的氨基酸序列的核苷酸序列。在其他实施方式中，所述GAA编码序列是针对转入基因的体内表达优化过的序列。
另一方面，本发明提供了一种包含本发明的核酸分子的核酸构建物。本发明的核酸构建物可以是表达盒。所述表达盒可以包含可操作连接到一个或多个调控序列例如启动子、内含子、多腺苷化信号和/或增强子(例如顺式调控基序或CRM)的本发明的核酸分子。示例性的启动子包括肝特异性启动子例如选自α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、甲状腺素运载蛋白启动子、白蛋白启动子和甲状腺素结合性球蛋白(TBG)启动子的启动子。在另一个特定实施方式中，所述启动子是肌肉特异性启动子例如Spc5-12、MCK和肌间线蛋白启动子。在另一个实施方式中，所述启动子是遍在启动子例如CMV、CAG和PGK启动子。本发明的核酸构建物还可以包含内含子，特别是选自人类β球蛋白b2(或HBB2)内含子、FIX内含子和鸡β-球蛋白内含子以及SV40内含子的内含子。此外，所述内含子可以是修饰的内含子例如SEQ IDNO：8的修饰的HBB2内含子、SEQ ID NO：10的修饰的FIX内含子或SEQ ID NO：12的修饰的鸡β-球蛋白内含子。在本发明的特定实施方式中，本发明的核酸构建物优选地以下述顺序包含：增强子；内含子；启动子，特别是肝特异性启动子；编码所述嵌合GAA多肽的核酸序列；以及多腺苷化信号。在特定实施方式中，本发明的核酸构建物特别是以下述顺序包含：ApoE控制区；HBB2内含子，特别是修饰的HBB2内含子；hAAT启动子；编码所述嵌合GAA多肽的核酸分子；以及牛生长激素多腺苷化信号。在特定实施方式中，所述核酸构建物包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了包含如上所定义的核酸分子或核酸构建物的载体。在特定实施方式中，所述载体是病毒载体，特别是反转录病毒载体例如慢病毒载体或AAV载体。特别地，所述病毒载体是AAV载体。可以在本发明中使用的示例性AAV载体包括具有来自于AAV1、AAV2、变体AAV2、AAV3、变体AAV3、AAV3B、变体AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、变体AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10例如AAVcy10和AAVrh10、AAVrh74、AAVdj、AAV-Anc80、AAV-LK03、AAV2i8和猪AAV例如AAVpo4和AAVpo6血清型的衣壳的AAV载体。更具体来说，所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳，更特别是AAV8衣壳。
此外，本发明提供了一种细胞，其包含如上所述的核酸分子、核酸构建物或载体。所述细胞可以是例如肝或肌细胞。
根据另一个方面，本发明还提供了一种由本文中所描述的核酸分子编码的嵌合GAA多肽。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其在可药用载体中包含本发明的核酸分子、本发明的核酸构建物、本发明的载体、本发明的细胞或本发明的嵌合GAA多肽。
本发明还提供了如上所述的核酸分子、核酸构建物、载体、细胞或嵌合GAA多肽，其用作药物。
本发明还提供了如上所述的核酸分子、核酸构建物、载体、细胞或嵌合GAA多肽，其用于治疗糖原贮积病的方法中。在特定实施方式中，所述糖原贮积病是GSDI、GSDII、GSDIII、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII或心脏的致死性先天性糖原贮积病。在更特定的实施方式中，所述糖原贮积病选自GSDI、GSDII和GSDIII，更特别地选自GSDII和GSDIII。在甚至更特定的实施方式中，所述糖原贮积病是GSDII。
附图说明
图1.序列优化与高效信号肽的组合在体外提高hGAA的分泌。将人肝细胞瘤细胞(Huh7)用对照质粒(GFP)、在肝特异性启动子的转录控制下表达野生型hGAA的质粒通过LipofectamineTM进行转染。所述hGAA转入基因带有本源信号肽(pAAV-LSP-sp1-hGAA)或α-1抗胰蛋白酶的信号肽(pAAV-LSP-sp2-hGAA)。同样的编码sp1-hGAA和sp2-hGAA的cDNA也被序列优化(分别为pAAV-hAAT-sp1-hGAAco1和pAAV-hAAT-sp2-hGAAco1)。在转染后48小时，通过产荧光酶测定法测量培养基中的hGAA活性，并针对重组hGAA的标准曲线评估GAA活性。所述柱状图示出了归一化到在与sp1信号肽融合的hGAA或hGAAco1中测量到的水平的分泌的hGAA水平的提高倍数的平均值±SD。数据源自于三个不同实验。统计分析通过配对t-检验来进行(*＝p<0.05，正如所指示的)。
图2.hGAA序列的不同序列优化算法与高效信号肽的组合在体外显著提高分泌。将人肝细胞瘤细胞(Huh7)用对照质粒(GFP)、在肝特异性启动子的转录控制之下表达与sp1信号肽融合的野生型hGAA(wt)或与sp2融合的按照两种不同算法(分别为co1和co2)优化的hGAA序列的质粒通过LipofectamineTM进行转染。在转染后48小时，通过产荧光酶测定法测量培养基中的hGAA活性。所述柱状图示出了源自于三个不同实验的分泌的hGAA水平的平均值±SD。统计分析通过ANOVA来进行(*＝相对于sp1 wt来说p<0.05)。
具体实施方式
本发明的一个方面涉及一种核酸分子，其包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少85％同一性并编码功能性GAA多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2是编码采取前体形式的天然、野生型hGAA多肽的优化过的核酸序列(即它编码不含信号肽的hGAA)。
溶酶体酸性α-葡萄糖苷酶或“GAA”(E.C.3.2.1.20)(1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)是一种外切-1,4-α-D-葡萄糖苷酶，其水解寡糖的α-1,4和α-1,6键两者，以释放葡萄糖。GAA的缺乏引起II型糖原贮积病(GSDII)，也被称为庞贝氏病(尽管这个术语以前是指这种疾病的婴儿期发作形式)。它催化糖原的完全降解，并在分支点处减慢。在17号染色体上28kb的人类酸性α-葡萄糖苷酶基因编码3.6kb mRNA，其产生951个氨基酸的多肽(Hoefsloot等，(1988)EMBO J.7:1697；Martiniuk等，(1990)DNA and Cell Biology 9:85)。所述酶在内质网中接受与翻译同时的N-连接糖基化。它被合成为110-kDa的前体形式，其经过大量的糖基化修饰、磷酸化并经过蛋白水解加工，通过大约90-kDa的内体中间体，成熟为最终的溶酶体76和67kDa形式(Hoefsloot，(1988)EMBO J.7:1697；Hoefsloot等，(1990)Biochem.J.272:485；Wisselaar等，(1993)J.Biol.Chem.268:2223；Hermans等，(1993)Biochem.J.289:681)。
在患有GSD II的患者中，酸性α-葡萄糖苷酶的缺乏引起糖原在溶酶体中大量积累，破坏细胞功能(Hirschhorn,R.和Reuser,A.J.，(2001)，在《遗传病的代谢和分子基础》(The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease)，Scriver,C.R.等主编，第3389-3419页(McGraw-Hill，New York)中)。在最常见的婴儿期形式中，患者表现出渐进性肌肉变性和心肌病，并在2岁之前死亡。在青少年和成年人发作形式中，存在严重衰弱。
此外，患有其他GSD的患者也可能从优化形式的GAA的给药获益。例如，已显示(Sun等，(2013)Mol Genet Metab 108(2):145；WO2010/005565)GAA的给药在来自于III型糖原贮积病(GSD III)患者的原代成肌细胞中降低糖原。
当在本文中使用时，术语“GAA”或“GAA多肽”涵盖了成熟(～76或～67kDa)和前体(例如～110kDa)GAA、特别是前体形式，以及通过插入、缺失和/或替换修饰或突变的GAA蛋白或其片段，它们是GAA的功能性衍生物，即它们保留了GAA的生物功能(即具有如上所定义的本源GAA蛋白的至少一种生物学活性，例如可以水解糖原)，和GAA变体(例如由Kunita等，(1997)Biochemica et Biophysica Acta1362:269所描述的GAA II；由Hirschhorn,R.和Reuser,A.J.(2001)在《遗传病的代谢和分子基础》(The Metabolic and Molecular Basisfor Inherited Disease)(Scriver,C.R.、Beaudet,A.L.、Sly,W.S.和Valle,D.主编)，第3389-3419页，McGraw-Hill，New York中所描述的GAA多态性和SNP，参见第3403-3405页)。可以使用本领域中已知的任何GAA编码序列，例如参见SEQ ID NO：3；GenBank登记号NM_00152，Hoefsloot等，(1988)EMBO J.7:1697和Van Hove等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:65(人类)，GenBank登记号NM 008064(小鼠)，和Kunita等，(1997)Biochemica et Biophysica Acta 1362:269(鹌鹑)。
所述GAA多肽的编码序列可以源自于任何来源，包括鸟类和哺乳动物物种。当在本文中使用时，术语“鸟类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡。当在本文中使用时，术语“哺乳动物”包括但不限于人类、猿猴和其他非人类灵长动物、牛科动物、绵羊、山羊、马、猫科动物、犬科动物、兔形目动物等。在本发明的实施方式中，本发明的核酸编码人类、小鼠或鹌鹑、特别是人类GAA多肽。在另一个特定实施方式中，由本发明的核酸分子编码的GAA多肽包含在SEQ ID NO：15或19中示出的氨基酸序列，其对应于不含信号肽的两种hGAA变体(值得注意的是，hGAA的天然信号肽对应于SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18中的1-27位氨基酸，所述两个序列对应于SEQ ID NO：15和19的两种hGAA变体，但包括它们的天然信号肽)。因此，在本发明的特定实施方式中，由本发明的核酸编码的GAA多肽包含融合到SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：15的氨基酸序列的SEQ ID NO：4中示出的氨基酸序列。
本发明的核酸分子优选地与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少92％的同一性，特别是至少95％的同一性，例如至少98、99或100％的同一性。
在本发明的另一个实施方式中，本发明的核酸分子与SEQ ID NO：3中示出的序列的82-2859位核苷酸具有至少75％(例如至少77％)、至少80％或至少82％(例如至少83％)的同一性，所述SEQ ID NO：3的序列是野生型hGAA编码序列的序列(1-81位核苷酸是编码hGAA的天然信号肽的部分)。
术语“同一性”及其偏差是指两个核酸分子之间的序列同一性。当两个被比较序列中的一个位置被同一碱基占据时，例如如果两个DNA分子中的每一者中的一个位置被腺嘌呤占据，则所述分子在该位置处具有同一性。两个序列之间的同一性百分数是所述两个序列共有的匹配位置的数目除以被比较的位置的数目X 100的函数。例如，如果在两个序列中10个位置中的6个匹配，则所述两个序列具有60％的同一性。通常，在将两个序列对齐以给出最大同一性时做出比较。本领域技术人员已知的各种不同的生物信息学工具可用于比对核酸序列，例如BLAST或FASTA。
在特定实施方式中，本发明的核酸分子包含编码功能性GAA的核酸序列，其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中示出的核酸序列、基本上由所述核酸序列构成或由所述核酸序列构成。
此外，本发明的核酸分子编码功能性GAA蛋白，即它编码人类GAA蛋白，所述蛋白在被表达时具有野生型GAA蛋白的功能。正如上文所定义的，野生型GAA的功能是水解寡糖和多糖、更具体为糖原的α-1,4和α-1,6连接两者，以释放出葡萄糖。由本发明的核酸编码的功能性GAA蛋白与由SEQ ID NO：1至3的核酸序列编码的野生型GAA蛋白相比，可以具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少100％的对糖原的水解活性。由本发明的核酸编码的GAA蛋白的活性甚至可能为由SEQ ID NO：1至3的核酸序列编码的野生型GAA蛋白的活性的超过100％，例如超过110％、120％、130％、140％或甚至超过150％。
专业技术人员能够容易地确定本发明的核酸是否表达功能性GAA蛋白。适合的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如，一种适合的体外方法包括将所述核酸插入到载体例如质粒或病毒载体中，用所述载体转染或转导宿主细胞例如293T或HeLa细胞或其他细胞例如Huh7，并测定GAA活性。可替选地，适合的体内方法包括将含有所述核酸的载体转导到庞贝氏病或另一种糖原贮积病的小鼠模型中，并测定小鼠血浆中的功能性GAA和组织中GAA的存在。适合的方法更详细描述在下面的实验部分中。
发明人已发现，上文描述的核酸分子与野生型GAA cDNA相比，令人吃惊地引起功能性GAA蛋白的高水平表达。这意味着该核酸分子可用于生产高水平的GAA蛋白，并且在缺乏GAA表达和/或活性或GAA的高水平表达可以改善疾病例如糖原贮积病的情形中是特别令人感兴趣的。具体来说，所述糖原贮积病可以是GSDI(冯·吉尔克氏病(von Gierke'sdisease))、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里氏病(Cori disease))、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII或心脏的致死性先天性糖原贮积病。更具体来说，所述糖原贮积病选自GSDI、GSDII和GSDIII，甚至更特别地选自GSDII和GSDIII。在甚至更特定的实施方式中，所述糖原贮积病是GSDII。具体来说，本发明的核酸分子可用于基因疗法中，以治疗缺乏GAA的病症或与糖原的积累相关的其他病症，例如GSDI(冯·吉尔克氏病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里氏病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和心脏的致死性先天性糖原贮积病，更特别是GSDI、GSDII或GSDIII，甚至更特别是GSDII和GSDIII。在甚至更特定的实施方式中，本发明的核酸分子可用于基因疗法中，以治疗GSDII。
编码功能性GAA的本发明的核酸分子的序列已针对在体内表达所述GAA多肽被优化。序列优化可以包括核酸序列的大量改变，包括密码子优化，提高GC含量，减少CpG岛的数目，减少可选开放阅读框(ARF)的数目和减少拼接供体和拼接受体位点的数目。由于遗传密码的简并性，不同核酸分子可能编码相同蛋白质。也已公知，不同生物体中的遗传密码通常偏向使用编码同一氨基酸的几个密码子中的一者超过其他密码子。通过密码子优化，将改变引入到核苷酸序列中，其利用给定细胞背景中存在的密码子偏好，以使得到的密码子优化的核苷酸序列与未经密码子优化的序列相比更可能以相对高的水平在这种给定的细胞背景中表达。在本发明的优选实施方式中，这种编码功能性GAA的序列优化过的核苷酸序列被密码子优化，以与编码相同GAA蛋白的未经密码子优化的核苷酸序列相比提高它在人类细胞中的表达，例如通过利用人类特异性密码子使用偏好。
在特定实施方式中，所述优化过的GAA编码序列是密码子优化的，和/或与SEQ IDNO：3的野生型hGAA编码序列的82-2859位核苷酸相比具有提高的GC含量和/或具有减少的可选开放阅读框数目和/或具有减少的拼接供体和/或拼接受体位点数目。例如，本发明的核酸序列引起所述GAA序列中与野生型GAA序列的序列相比GC含量提高至少2、3、4、5或10％。在特定实施方式中，本发明的核酸序列引起所述GAA序列中与野生型GAA核苷酸序列的序列相比GC含量提高2、3、4或更特别地5％或10％(特别是5％)。在特定实施方式中，编码功能性GAA多肽的本发明的核酸序列与SEQ ID NO：3中示出的序列的82-2859位核苷酸“基本上相同”，即具有约70％同一性、更优选地约80％同一性、甚至更优选地约90％同一性、甚至更优选地约95％同一性、甚至更优选地约97％、98％或甚至99％同一性。正如上文提到的，除了GC含量和/或ARF数目之外，序列优化还可以包括所述序列中CpG岛数目的减少和/或拼接供体和受体位点数目的减少。当然，正如本领域技术人员公知的，序列优化是所有这些参数之间的平衡，意味着如果上述参数中的至少一者改善而一种或多种其他参数没有改善，则序列可以被认为是优化的，只要所述优化的序列引起所述转入基因的改进例如表达提高和/或在体内对所述转入基因的免疫应答降低即可。
此外，编码功能性GAA的核苷酸序列对人类细胞的密码子使用的适应性可以被表示为密码子适应指数(CAI)。密码子适应指数在本文中被定义为基因的密码子使用对高表达的人类基因的密码子使用的相对适应性的度量。每个密码子的相对适应性(w)是每个密码子的使用与同一氨基酸的最丰富的密码子的使用的比率。所述CAI被定义为这些相对适应性值的几何平均值。排除非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)。CAI值的范围为0至1，更高的值指示最丰富密码子的更高比例(参见Sharp和Li，1987,Nucleic AcidsResearch 15:1281-1295；也参见：Kim等，Gene.1997,199:293-301；zur Megede等，Journalof Virology,2000,74:2628-2635)。优选地，编码GAA的核酸分子具有至少0.75(特别是0.77)、0.8、0.85、0.90、0.92或0.94的CAI。
在一个实施方式中，本发明的核酸分子编码的蛋白具有与由SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的核苷酸序列编码的蛋白相比0至50个之间、0至30个之间、0至20个之间、0至15个之间、0至10个之间或0至5个之间的氨基酸变化。此外，由本发明的核酸编码的GAA蛋白可以是本领域中已知的GAA变体，其中本发明的核酸分子编码的蛋白具有与本领域中已知的GAA蛋白相比0至50个之间、0至30个之间、0至20个之间、0至15个之间、0至10个之间或0至5个之间的氨基酸变化。这种可以充当设计GAA蛋白的功能性变体的基础的本领域中已知的GAA蛋白，具体来说可以在Uniprot的GAA条目中找到(登记号P10253；对应于GenBankCAA68763.1；SEQ ID NO：16)。在另一个特定实施方式中，本发明的核酸序列的GAA组成部分编码本文中所定义的变体GAA多肽或这些肽的功能性变体，例如选自被鉴定为Genbank登记号AAA52506.1(SEQ ID NO：20)、EAW89583.1(SEQ ID NO：21)和ABI53718.1(SEQ ID NO：22)的多肽。其他变体GAA多肽包括在WO2012/145644、WO00/34451和US6,858,425中描述的多肽。在特定实施方式中，本发明的核酸分子编码亲本GAA多肽，其源自于SEQ ID NO：16或SEQID NO：18中示出的氨基酸序列。
在特定实施方式中，由本发明的核酸分子编码的GAA多肽是功能性GAA，并与SEQID NO：16或SEQ ID NO：18中示出的hGAA蛋白的28-952位氨基酸残基具有至少80％，特别是至少85％、90％、95％，更特别是至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。在特定实施方式中，由本发明的核酸分子编码的GAA蛋白具有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18的28-952位氨基酸残基的序列。
术语“核酸序列”(或核酸分子)是指采取单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是编码本发明的GAA多肽的DNA。
本发明还涉及一种编码嵌合功能性GAA多肽的核酸分子，所述嵌合功能性GAA多肽包含连接到GAA多肽的hAAT信号肽。
具体来说，发明人还令人吃惊地显示，序列优化与信号肽替换的组合导致产生功能性蛋白的更高的表达水平和更高的分泌。因此，本发明的核酸分子可以编码嵌合GAA多肽，其中所述核酸分子包含两个组成部分：
-编码信号肽的组成部分(或者被称为“信号肽组成部分”)，和
-编码如上所定义的功能性GAA多肽的组成部分。
在由本发明的核酸分子编码的嵌合GAA多肽中，所述信号肽组成部分编码hAAT蛋白的信号肽。在特定实施方式中，本发明的核酸分子可以是优化的序列，其编码包含可操作连接到GAA多肽的hAAT信号肽的嵌合GAA多肽。
与野生型GAA多肽相比，将野生型GAA的内源信号肽用外源信号肽，即作为hAAT的信号肽的源自于不同于GAA的蛋白的信号肽代替。与包含其天然信号肽的相应GAA多肽相比，所述与GAA蛋白的剩余部分融合的外源信号肽提高了所得嵌合GAA多肽的分泌。此外，根据本发明的特定实施方式，对应于hAAT蛋白的信号肽的核苷酸序列可以是如上所提供的优化过的序列。
从细胞分泌的新合成的GAA的相对比例可以通过本领域中已知的和实施例中所描述的方法常规地确定。分泌的蛋白质可以通过在细胞培养基、血清、奶等中直接测量所述蛋白质本身(例如通过蛋白质印迹)或通过蛋白质活性测定法(例如酶测定法)来检测。
本领域技术人员还应该理解，所述嵌合GAA多肽可以含有另外的氨基酸，例如作为核酸构建物的操作例如添加限制性位点的结果，只要这些另外的氨基酸不使所述信号肽或GAA多肽不具有功能即可。所述另外的氨基酸可以被切除或者可以被成熟多肽保留，只要保留不产生无功能的多肽即可。
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的核酸构建物。所述核酸构建物可以对应于表达盒，其包含可操作连接到一个或多个表达控制序列和/或提高转入基因的表达的其他序列和/或增强被编码蛋白质的分泌的序列和/或增强被编码蛋白质的摄入的序列的本发明的核酸序列。当在本文中使用时，术语“可操作连接”是指多核苷酸元件以功能性关系相连。当核酸被放置成与另一个核酸序列处于功能性关系时，它被“可操作连接”。例如，启动子或另一个转录调控序列，如果它影响编码序列的转录，则被可操作连接到所述编码序列。这些表达控制序列在本领域中是已知的，例如启动子、增强子(例如顺式调控模块(CRM))、内含子、polyA信号等。
具体来说，所述表达盒可以包含启动子。所述启动子可以是遍在或组织特异性启动子，特别是能够在需要GAA表达的细胞或组织中，例如在缺乏GAA的患者中的需要GAA表达的细胞或组织中促进表达的启动子。在特定实施方式中，所述启动子是肝特异性启动子例如α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)(SEQ ID NO：5)、甲状腺素运载蛋白启动子、白蛋白启动子、甲状腺素结合性球蛋白(TBG)启动子、LSP启动子(包含甲状腺素结合性球蛋白启动子序列、两个拷贝的α1-微球蛋白/双库尼茨抑制剂(bikunin)增强子序列和前导序列-34。Ill,C.R.等，(1997)，用于甲型血友病的基因疗法的人类因子VIII互补DNA表达质粒的优化(Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmidfor gene therapy of hemophilia A)，Blood Coag.Fibrinol.8:S23–S30)等。其他有用的肝特异性启动子在本领域中是已知的，例如在冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)编纂的肝特异性基因启动子数据库(http://rulai.cshl.edu/LSPD/)中列出的启动子。在本发明的情形中，优选的启动子是hAAT启动子。在另一个实施方式中，所述启动子是在一种目标组织或细胞中(例如在肌细胞中)和在肝细胞中指导表达的启动子。例如，在一定程度上，对肌细胞特异的启动子例如肌间线蛋白、Spc5-12和MCK启动子可能在肝细胞中存在一定的表达泄漏，这对于诱导对象对从本发明的核酸表达的GAA蛋白的免疫耐受性来说可以是有利的。
其他组织特异性或非组织特异性启动子在本发明的实践中也可以是有用的。例如，所述表达盒可以包含组织特异性启动子，其是不同于肝特异性启动子的启动子。例如，所述启动子可以是肌肉特异性的，例如肌间线蛋白启动子(和肌间线蛋白启动子变体例如包含天然或人工增强子的肌间线蛋白启动子)、SPc5-12或MCK启动子。在另一个实施方式中，所述启动子是对其他细胞谱系特异的启动子例如红细胞生成素启动子，用于从红细胞谱系的细胞表达所述GAA多肽。
在另一个实施方式中，所述启动子是遍在启动子。代表性的遍在启动子包括巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、巨细胞病毒增强子/启动子(CMV)、PGK启动子、SV40早期启动子等。
此外，所述启动子也可以是内源启动子，例如白蛋白启动子或GAA启动子。
在特定实施方式中，所述启动子被结合到增强子序列例如顺式调控模块(CRM)或人工增强子序列。例如，所述启动子可以被结合到增强子序列例如人类ApoE控制区(或人类载脂蛋白E/C-I基因座，肝控制区HCR-1——Genbank登记号U32510，示出在SEQ ID NO：6中)。在特定实施方式中，增强子序列例如ApoE序列被结合到肝特异性启动子例如上面列出的那些启动子，特别是例如hAAT启动子。在本发明的实践中有用的其他CRM包括在Rincon等，MolTher.2015Jan；23(1):43-52；Chuah等，MolTher.2014Sep；22(9):1605-13或Nair等，Blood.2014May 15；123(20):3195-9中所描述的CRM。
在另一个特定实施方式中，所述核酸构建物包含内含子，特别是置于所述启动子与GAA编码序列之间的内含子。内含子可以被引入以提高mRNA的稳定性和蛋白质的生产。在其他实施方式中，所述核酸构建物包含人类β球蛋白b2(或HBB2)内含子、凝血因子IX(FIX)内含子、SV40内含子或鸡β-球蛋白内含子。在另一个其他实施方式中，本发明的核酸构建物含有修饰的内含子(特别是修饰的HBB2或FIX内含子)，其被设计用于减少在所述内含子中存在的可选开放阅读框(ARF)的数目或甚至完全除去ARF。优选地，除去长度跨度超过50bp并具有与起始密码子同框的终止密码子的ARF。ARF可以通过修改所述内含子的序列来去除。例如，可以利用核苷酸替换、插入或缺失，优选地通过核苷酸替换进行修饰。作为实例，可以替换在目标内含子序列中存在的ATG或GTG起始密码子中的一个或多个核苷酸，特别是一个核苷酸，产生非起始密码子。例如，可以将目标内含子序列内的ATG或GTG用不是起始密码子的CTG代替。
在核酸构建物中使用的经典HBB2内含子示出在SEQ ID NO：7中。例如，该HBB2内含子可以通过消除所述内含子中的起始密码子(ATG和GTG密码子)进行修饰。在特定实施方式中，包含在所述构建物中的修饰的HBB2内含子具有在SEQ ID NO：8中示出的序列。在核酸构建物中使用的经典FIX内含子源自于人类FIX的第一内含子，并示出在SEQ ID NO：9中。FIX内含子可以通过消除所述内含子中的起始密码子(ATG和GTG密码子)进行修饰。在特定实施方式中，包含在本发明的构建物中的修饰的FIX内含子具有在SEQ ID NO：10中示出的序列。在核酸构建物中使用的经典鸡β-球蛋白内含子示出在SEQ ID NO：11中。鸡β-球蛋白内含子可以通过消除所述内含子中的起始密码子(ATG和GTG密码子)进行修饰。在特定实施方式中，包含在本发明的构建物中的修饰的鸡β-球蛋白内含子具有在SEQ ID NO：12中示出的序列。
发明人以前已在WO2015/162302中显示，这种修饰的内含子特别是修饰的HBB2或FIX内含子具有有利的性质，并且可以显著提高转入基因的表达。
在特定实施方式中，本发明的核酸构建物是一种表达盒，其以5'至3'的方向包含任选地在前面带有增强子的启动子、本发明的编码序列(即本发明的优化的GAA编码序列、本发明的嵌合GAA编码序列或本发明的嵌合且优化过的GAA编码序列)和多腺苷化信号(例如牛生长激素多腺苷化信号、SV40多腺苷化信号或另一种天然存在的或人工多腺苷化信号)。在特定实施方式中，本发明的核酸构建物是一种表达盒，其以5'至3'的方向包含任选地在前面带有增强子(例如ApoE控制区)的启动子、内含子(特别是如上所定义的内含子)、本发明的编码序列和多腺苷化信号。在另一个特定实施方式中，本发明的核酸构建物是一种表达盒，其以5'至3'的方向包含增强子例如ApoE控制区、启动子、内含子(特别是如上所定义的内含子)、本发明的编码序列和多腺苷化信号。在本发明的其他特定实施方式中，所述表达盒以5'至3'的方向包含ApoE控制区、hAAT-肝特异性启动子、HBB2内含子(特别是如上所定义的修饰的HBB2内含子)、本发明的编码序列和牛生长激素多腺苷化信号，例如在SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中示出的核酸构建物，其分别包含SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的序列优化过的GAA核酸分子。
在特定实施方式中，所述表达盒包含ApoE控制区、hAAT-肝特异性启动子、密码子优化的HBB2内含子、本发明的编码序列和牛生长激素多腺苷化信号。
在设计本发明的核酸构建物时，本领域技术人员应该注意用于将所述构建物递送到细胞和器官的载体的尺寸限制。具体来说，本领域技术人员知道AAV载体的主要限制是它的运载容量，其可能随着AAV血清型而变，但据认为被限制在母体病毒基因组的尺寸左右。例如，5kb通常被认为是包装在AAV8衣壳中的最大尺寸(Wu Z.等，MolTher.,2010,18(1):80-86；Lai Y.等，MolTher.,2010,18(1):75-79；Wang Y.等，Hum Gene Ther Methods,2012,23(4):225-33)。因此，本领域技术人员在本发明的实践中应该注意选择本发明的核酸构建物的组分，以使得到的核酸序列，包括编码AAV 5'-至3'-ITR的序列，优选地不超过所使用的AAV载体的运载容量的110％，具体来说优选地不超过5.5kb。
本发明还涉及包含本文中公开的核酸分子或构建物的载体。具体来说，本发明的载体是适合于蛋白质表达，优选地用于基因疗法的载体。在一个实施方式中，所述载体是质粒载体。在另一个实施方式中，所述载体是含有本发明的核酸分子、特别是编码本发明的GAA多肽的信使RNA的纳米粒子。在另一个实施方式中，所述载体是基于转座子的系统，允许将本发明的核酸分子或构建物整合到靶细胞的基因组中，例如极度活跃的睡美人(Sleeping Beauty)(SB100X)转座子系统(Mates等，2009)。在另一个实施方式中，所述载体是适用于基因疗法的病毒载体，靶向任何目标细胞例如肝组织或细胞、肌细胞、CNS细胞(例如脑细胞)或造血干细胞例如红细胞谱系的细胞(例如红细胞)。在这种情况下，本发明的核酸构建物还含有本领域中公知的适合于生产高效病毒载体的序列。在特定实施方式中，所述病毒载体源自于整合病毒。具体来说，所述病毒载体可以源自于反转录病毒或慢病毒。在另一个特定实施方式中，所述病毒载体是AAV载体，例如适用于转导肝组织或细胞的AAV载体，更特别是AAV-1、AAV-2和AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V改变的工程化衣壳的四重突变的衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016Jul 18,Hum Gene TherMethods.[Epub ahead of print]中)、AAV-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸变化S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.Vol.24(6),p.1042中)、AAV-3B和AAV-3B变体、AAV-4、AAV-5、AAV-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,p.16026中)、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10例如AAV-cy10和AAV-rh10、AAV-rh74、AAV-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、猪AAV血清型例如AAVpo4和AAVpo6等载体，或反转录病毒载体例如慢病毒载体和α-反转录病毒。正如在本领域中已知的，取决于考虑使用的具体病毒载体，将其他适合的序列引入到本发明的核酸构建物中，用于获得功能性病毒载体。适合的序列包括用于AAV载体的AAV ITR或用于慢病毒载体的LTR。因此，本发明还涉及如上所述的表达盒，其在每一侧带有ITR或LTR。
病毒载体的优点在本公开下面的部分中讨论。病毒载体对于递送本发明的核酸分子或构建物来说是优选的，例如反转录病毒载体如慢病毒载体，或非致病性细小病毒，更优选为AAV载体。人类细小病毒腺相关病毒(AAV)是一种天然复制有缺陷的依赖病毒，其能够整合到被感染细胞的基因组中以建立潜伏感染。最后一种性质在哺乳动物病毒中似乎是独特的，因为所述整合发生在人类基因组中被称为AAVS1的特异性位点处，其位于19号染色体上(19q13.3-qter)。
因此，AAV载体作为用于人类基因疗法的潜在载体引起了相当大的兴趣。所述病毒的有利性质包括它与任何人类疾病缺乏相关性，它感染分裂细胞和非分裂细胞两者的能力，以及可以被感染的源自于不同组织的广范围的细胞系。
在从人类或非人类灵长动物(NHP)分离并被充分表征的AAV的血清型中，人类血清型2是被开发作为基因转移载体的第一种AAV，其他目前使用的AAV血清型包括AAV-1、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V改变的工程化衣壳的四重突变的衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016Jul 18,Hum Gene Ther Methods.[Epub ahead of print]中)、AAV-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸变化S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.Vol.24(6),p.1042中)、AAV-3B和AAV-3B变体、AAV-4、AAV-5、AAV-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,p.16026中)、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10例如AAV-cy10和AAV-rh10、AAV-rh74、AAV-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、猪AAV血清型例如AAVpo4和AAVpo6，以及AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体等。此外，其他非天然的工程化变体和嵌合AAV也可以是有用的。
AAV病毒可以使用常规的分子生物学技术进行工程化改造，使得可以优化这些粒子用于核酸序列的细胞特异性递送，用于最小化免疫原性，用于调节稳定性和粒子寿命，用于高效降解，用于精确递送到核。
用于组装成载体的理想的AAV片段包括cap蛋白，包括vp1、vp2、vp3和高变区，rep蛋白，包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，以及编码这些蛋白质的序列。这些片段可以被容易地使用在各种不同的载体系统和宿主细胞中。
缺少Rep蛋白的基于AAV的重组载体以低效能整合到宿主的基因组中，并主要作为可以在靶细胞中存留数年的稳定的环状游离体存在。
除了使用AAV天然血清型之外，在本发明的情形中也可以使用人工AAV血清型，包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这种人工衣壳可以通过任何适合的技术，使用所选的AAV序列(例如vp1衣壳蛋白的片段)与可以从不同的所选AAV血清型、同一AAV血清型的非毗连部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得的异源序列相组合来产生。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。
因此，本发明涉及包含本发明的核酸分子或构建物的AAV载体。在本发明的情形中，所述AAV载体包含能够转导目标靶细胞、特别是肝细胞的AAV衣壳。根据特定实施方式，所述AAV载体具有AAV-1、AAV-2、AAV-2变体(例如包含具有Y44+500+730F+T491V改变的工程化衣壳的四重突变的衣壳优化的AAV-2，其公开在Ling等，2016Jul18,Hum Gene TherMethods.[Epub ahead of print]中)、AAV-3和AAV-3变体(例如包含具有两个氨基酸变化S663V+T492V的工程化AAV3衣壳的AAV3-ST变体，其公开在Vercauteren等，2016,Mol.Ther.Vol.24(6),p.1042中)、AAV-3B和AAV-3B变体、AAV-4、AAV-5、AAV-6和AAV-6变体(例如包含三重突变的AAV6衣壳Y731F/Y705F/T492V形式的AAV6变体，其公开在Rosario等，2016,Mol Ther Methods Clin Dev.3,p.16026中)、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10例如AAV-cy10和AAV-rh10、AAV-rh74、AAV-dj、Anc80、LK03、AAV2i8、猪AAV例如AAVpo4和AAVpo6，以及AAV血清型的酪氨酸、赖氨酸和丝氨酸衣壳突变体等的血清型。在特定实施方式中，所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8血清型(即所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8血清型的衣壳)。在另一个特定实施方式中，所述AAV载体是假型载体，即它的基因组和衣壳源自于不同血清型的AAV。例如，所述假型AAV载体可以是其基因组源自于上文提到的血清型之一，并且衣壳源自于另一种血清型的载体。例如，所述假型载体的基因组可以具有源自于AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8血清型的衣壳，并且它的基因组可以源自于不同的血清型。在特定实施方式中，所述AAV载体具有AAV8、AAV9或AAVrh74血清型，特别是AAV8或AAV9血清型，更特别是AAV8血清型的衣壳。
在特定实施方式中，在所述载体被用于将转入基因递送到肌细胞的情形中，所述AAV载体可以选自AAV8、AAV9和AAVrh74等。
在另一个特定实施方式中，在所述载体被用于将转入基因递送到肝细胞的情形中，所述AAV载体可以选自AAV5、AAV8、AAV9、AAV-LK03、AAV-Anc80和AAV3B等。
在另一个实施方式中，所述衣壳是修饰的衣壳。在本发明的情形中，“修饰的衣壳”可以是嵌合衣壳或包含源自于一种或多种野生型AAV VP衣壳蛋白的一种或多种变体VP衣壳蛋白的衣壳。
在特定实施方式中，所述AAV载体是嵌合载体，即它的衣壳包含源自于至少两种不同AAV血清型的VP衣壳蛋白，或包含至少一种将源自于至少两种AAV血清型的VP蛋白区域或结构域组合的嵌合VP蛋白。可用于转导肝细胞的这种嵌合AAV载体的实例描述在Shen等，Molecular Therapy,2007和Tenney等，Virology,2014中。例如，嵌合AAV载体可以源自于AAV8衣壳序列与不同于AAV8血清型的AAV血清型例如上文具体提到的任一种AAV血清型的序列的组合。在另一个实施方式中，所述AAV载体的衣壳包含一种或多种变体VP衣壳蛋白，例如在WO2015013313中所公开的，特别是表现出高的肝趋向性的RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4和RHM15-6衣壳变体。
在另一个实施方式中，所述修饰的衣壳也可源自于通过易错PCR和/或肽插入(例如在Bartel等，2011中所述)而插入的衣壳修饰。此外，衣壳变体可以包括单氨基酸变化例如酪氨酸突变体(例如在Zhong等，2008中所述)。
此外，所述AAV载体的基因组可以是单链或自身互补的双链基因组(McCarty等，Gene Therapy，2003)。自身互补的双链AAV载体通过从AAV末端重复序列之一中缺失掉末端解链位点(trs)来产生。这些其复制的基因组是野生型AAV基因组长度的一半的修饰的载体，具有包装DNA二聚体的倾向性。在优选实施方式中，在本发明的实践中使用的AAV载体具有单链基因组，并且更优选地包含AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳例如AAV8或AAV9衣壳，更特别是AAV8衣壳。
在特别优选的实施方式中，本发明涉及一种AAV载体，其在单链或双链的自身互补的基因组(例如单链基因组)中包含本发明的核酸构建物。在一个实施方式中，所述AAV载体包含AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳例如AAV8或AAV9衣壳，更特别是AAV8衣壳。在另一个特定实施方式中，所述核酸被可操作连接到启动子，特别是遍在或肝特异性启动子。根据特定变体的实施方式，所述启动子是遍在启动子，例如巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、巨细胞病毒增强子/启动子(CMV)、PGK启动子和SV40早期启动子。在特定变体中，所述遍在启动子是CAG启动子。根据另一种变体，所述启动子是肝特异性启动子，例如α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、甲状腺素运载蛋白启动子、白蛋白启动子和甲状腺素结合性球蛋白(TBG)启动子。在特定变体中，所述肝特异性启动子是SEQ ID NO：5的hAAT肝特异性启动子。在另一个特定实施方式中，包含在本发明的AAV载体的基因组中的核酸构建物还包含如上所述的内含子，例如置于所述启动子与编码GAA编码序列(即本发明的优化的GAA编码序列、本发明的嵌合GAA编码序列或本发明的嵌合且优化的GAA编码序列)的核酸序列之间的内含子。可以包含在引入到所述AAV载体中的核酸构建物内的代表性内含子包括但不限于人类β球蛋白b2(或HBB2)内含子、FIX内含子和鸡β-球蛋白内含子。所述AAV载体的基因组中的所述内含子可以是经典(或未修饰的)内含子或被设计以减少所述内含子中的可选开放阅读框(ARF)的数目或甚至完全除去ARF的修饰的内含子。可以在这种将本发明的核酸引入到AAV载体内的实施方式的实践中使用的修饰和未修饰的内含子，已在上文充分描述。在特定实施方式中，本发明的AAV载体，特别是包含AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳例如AAV8或AAV9衣壳，更特别是AAV8衣壳的AAV载体，在其基因组内包括修饰(或优化的)内含子，例如SEQ ID NO：8的修饰的HBB2内含子、SEQ ID NO：10的修饰的FIX内含子和SEQ ID NO：12的修饰的鸡β-球蛋白内含子。在另一个特定实施方式中，本发明的载体是包含AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳例如AAV8或AAV9衣壳，更特别是AAV8衣壳的AAV载体，其包含的基因组以5’至3’方向含有：AAV 5'-ITR(例如AAV2 5’-ITR)，ApoE控制区，hAAT-肝特异性启动子，HBB2内含子(特别是如上所定义的修饰的HBB2内含子)，本发明的GAA编码序列，牛生长激素多腺苷化信号和AAV 3'-ITR(例如AAV2 3'-ITR)，例如所述基因组包含在SEQ ID NO：13中示出的核酸构建物并在侧翼带有AAV 5'-ITR(例如AAV2 5’-ITR)和AAV3'-ITR(例如AAV2 3'-ITR)。
在本发明的特定实施方式中，本发明的核酸构建物包含如上所定义的肝特异性启动子，并且所述载体是如上所述的能够转导肝组织或细胞的病毒载体。得益于这个实施方式开发了高效且优化的载体以在肝细胞中表达可分泌形式的GAA并诱导对所述蛋白质的免疫耐受，肝的促耐受原和代谢性质被有利地实现。
此外，在另一个特定实施方式中，本发明提供了两种载体例如两种病毒载体、特别是两种AAV载体的组合，用于在目标细胞中改进基因递送和治疗功效。例如，所述两种载体可以携带编码本发明的GAA蛋白的本发明的核酸分子，并且其在这两种载体的每一种中，在一个不同的启动子控制之下。在特定实施方式中，一种载体包含作为肝特异性启动子(如上文描述的之一)的启动子，另一种载体包含对用于治疗糖原贮积病的另一种目标组织具有特异性的启动子例如肌肉特异性启动子，例如肌间线蛋白启动子。在这个实施方式的特定变化形式中，这种载体组合对应于如WO2015196179中所述产生的多种共包装AAV载体。
另一方面，本发明提供了一种嵌合GAA多肽，其中天然存在的GAA信号肽被hAAT蛋白的信号肽代替。在特定实施方式中，所述嵌合GAA多肽具有在SEQ ID NO：17中示出的序列，或者是与SEQ ID NO：17中示出的序列具有至少90％的同一性，特别是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的功能性衍生物。
本发明还涉及用本发明的核酸分子或构建物转化的细胞例如肝细胞，这与用于离体基因疗法的情况相同。本发明的细胞可以通过任何适合的给药途径递送到需要它们的对象例如缺乏GAA的患者，例如通过注射到所述对象的肝脏中或血流中。在特定实施方式中，本发明包括将本发明的核酸引入到肝细胞中，特别是待治疗对象的肝细胞中，并将其中引入有所述核酸的转化的肝细胞给药到所述对象。有利的是，这个实施方式对从所述细胞分泌GAA有用。在特定实施方式中，所述肝细胞是来自于待治疗患者的肝细胞，或者是肝干细胞，其被进一步转化并在体外分化成肝细胞，用于随后给药到所述患者。
本发明还涉及一种转基因非人类动物，在其基因组中包含编码本发明的GAA蛋白的核酸分子或构建物。在特定实施方式中，所述动物是小鼠。
除了在下文实施例中呈现的特定递送系统之外，各种不同的递送系统是已知的，并且可用于给药本发明的核酸分子或构建物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达本发明的编码序列的重组细胞中，受体介导的胞吞作用，构建治疗性核酸作为反转录病毒或其他载体的一部分等。
根据一个实施方式，可能希望将本发明的嵌合GAA多肽、核酸分子、核酸构建物或细胞通过任何适合的途径引入到所述对象的肝脏中。除了裸露的DNA之外，可以将例如微环和转座子用于慢病毒载体的递送。此外，基因编辑技术例如锌指核酸酶、巨核酸酶(meganuclease)、TALEN和CRISPR，也可用于递送本发明的编码序列。
本发明还提供了包含本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞的药物组合物。这些组合物包含治疗有效量的所述治疗剂(本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞)和可药用载体。在特定实施方式中，术语“可药用的”意味着由联邦或州政府的监管机构批准或列于美国或欧洲药典或其他公认的药典中，用于在动物和人类中使用的。术语“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或介质，所述治疗剂与它们一起给药。这些药用载体可以是无菌液体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物被静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是对于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
如果需要，所述组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释剂等的形式。口服配方可以包含标准的载体例如制药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例描述在E.W.Martin的《Remington制药学》(Remington's PharmaceuticalSciences)中。这些组合物应该含有治疗有效量的所述治疗剂、优先是采取纯化形式的治疗剂，以及适合量的载体以便提供适合于给药到所述对象的形式。在特定实施方式中，本发明的核酸、载体或细胞被配制在包含磷酸盐缓冲盐水并增补有0.25％人血清白蛋白的组合物中。在另一个特定实施方式中，本发明的核酸、载体或细胞被配制在包含林格乳酸盐溶液和以总组合物的重量计终浓度为0.01-0.0001％、例如浓度为0.001％的非离子型表面活性剂例如pluronic F68的组合物中。所述制剂还可以包含血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，例如0.25％的人血清白蛋白。其他适用于储存或给药的制剂在本领域中是已知的，特别是从WO 2005/118792或Allay等，2011。
在优选实施方式中，所述组合物按照常规程序配制成适合于静脉内给药到人类的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在必要时，所述组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂例如利诺卡因，以缓解注射位点处的疼痛。
在一个实施方式中，本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞可以在囊泡、特别是脂质体中递送。在另一个实施方式中，本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞可以在受控释放系统中递送。
本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞的给药方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。在特定实施方式中，所述给药通过静脉内或肌肉内途径。本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞，不论是否被载体化，都可以通过任何方便的途径给药，例如通过输注或快速浓注，通过经上皮或粘膜衬(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其他生物活性药剂一起给药。给药可以是系统性或局部的。
在特定实施方式中，可能希望将本发明的药物组合物局部给药到需要治疗的区域，例如肝脏。这可以例如利用植入物来实现，所述植入物是多孔、无孔或胶状材料，包括膜例如硅橡胶膜或纤维。
在糖原贮积病的治疗中有效的本发明的治疗剂(即本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞)的量可以通过标准的临床技术来确定。此外，可以任选地使用体内和/或体外测定法来帮助预测最适剂量范围。在所述制剂中使用的精确剂量也取决于给药途径和疾病的严重性，并且应该根据执业医师的判断和每位患者的情况来决定。本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞的给药到需要它们的对象的剂量将随着几种因素而变，包括但不限于给药途径、治疗的具体疾病、对象的年龄或获得治疗效果所必需的表达水平。本领域技术人员可以在本领域知识的基础上，容易地根据这些因素和其他因素确定所需的剂量范围。在治疗包括向对象给药病毒载体例如AAV载体的情况下，所述载体的典型剂量为至少1x108个载体基因组每千克体重(vg/kg)，例如至少1x109 vg/kg、至少1x1010vg/kg、至少1x1011 vg/kg、至少1x1012 vg/kg、至少1x1013 vg/kg或至少1x1014 vg/kg。
本发明还涉及一种用于治疗糖原贮积病的方法，所述方法包括向需要的对象递送治疗有效量的本发明的核酸、载体、嵌合多肽、药物组合物或细胞的步骤。
本发明还涉及一种用于治疗糖原贮积病的方法，所述方法不诱导针对所述转入基因(即针对本发明的嵌合GAA多肽)的免疫应答，或诱导针对所述转入基因的降低的免疫应答，所述方法包括向需要的对象递送治疗有效量的本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、药物组合物或细胞的步骤。本发明还涉及一种用于治疗糖原贮积病的方法，所述方法包括向需要的对象重复给药治疗有效量的本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、药物组合物或细胞。在这种情况下，本发明的核酸分子或核酸构建物包含在肝细胞中有功能的启动子，从而允许从其产生针对所表达的嵌合GAA多肽的免疫耐受性。同样地，在这种情况下，在这种情形中使用的药物组合物包含的核酸分子或核酸构建物包含在肝细胞中有功能的启动子。在递送肝细胞的情况下，所述细胞可以是以前从所述需要治疗的对象收集并通过在其中引入本发明的核酸分子或核酸构建物进行工程化改造从而使它们能够生产本发明的嵌合GAA多肽的细胞。根据一个实施方式，在包含重复给药的情况下，所述给药可以重复至少一次或更多次，并且甚至可以被认为按照定期时间表进行，例如每周、每月或每年一次。所述定期时间表也可以包括每2、3、4、5、6、7、8、9或10年或超过10年给药一次。在另一个特定实施方式中，本发明的病毒载体的每次给药，对于每次连续的给药来说使用不同的病毒来进行，从而避免由于针对以前给药的病毒载体的可能免疫应答而造成的功效降低。例如，第一次给药可以使用包含AAV8衣壳的病毒载体，然后给药包含AAV9衣壳的载体或甚至给药与AAV无关的病毒例如反转录病毒或慢病毒载体。
本发明还涉及一种用于治疗糖原贮积病的方法，所述方法不诱导针对所述转入基因(即针对本发明的嵌合GAA多肽)的免疫应答，或诱导针对所述转入基因的降低的免疫应答，所述方法包括向需要的对象递送治疗有效量的本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、药物组合物或细胞的步骤。所述转入基因可用于产生高水平的GAA蛋白，并提供治疗益处例如避免求助于免疫抑制性治疗，允许低剂量的免疫抑制性治疗，和允许向需要的对象重复给药本发明的核酸分子。因此，在GAA蛋白诱导免疫应答或GAA表达和/或活性缺乏的情况下或高水平的GAA表达可以改善疾病例如对于糖原贮积病来说的情况下，本发明的核酸分子是特别令人感兴趣的。本发明还涉及一种用于治疗糖原贮积病的方法，所述方法包括向需要的对象重复给药治疗有效量的本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、药物组合物或细胞。在这种情况下，本发明的核酸分子或核酸构建物包含在肝细胞中有功能的启动子，从而允许从其产生针对所表达的嵌合GAA多肽的免疫耐受性。同样地，在这种情况下，在这种情形中使用的药物组合物包含的核酸分子或核酸构建物包含在肝细胞中有功能的启动子。在递送肝细胞的情况下，所述细胞可以是以前从所述需要治疗的对象收集并通过在其中引入本发明的核酸分子或核酸构建物进行工程化改造从而使它们能够生产本发明的嵌合GAA多肽的细胞。根据一个实施方式，在包含重复给药的情况下，所述给药可以重复至少一次或更多次，并且甚至可以被认为按照定期时间表进行，例如每周、每月或每年一次。所述定期时间表也可以包括每2、3、4、5、6、7、8、9或10年或超过10年给药一次。在另一个特定实施方式中，本发明的病毒载体的每次给药，对于每次连续的给药来说使用不同的病毒来进行，从而避免由于针对以前给药的病毒载体的可能免疫应答而造成的功效降低。例如，第一次给药可以使用包含AAV8衣壳的病毒载体，然后给药包含AAV9衣壳的载体或甚至给药与AAV无关的病毒例如反转录病毒或慢病毒载体。
根据本发明，治疗可以包括治愈、缓解或预防作用。因此，治疗性和预防性治疗包括特定糖原贮积病的症状的改善或阻止或以其他方式降低发生特定糖原贮积病的风险。术语“预防性”可以被认为是降低特定病症的严重性或发生率。“预防性”还包括在以前被诊断为患有特定病症的患者中阻止所述病症的复发。“治疗性”也可以降低现有病症的严重性。术语“治疗”在本文中用于指称可以有益于动物、特别是哺乳动物、更特别是人类对象的任何方案。
本发明还涉及一种用于治疗糖原贮积病的离体基因治疗方法，所述方法包括将本发明的核酸分子或核酸构建物引入到需要治疗的患者的分离的细胞例如分离的造血干细胞中，并将所述细胞引入到所述需要治疗的患者中。在这种情况的特定实施方式中，将所述核酸分子或构建物用如上所定义的载体引入到所述细胞中。在特定实施方式中，所述载体是整合型病毒载体。在另一个特定实施方式中，所述病毒载体是反转录病毒载体例如慢病毒载体。例如，在van Til等，2010,Blood,115(26),p.5329中所公开的慢病毒载体可用于本发明的方法的实践中。
本发明还涉及本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞，其用作药物。
本发明还涉及本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞，其用于治疗由GAA基因中的突变引起的疾病的方法中，特别是用于治疗庞贝氏病的方法中。本发明还涉及本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞，其用于治疗糖原贮积病的方法中，所述糖原贮积病例如为GSDI(冯·吉尔克氏病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里氏病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和心脏的致死性先天性糖原贮积病，更特别是GSDI、GSDII或GSDIII，甚至更特别是GSDII和GSDIII，最特别是GSDII。本发明的嵌合GAA多肽可以被给药到需要的患者，用于酶替代疗法(ERT)中，例如用于一种糖原贮积病例如GSDIII(科里氏病)但也用于GSD-IV、-VI、-IX、-XI和由AMP活化的蛋白质激酶γ亚基2缺陷引起的心脏糖原病的酶替代疗法中。
本发明还涉及本发明的核酸分子、核酸构建物、载体、嵌合GAA多肽或细胞在制造药物中的用途，所述药物可用于治疗糖原贮积病例如GSDI(冯·吉尔克氏病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里氏病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和心脏的致死性先天性糖原贮积病，更特别是GSDI、GSDII或GSDIII，甚至更特别是GSDII和GSDIII，最特别是GSDII。
实施例
通过参考下面的实验实施例和附图，对本发明进行更详细地描述。提供这些实施例仅仅是出于说明的目的，并且不打算是限制性的。
材料和方法
GAA活性
在将冷冻的组织样品在蒸馏水中匀浆后测量GAA活性。称出50-100mg组织并匀浆，然后以10000x g离心20分钟。在96孔板中，使用10μl上清液和20μl底物4MUα-D-葡萄糖苷设置反应。将所述反应混合物在37℃温浴1小时，然后通过添加150μl pH 10.5的碳酸钠缓冲液终止反应。使用EnSpireα读板器(Perkin-Elmer)在449nm(发射)和360nm(激发)下，使用标准曲线(0-2500pmol/μl的4MU)来测量从各个反应混合物释放的荧光4MU。所述澄清的上清液的蛋白质浓度通过BCA(Thermo Fisher Scientific)来定量。为了计算GAA活性，用释放的4MU浓度除以样品的蛋白质浓度，并将活性以nmol/小时/mg蛋白为单位报告。
结果
为了提高人类GAA(hGAA)的分泌，我们将序列优化过的转入基因与源自于在肝中高度分泌的蛋白质的信号肽组合。我们比较了5种不同的构建物：
1.pAAV-LSP-sp1-hGAA：在由α1-微球蛋白增强子和甲状腺素结合性球蛋白启动子构成的肝特异性启动子(LSP)的转录控制之下表达带有野生型信号肽(sp1)的人类GAA的质粒。
2.pAAV-LSP-sp2-hGAA：在所述LSP的转录控制之下表达带有人类α-1-抗胰蛋白酶信号肽(sp2)的人类GAA的质粒。
3.pAAV-hAAT-sp1-hGAAco1：在人类α-1-抗胰蛋白酶载脂蛋白E肝细胞控制区增强子(hAAT)启动子的转录控制之下表达带有本源信号肽sp1的hGAA的序列优化过的版本(hGAAco1)的质粒。
4.pAAV-hAAT-sp2-hGAAco1：在hAAT启动子的转录控制之下表达带有α-1-抗胰蛋白酶信号肽sp2的hGAA的序列优化过的版本(hGAAco1)的质粒。
5.pAAV-hAAT-sp2-hGAAco2：在hAAT启动子的转录控制之下表达带有α-1-抗胰蛋白酶信号肽sp2的hGAA的不同的序列优化过的版本(hGAAco2)的质粒。
将野生型hGAA序列的1-27位氨基酸(在这里被定义为sp1)用人类α-1-抗胰蛋白酶的序列(NP_000286.3)的1-24位氨基酸(在这里被定义为sp2)代替。按照两种不同算法对hGAA序列进行优化(分别产生序列co1和co2)。我们首先在体外评估了上述前四种构建物的hGAA分泌效率。将质粒转染到Huh-7细胞这种肝细胞瘤来源的细胞株中。在转染后48小时，我们测量培养基中的hGAA活性。数据表明向野生型hGAA序列添加sp2信号肽不改变它的分泌模式。令人吃惊的是，当将同样的策略应用于优化过的hGAA序列时，我们观察到统计学显著的分泌增加(图1)。这些数据表明，高效信号肽与序列优化的组合提高hGAA的分泌。
然后我们在体外比较了使用两种优化的hGAA序列获得的hGAA分泌水平。我们用表达野生型hGAA或与sp2信号肽融合的按照两种不同算法序列优化过的hGAA(分别为co1和co2)的质粒转染Huh-7细胞。在转染后48小时，我们测量培养基中的hGAA水平。我们在用表达hGAA的质粒转染的细胞的培养基中观察到hGAA水平提高。令人吃惊的是，带有与sp2融合的优化的hGAA的两种构建物在培养基中显示出hGAA分泌的显著提高。在这两种构建物之间没有观察到显著差异(p＝0.187)。这些数据表明高效信号肽与两种不同优化序列的组合提高hGAA的分泌。值得注意的是，尽管所述两种优化的序列在GC含量、可选开放阅读框、可选拼接位点和CAI方面具有不同的特征，但它们在体外显示出相似的效能(表1)。
表1.优化的序列的描述。此表说明了两种hGAA优化序列与野生型的特征的比较。a)密码子适应指数和b)GC含量使用稀有密码子分析工具来计算(http://www.genscript.com)。c)和d)分别是在5’至3’(aORF5'→3')和3’至5’(aORF 3'→5')链上计算的可选开放阅读框。e)和f)分别是使用拼接位点在线预测工具计算的受体(SA)和供体(SD)拼接位点(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)。g)和h)分别是针对野生型(wt)和优化的co1序列计算的百分同一性。i)CpG岛使用MethDB在线工具计算(http://www.methdb.de/links.html)。CpG岛是长度超过100bp、GC含量>60％并且观察/预期比率>0.6的序列。
此外，试验了使用我们的载体的肝转导是否诱导针对转入基因的体液应答。将小鼠用在肝特异性启动子的转录控制之下表达与sp2融合的hGAAco1或hGAAco2的AAV8载体静脉内注射。用在组成性启动子(CAG，鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子)的转录控制之下表达hGAAco的AAV9肌肉内注射的小鼠显示出非常高水平的特异性针对hGAA转入基因的总IgG，而在肝脏中表达同一蛋白的载体显示出对所述hGAA转入基因较低的体液应答水平。这些数据表明转入基因在肝脏中的表达对于诱导外周耐受性来说是基础性的。它们提供了高度可分泌的hGAA转入基因与它们的野生型对应物相比免疫原性更低的指示。

Claims (13)

1.一种核酸分子，其编码功能性嵌合GAA多肽，所述功能性嵌合GAA多肽包含融合到功能性GAA多肽的人类α-1-抗胰蛋白酶蛋白的信号肽，例如具有SEQ ID NO：4中示出的氨基酸序列的信号肽，其中所述功能性GAA多肽由与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少85％同一性、优选地至少90％同一性的核苷酸序列编码。
2.权利要求1的核酸分子，其中编码所述功能性GAA多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
3.一种核酸构建物，其包含权利要求1或2的核酸分子，所述核酸构建物是包含可操作连接到启动子例如优选地选自α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、甲状腺素运载蛋白启动子、白蛋白启动子和甲状腺素结合性球蛋白(TBG)启动子的肝特异性启动子的所述核酸分子的表达盒，其中所述核酸构建物任选地还包含内含子，特别是选自人类β球蛋白b2(或HBB2)内含子、FIX内含子和鸡β-球蛋白内含子的内含子，其中所述内含子任选地是修饰的内含子例如SEQ ID NO：8的修饰的HBB2内含子、SEQ ID NO：10的修饰的FIX内含子或SEQ ID NO：12的修饰的鸡β-球蛋白内含子。
4.权利要求3的核酸构建物，其优选地以下述顺序包含：增强子；内含子；启动子，特别是肝特异性启动子；编码所述嵌合GAA多肽的核酸分子；以及多腺苷化信号。
5.权利要求4的核酸构建物，其优选地以下述顺序包含：ApoE控制区；HBB2内含子，特别是修饰的HBB2内含子；hAAT启动子；编码所述嵌合GAA多肽的核酸分子；以及牛生长激素多腺苷化信号；所述核酸构建物更特别地包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的核苷酸序列。
6.一种载体，其包含权利要求1至5任一项的核酸分子或核酸构建物，所述载体特别是病毒载体，优选为AAV载体或反转录病毒载体例如慢病毒载体。
7.权利要求6的载体，其是单链或双链自身互补的AAV载体，优选为具有AAV来源的衣壳例如AAV1、AAV2、变体AAV2、AAV3、变体AAV3、AAV3B、变体AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、变体AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10例如AAVcy10和AAVrh10、AAVrh74、AAVdj、AAV-Anc80、AAV-LK03、AAV2i8和猪AAV例如AAVpo4和AAVpo6衣壳或具有嵌合衣壳的AAV载体。
8.权利要求7的载体，其中所述AAV载体具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳，更特别是AAV8衣壳。
9.一种细胞，其用权利要求1至2任一项的核酸分子、权利要求3至5任一项的核酸构建物或权利要求6至8任一项的载体转化，其中所述细胞特别是肝细胞或肌细胞。
10.一种嵌合GAA多肽，其由权利要求1或2的核酸分子编码。
11.一种药物组合物，其在可药用载体中包含权利要求1或2的核酸分子、权利要求3至5任一项的核酸构建物、权利要求6至8任一项的载体、权利要求9的细胞或权利要求10的嵌合GAA多肽。
12.权利要求1或2的核酸分子、权利要求3至5任一项的核酸构建物、权利要求6至8任一项的载体、权利要求9的细胞或权利要求10的嵌合GAA多肽，其用作药物。
13.权利要求1或2的核酸分子、权利要求3至5任一项的核酸构建物、权利要求6至8任一项的载体、权利要求9的细胞或权利要求10的嵌合GAA多肽，其用于治疗糖原贮积病的方法中，所述糖原贮积病优选为例如GSDI(冯·吉尔克氏病)、GSDII(庞贝氏病)、GSDIII(科里氏病)、GSDIV、GSDV、GSDVI、GSDVII、GSDVIII和心脏的致死性先天性糖原贮积病，更特别是GSDI、GSDII或GSDIII，甚至更特别是GSDII和GSDIII，最特别是GSDII。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
WO2018046774A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 Genethon Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof
MA50546A (fr) 2017-06-07 2020-09-16 Regeneron Pharma Compositions et méthodes pour l'internalisation d'enzymes
EP3648776A4 (en) * 2017-07-06 2021-04-07 The Medical College of Wisconsin, Inc. NEW IN VITRO AND IN VIVO ENRICHMENT STRATEGY TARGETING CHS-DERIVED LYMPHOCYTES TRANSDUCED BY A VECTOR FOR THE THERAPY OF DISORDERS
KR20210021310A (ko) * 2018-05-16 2021-02-25 스파크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 코돈-최적화된 산 알파-글루코시다제 발현 카세트 및 이를 사용하는 방법
CA3130525A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Giuseppe RONZITTI Hybrid promoters for muscle expression
WO2020223362A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-05 The Trustees Of The University Ofpennsylvania Compositions useful for treatment of pompe disease
CA3151442A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 Pasqualina COLELLA Sortilin receptor ligand based chimeric polypeptides and uses thereof
WO2021078834A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 Genethon Chimeric acid-alpha glucosidase polypeptides and uses thereof
CN112852881B (zh) * 2021-02-09 2023-08-15 南京贝思奥生物科技有限公司 利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法
CA3226119A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Giuseppe RONZITTI Hybrid promoters for gene expression in muscles and in the cns
WO2023164060A2 (en) * 2022-02-25 2023-08-31 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus for treating pompe disease with long term cessation of gaa enzyme replacement therapy
TW202403048A (zh) * 2022-03-18 2024-01-16 美商艾司科皮歐斯生物製藥有限公司 用於治療龐貝症之具有訊號肽修飾之以密碼子最佳化核酸編碼α-葡萄糖苷酶(GAA)之治療性腺相關病毒

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6858425B1 (en) 1998-12-04 2005-02-22 Genzyme Corporation Human acid alpha glucosidase gene and bovine alpha-S1 casein gene sequences
WO2004064750A2 (en) * 2003-01-22 2004-08-05 Duke University Improved constructs for expressing lysosomal polypeptides
EP3290513B1 (en) 2004-06-01 2022-09-07 Genzyme Corporation Compositions and methods to prevent aav vector aggregation
PT2318037E (pt) 2008-07-08 2015-05-20 Univ Duke Método de tratamento da doença de armazenamento de glicogénio
EP2483399B1 (en) * 2009-09-29 2019-03-27 Universiteit Gent Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose
PE20140617A1 (es) 2011-04-22 2014-05-28 Genzyme Corp Alfa glucosidasa acida modificada con procesamiento acelerado
AU2013243949A1 (en) * 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
WO2013151667A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides
ES2813558T3 (es) * 2012-06-19 2021-03-24 Univ Florida Composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades
WO2014130723A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of pompe disease
HUE047996T2 (hu) 2013-07-22 2020-05-28 Childrens Hospital Philadelphia AAV variáns és készítmények, eljárások és alkalmazások sejtekbe, szervekbe és szövetekbe történõ géntranszferhez
US11072801B2 (en) * 2014-01-21 2021-07-27 Vrije Universiteit Brussel Muscle-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof
DK3851537T3 (da) 2014-04-25 2024-03-18 Genethon Behandling af hyperbilirubinæmi
US10781459B2 (en) 2014-06-20 2020-09-22 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods of packaging multiple adeno-associated virus vectors
MA40791A (fr) * 2014-10-24 2017-09-27 Shire Human Genetic Therapies Ciblage lysosomal d'enzymes et utilisations associées
EP3293203A1 (en) 2016-09-12 2018-03-14 Genethon Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof
WO2018046774A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 Genethon Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof

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