CN116730910A - 一种联苯吡啶盐类化合物及其制备方法和作为荧光探针在检测微囊藻毒素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生态毒理研究技术领域，具体涉及一种联苯吡啶盐类化合物及其制备方法和作为荧光探针在检测微囊藻毒素(MC‑LR)中的应用。本发明提供的联苯吡啶盐类化合物，具有式I所示结构。本发明提供的式I所示结构联苯吡啶盐类化合物在微囊藻毒素存在的条件下，能够凭借分子结构中线型结构，通过氢键相互作用与微囊藻毒素的环状结构相互嵌合，从而改变式I所示结构联苯吡啶盐类化合物自身的光谱性质，表现出具有较强的荧光响应，从而通过荧光强度变化实现对水相中MC‑LR的检测；同时，采用本发明提供的式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物18BDQ能够实现对MC‑LR进行特异性检测，且操作方法简单，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生态毒理研究技术领域，具体涉及一种联苯吡啶盐类化合物及其制备方法和作为荧光探针在检测微囊藻毒素(MC-LR)中的应用。
背景技术
由水的富营养化引起的蓝藻水华已经对水体和水生生物造成严重的污染。在蓝藻毒素中，微囊藻毒素(MC-LR)是毒性最强的物质，微囊藻毒素广泛分布于湖泊中并威胁着人类赖以生存的环境。例如，微囊藻毒素(MC-LR)的摄入将引起肝病、生殖性疾病以及神经毒性。
现有的检测微囊藻毒素(MC-LR)的技术主要是通过高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫分析方法(ELISA)进行检测，但上述两种方法存在程序复杂、仪器昂贵的缺陷，限制了其实际应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种联苯吡啶盐类化合物及其制备方法和作为荧光探针在检测微囊藻毒素(MC-LR)中的应用，本发明提供的联苯吡啶盐类化合物能够作为荧光探针实现对水体中微囊藻毒素(MC-LR)的特异性检测，方法简单。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种联苯吡啶盐类化合物，具有式I所示结构：
本发明提供了上述技术方案所述式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将4-甲基吡啶和1-碘十八烷在有机溶剂中进行成盐反应，得到式II所示结构的中间体化合物；
将所述式II所示结构的中间体化合物和对苯基苯甲醛在有机溶剂中进行缩合反应，得到所述式Ⅰ所示结构的联苯吡啶盐类化合物。
优选的，所述4-甲基吡啶与所述碘十八烷的摩尔比为1：(1.0～1.25)。
优选的，所述成盐反应在加热回流的条件下进行，所述加热回流的温度为55～60℃，所述成盐反应的保温时间为4～6h；所述成盐反应在保护气体气氛中进行。
优选的，所述式II所示结构的中间体化合物与所述对苯基苯甲醛的摩尔比为1：(1.0～1.25)。
优选的，所述缩合反应在加热回流的条件下进行，所述加热回流的温度为80～90℃，所述缩合反应的保温时间为12～15h；所述缩合反应在保护气体气氛中进行。
优选的，所述缩合反应后得到缩合反应液，还包括：将所述缩合反应液去除有机溶剂后进行柱层析纯化，将得到的纯化洗脱液干燥，得到所示式I所述结构的联苯吡啶盐类化合物的纯品；所述柱层析纯化使用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为40～50:1。
本发明提供了上述技术方案所述的联苯吡啶盐类化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的联苯吡啶盐类化合物作为荧光探针在检测微囊藻毒素(MC-LR)中的应用。
优选的，所述应用为：检测水相中微囊藻毒素(MC-LR)的浓度。
本发明提供了一种联苯吡啶盐类化合物，具有式I所示结构。本发明提供的式I所示结构联苯吡啶盐类化合物(简称为18BDQ)在水相环境中具有弱的荧光信号；而在微囊藻毒素(MC-LR)存在的条件下，能够凭借分子结构中线型结构的特点，通过氢键相互作用与微囊藻毒素(MC-LR)的环状肽结构相互嵌合，从而改变式I所示结构联苯吡啶盐类化合物自身的光谱性质，表现出具有较强的荧光响应，响应倍数超过20倍，从而通过荧光强度变化实现对水相中MC-LR的检测；同时，本发明提供的式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物对MC-LR的识别机制在于MC-LR的环状结构与式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物的线型结构的“扦插”；由于水体内的其他有机分子无法实现此种特征的“扦插”，因此，采用本发明提供的式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物18BDQ能够实现对MC-LR进行特异性检测，且操作方法简单，具有广阔的应用前景。
本发明提供了上述技术方案所述式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物的制备方法，包括以下步骤：将4-甲基吡啶、碘十八烷和有机溶剂混合，进行成盐反应，得到式II所示结构的中间体化合物；将所述式II所示结构的中间体化合物、对苯基苯甲醛和有机溶剂混合，进行缩合反应，得到所述式Ⅰ所示结构的联苯吡啶盐类化合物。本发明提供的制备方法通过成盐反应和缩合反应，得到单子结构中的具有线性结构的联苯吡啶盐类化合物。本发明提供的制备方法简单，适宜工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例制备的化合物18BDQ的核磁共振(NMR)谱图；
图2为本发明实施例制备的化合物18BDQ的高分辨质谱图；
图3为本发明实施例制备的化合物18BDQ在不同MC-LR浓度条件下的荧光光谱图；
图4为图3中不同MC-LR浓度条件下对应荧光发射峰的变化趋势的拟合曲线图；
图5为本发明实施例制备的化合物18BDQ在水相环境中选择性实验的荧光光谱图；
图6为图5中不同离子条件下对应最高发射峰的柱状图；
图7为本发明实施例制备化合物18BDQ的反应流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种联苯吡啶盐类化合物，具有式I所示结构：
本发明提供的具有式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物，化合物结构中具有线性结构和联苯吡啶结构，其中的联苯吡啶结构作为发光基团；其中的线性结构能够通过氢键相互作用与微囊藻毒素(MC-LR)的环状肽结构相互嵌合改变式I所示结构联苯吡啶盐类化合物自身的光谱性质，表现出具有较强的荧光响应，响应倍数超过20倍，从而通过荧光强度变化实现对水相中MC-LR的检测。
本发明提供了上述技术方案所述式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物的制备方法，包括以下步骤：
将4-甲基吡啶和1-碘十八烷在有机溶剂中进行成盐反应，得到式II所示结构的中间体化合物；
将所述式II所示结构的中间体化合物和对苯基苯甲醛在有机溶剂中进行缩合反应，得到所述式Ⅰ所示结构的联苯吡啶盐类化合物。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明将4-甲基吡啶和碘十八烷在有机溶剂(以下称为第一有机溶剂)中进行成盐反应，得到式II所示结构的中间体化合物。
在本发明中，所述第一有机溶剂具体优选为乙醇。在本发明中，所述乙醇作为第一有机溶剂，乙醇对所述碘十八烷具有良好的溶解性，有利于所述成盐反应的顺利进行。
在本发明中，所述4-甲基吡啶与所述碘十八烷的摩尔比优选为1：(1.0～1.25)，更优选为1：(1.1～1.15)。
在本发明中，所述第一有机溶剂的体积与所述碘十八烷的物质的量之比优选为(40～60)mL：10mmol，更优选为(45～55)mL：10mmol。
在本发明中，所述成盐反应优选在加热回流的条件下进行，所述加热回流的温度优选为55～60℃，更优选为60℃。
在本发明中，所述成盐反应的保温时间优选为4～6h，更优选为4.5～5h。
在本发明中，所述成盐反应优选在保护气体气氛中进行，所述保护气体优选为氮气。
在本发明中，所述成盐反应后得到成盐反应液，本发明优选将所述成盐反应液去除溶剂后洗涤，得到式II所示结构的中间体化合物的粗品后，直接用于所述缩合反应，无需对所述式II所示结构的中间体化合物的粗品进行纯化。在本发明中，所述去除溶剂的具体实施方式优选为减压蒸发。在本发明中，所述洗涤使用的溶剂优选为乙醇。在本发明中，所述洗涤优选采用少量乙醇多次洗涤。
得到式II所示结构的中间体化合物后，本发明将所述式II所示结构的中间体化合物和对苯基苯甲醛在有机溶剂(以下称为第二有机溶剂)中进行缩合反应，得到所述式Ⅰ所示结构的联苯吡啶盐类化合物。
在本发明中，所述第二有机溶剂具体优选为乙醇。在本发明中，所述乙醇作为第二有机溶剂，乙醇对所述中间体化合物具有良好的溶解性，有利于所述缩合反应的顺利进行。
在本发明中，所述式II所示结构的中间体化合物与所述对苯基苯甲醛的摩尔比优选为1：(1.0～1.25)，更优选为1：(1.1～1.15)。
在本发明中，所述第二有机溶剂的体积与所述中间体化合物的物质的量之比优选为(40～60)mL：10mmol，更优选为(45～55)mL：10mmol。
在本发明中，所述缩合反应优选在加热回流的条件下进行，所述加热回流的温度优选为80～90℃，更优选为90℃。
在本发明中，所述缩合反应的保温时间优选为12～15h，更优选为12h。
在本发明中，所述缩合反应优选在保护气体气氛中进行，所述保护气体优选为氮气。
在本发明中，所述缩合反应后得到缩合反应液，本发明优选还包括：将所述缩合反应液去除有机溶剂后进行柱层析纯化，将得到的纯化洗脱液干燥，得到所示式I所述结构的联苯吡啶盐类化合物的纯品。在本发明中，所述去除溶剂的具体实施方式优选为减压蒸发。在本发明中，所述柱层析纯化使用的洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为40～50:1，更优选为50:1。在本发明中，所述干燥的温度优选为40℃。
本发明提供了上述技术方案所述的式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物作为荧光探针在检测微囊藻毒素(MC-LR)中的应用。
在本发明中，所述应用优选为：检测水相中所述微囊藻毒素(MC-LR)的浓度。
在本发明中，式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物检测水相中所述微囊藻毒素(MC-LR)的浓度的具体应用方法优选包括以下步骤：
将式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物和微囊藻毒素(MC-LR)的水相溶液混合混合，得到待测溶液；
测定所述待测溶液的荧光光谱，获得微囊藻毒素(MC-LR)的荧光发射峰强度，得到测定荧光发射峰强度值；
将所述测定荧光吸收峰强度值带入微囊藻毒素(MC-LR)浓度-荧光发射峰强度值标准曲线或标准方程中，得到所述微囊藻毒素的水相溶液的浓度。
本发明将式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物和微囊藻毒素(MC-LR)的水相溶液混合混合，得到待测溶液。在本发明中，所述微囊藻毒素(MC-LR)的水相溶液优选为0～110μM。
得到待测溶液后，本发明测定所述待测溶液的荧光光谱，获得微囊藻毒素(MC-LR)的荧光发射峰强度，得到测定荧光发射峰强度值。本发明优选在激发波长优选为380nm的条件下测定所述待测溶液的荧光光谱。
得到测定荧光发射峰强度值后，本发明将所述测定荧光发射峰强度值带入微囊藻毒素(MC-LR)浓度-荧光发射峰峰强度值标准曲线或标准方程中，得到所述微囊藻毒素(MC-LR)的水相溶液的浓度。
在本发明中，所述微囊藻毒素(MC-LR)浓度-荧光发射峰强度值标准曲线的获得方法优选包括以下步骤：
采用一系列已知浓度的微囊藻毒素(MC-LR)的水相溶液按照上述待测溶液的获得方法得到一系列已知微囊藻毒素(MC-LR)浓度的待测溶液；
测定所述一系列已知微囊藻毒素(MC-LR)浓度的待测溶液的荧光光谱，得到一系列荧光发射峰强度值；
以所述一系列已知浓度的微囊藻毒素(MC-LR)的水相溶液的微囊藻毒素(MC-LR)浓度为自变量，以对应的一系列荧光发射峰强度值为因变量，绘制微囊藻毒素(MC-LR)浓度-荧光发射峰强度值标准曲线。
在本发明的一个或多个具体实施例中，所述一系列已知浓度的微囊藻毒素(MC-LR)的水相溶液的摩尔浓度具体为0μM，5μM，10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，35μM，40μM，45μM，50μM，55μM，60μM，65μM，70μM，80μM，85μM，90μM，95μM，100μM，110μM。
在本发明中，所述微囊藻毒素(MC-LR)浓度-荧光发射峰强度值标准方程的获得方法优选包括以下步骤：将微囊藻毒素(MC-LR)浓度-荧光发射峰强度值标准曲线进行线性模拟，得到所述微囊藻毒素(MC-LR)浓度-荧光发射峰强度值标准方程。
在本发明中，所述标准方程为式1所示：
y＝25.5520x+65.9486式1，R2＝0.9656；
式1中，y为荧光峰，x为微囊藻毒素(MC-LR)浓度。
本发明提供的联苯吡啶盐类化合物的分子结构中线形的结构特点与MC-LR的大环结构相嵌合从而实现对微囊藻毒素(MC-LR)的特异性检测。这类检测是在微囊藻毒素(MC-LR)的存在下通过改变联苯吡啶盐类化合物自身的光谱性质而实现。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按照图7所示反应流程图制备：将碘十八烷(3.84g,10.0mmol)溶于乙醇(EtOH，60mL)中，搅拌溶解，向混合物中加入4-甲基吡啶(1.0g,10.0mmol)，在氮气作为保护气的条件下于60℃回流反应6h，反应的到淡黄色体系；反应结束后在减压条件下蒸干溶剂得到淡黄色固体，用少量乙醇洗涤多次得到式II所示结构的中间体化合物，该中间体由于纯度较高可以直接用于下一步反应。
将中间体(1.05g,3.0mmol)和对苯基苯甲醛(0.6g,3.0mmol)溶于乙醇中(EtOH,60mL)，在氮气保护条件下90摄氏度回流12h反应体系变为红褐色，所述反应结束后，本发明优选溶剂乙醇在负压条件下蒸干，使用柱层析法对反应进行提纯，洗脱剂为二氯甲烷与甲醇，二氯甲烷与甲醇的体积比例为50：1，最终得到红褐色固体为具有式I所示结构的荧光探针(简称为18BDQ)。收率为35％。
本实施例制备的式1所示结构的联苯吡啶盐类化合物的核磁共振数据为：
H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.95(dd,J＝42.4,6.5Hz,2H),8.29(d,J
＝6.4Hz,2H),8.11(d,J＝16.3Hz,1H),7.89–7.74(m,4H),7.71–7.56(m,2H),7.51(t,J＝7.6Hz,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),4.51(q,J＝6.7,6.2Hz,2H),1.91(p,J＝7.7Hz,2H),1.22(s,30H),0.84(t,J＝6.8Hz,3H).
图1为化合物18BDQ的核磁共振(NMR)谱图，图2为化合物18BDQ的高分辨质谱图。由图1与图2可知，本实施例制备的目标产物确实为化合物18BDQ。
测试例1
对实施例1制备的化合物18BDQ的溶剂化效应进行测定，具体如下：
将化合物18BDQ溶解于DMSO中，得到5mL浓度为2mM的18BDQ母液；分别取25μL的18BDQ母液加入5个相同的5mL容量瓶中，分别用DMF、乙腈、PBS缓冲液(pH值为7.2～7.4)、甲醇、DMSO和纯水。稀释定容，然后在激发波长380nm条件下进行荧光检测。
化合物18BDQ在有机相的最大发射峰和在水相中最大发射峰均出现在5nm左右。
测试例2
将实施例1制备的化合物18BDQ溶解于DMSO中，得到5mL浓度为2mM的18BDQ母液。将MC-LR溶解于纯水中，得到浓度为0.5mM的MC-LR母液。分别取10μL的浓度为2mM的18BDQ母液加入21个相同的5mL离心管中，并分别添加0μL，20μL，40μL，80～440μL所述MC-LR母液，采用纯水定容至2mL，得到待测液，所述待测液中化合物18BDQ的浓度为10μM，MC-LR浓度为0～110μM；将各待测液在激发波长380nm条件下进行荧光检测。
图3为化合物18BDQ在水环境中不同MC-LR浓度下的荧光光谱图，由图3可知，在525nm处出现发射峰，且随着待测液中MC-LR浓度增加，荧光强度逐渐增强，这说明发明提供的化合物18BDQ能够实现对水环境中MC-LR的检测。
图4为图3中不同微囊藻毒素(MC-LR)浓度条件下对应最高发射峰的变化趋势图以及拟合曲线图。
测试例3
分析实施例1制备的化合物18BDQ的选择性。具体如下：
由图3当待测液中18BDQ浓度为10μM时，荧光强度随MC-LR浓度的升高而升高。在MC-LR浓度为90μM时达到平衡，因此选取了多种金属离子与氨基酸检测化合物18BDQ对MC-LR的选择性。具体操作为各金属离子(包括：Ba2+、Cr3+、K+、Mg2+、Na+、Zn2+)、氨基酸(Ala、Arg、Cys、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Try、Val)浓度均为90μM；化合物18BDQ浓度为10μM的待测液，在激发波长为380nm条件下进行荧光检测。图5为18BDQ在不同溶液中荧光光谱图。由图5可知在525nm处出现发射峰值，且18BDQ与MC-LR的响应峰值远远高于与金属离子和氨基酸的响应值。说明化合物18BDQ对MC-LR具有良好的选择性。图6为图5中不同溶液对应最大峰值的柱状图。更加清晰反应化合物18BDQ对MC-LR的选择性。
由以上测试例可知，本发明提供的荧光探针能够在水相中检测MC-LR，而且具有优良的选择性。操作方法简单，具有广阔的应用前景。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种联苯吡啶盐类化合物，其特征在于，具有式I所示结构：
2.权利要求1所述式I所示结构的联苯吡啶盐类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将4-甲基吡啶和1-碘十八烷在有机溶剂中进行成盐反应，得到式II所示结构的中间体化合物；
将所述式II所示结构的中间体化合物和对苯基苯甲醛在有机溶剂中进行缩合反应，得到所述式Ⅰ所示结构的联苯吡啶盐类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述4-甲基吡啶与所述碘十八烷的摩尔比为1：(1.0～1.25)。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述成盐反应在加热回流的条件下进行，所述加热回流的温度为55～60℃，所述成盐反应的保温时间为4～6h；所述成盐反应在保护气体气氛中进行。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述式II所示结构的中间体化合物与所述对苯基苯甲醛的摩尔比为1：(1.0～1.25)。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，所述缩合反应在加热回流的条件下进行，所述加热回流的温度为80～90℃，所述缩合反应的保温时间为12～15h；所述缩合反应在保护气体气氛中进行。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述缩合反应后得到缩合反应液，还包括：将所述缩合反应液去除有机溶剂后进行柱层析纯化，将得到的洗脱液干燥，得到所示式I所述结构的联苯吡啶盐类化合物的纯品；所述柱层析纯化使用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为40～50:1。
8.权利要求1所述的联苯吡啶盐类化合物或权利要求2～7任一项所述的制备方法制备得到的联苯吡啶盐类化合物作为荧光探针在检测微囊藻毒素中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为：检测水相中微囊藻毒素的浓度。
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