CN116716391A - Tbx5基因多态性位点检测心源性猝死的分子标记及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种TBX5基因多态性位点检测心源性猝死的分子标记及试剂盒，分子标记为TBX5基因的rs11278315位点，该位点插入或缺失碱基GTGGATCA，插入型指示心源性猝死发病风险高。本发明通过对TBX5基因的rs11278315位点的插入缺失多态性与心源性猝死表型相关性的研究，提供了一种与心源性猝死相关的多态性分子标记，并进一步提供了一种心源性猝死检测试剂盒，从而通过检测分析个体的TBX5基因上的rs11278315位点基因携带型来检测SCD易感性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种TBX5基因多态性位点检测心源性猝死的分子标记及试剂盒。
背景技术
心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)是指由心脏原因引起的突发性的非预料死亡，表现为短期内发生的突发意识丧失及循环、呼吸骤停。“短期”规定为有目击者情况下小于1小时内，无目击者时则为24小时。以往大量研究表明，SCD的死因多为冠状动脉粥样硬化性心脏病或致命性心律失常。前者多见于高龄人群，后者则多见于年轻人。考虑到死后的尸体解剖和组织学检查难以找到准确的死因，为了能准确诊断SCD，揭开SCD发生的分子机制、寻找SCD的遗传标记迫在眉睫。
过去针对SCD诊断领域的研究主要集中于对重要蛋白编码基因的编码区突变与猝死的关联性分析，然而相关的突变不仅数量有限，普通群体极低的基因频率难以完全解释相对而言较高的猝死发生率。随着全基因组关联研究及二代测序技术的发展，越来越多的遗传标记被发现参与SCD的调控。SCD遗传标记的识别能够进一步深入了解其潜在机制，优化SCD的风险分层，并为分子诊断和预防提供强有力的理论依据。考虑到基因非编码区存在多种功能元件以及其对基因表达起到重要的调控作用，我们把目光投向了这片区域内的遗传多态，通过病例对照研究分析相关基因中非编码区的遗传多态性与SCD的易感性之间的关联，为建立可用于SCD风险评估的基因多态性检测体系提供了可能。
T-box 5(TBX5)是T-box转录因子家族的成员，可通过与DNA直接相互作用调节转录，如能与一些心脏相关转录因子(如NKX2-5、GATA4等)相互作用协同激活靶基因，在心脏的发育和功能维持中具有多种作用。这种相互作用要求相关编码基因的高保真，任一转录因子的缺失及结构改变都可能导致不适当定位或激活失效。
心脏传导系统是心脏内心肌细胞的一个高度专业化的网络，在整个心脏内产生和传输电脉冲以协调收缩。有证据表明，Tbx5在心脏传导系统中起着三个关键作用:发育过程中传导系统的规范、传导系统转录组的调节和成人传导系统特性的维持。Tbx5是传导系统中关键离子通道Gja5(编码CX40)和Scn5a(编码GIRK4)的必需调节因子，成人心室传导系统中Tbx5的去除会导致这些离子通道的丢失和心室传导系统功能的改变。在TBX5敲除小鼠模型中出现心律失常的DCM和ICM心脏表达明显较低的CX43水平，这与人类心肌中观察到的现象一致。总的来说，TBX5调控对心脏发育及心脏生理功能维持至关重要，TBX5非编码区突变可能导致TBX5结构改变从而调控相关基因表达。另有研究表明TBX5位点显性突变与Holt-Oram综合征有关。Holt-Oram综合征表现为心脏间隔、心脏传导系统和前肢发育异常。然而，无心脏结构异常的患者也会发生心脏传导异常，提示TBX5基因突变可能从分子水平上影响心脏传导。
考虑TBX5在心脏发育和心血管疾病中的可能作用，其遗传变异与SCD易感性的相关性值得探索。现有技术中，并没有对rs11278315插入缺失多态与SCD相关性的研究报道，也没有通过检测TBX5基因下游500bp附近的插入缺失多态位点来预测SCD的易感性的相关报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明首次证实位于TBX5基因下游500bp的一个八碱基(GTGGATCA)插入缺失多态(rs11278315)与患SCD风险性存在显著性关联。
本发明的第一个目的是提供一种检测心源性猝死发病风险的插入缺失多态性分子标记，该分子标记为TBX5基因的rs11278315位点。
进一步地，所述rs11278315位点具有8个碱基的插入缺失多态，具体地，插入或缺失碱基GTGGATCA。
进一步地，插入型指示心源性猝死发病风险高，缺失型指示心源性猝死发病风险低。
本发明的第二个目的是提供一种TBX5基因插入缺失多态性位点在制备心源性猝死检测试剂盒中的应用，该试剂盒用于检测TBX5基因rs11278315位点的基因型。
进一步地，上述心源性猝死检测试剂盒中包括扩增TBX5基因rs11278315位点的引物对。
进一步地，扩增TBX5基因rs11278315位点的引物对包括有义引物和反义引物，有义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列信息如下：
SEQ ID NO.1：5′-ACTTTTCTTCTCCAGTGCCTAC-3′，
SEQ ID NO.2：5′-TCCATTGTCCTTGAGTGTGAT-3′。
进一步地，为便于识别，引物对上带有识别标记，如荧光标记。
上述引物对是针对TBX5基因上的rs11278315号插入缺失位点而设计，能特异性扩增出包含该插入缺失的片段，通过荧光标记技术将荧光染料标记在寡核苷酸引物的5′端，PCR扩增后产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。本领域技术人员可以理解，特异性引物对可用常规的合成技术合成，且本发明的引物不限于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2这对引物。
进一步地，有义引物的Tm值为56℃，反义引物的Tm值为53℃。
进一步地，心源性猝死检测试剂盒中还包括用于PCR扩增和毛细管电泳的组件。
进一步地，用于PCR扩增和毛细管电泳的组件包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液和去离子水。PCR扩增的产物通过毛细管电泳分离技术对该位点的基因型进行分析。
进一步地，本试剂盒的保存温度为-20℃。
本发明的第三个目的是提供一种扩增TBX5基因rs11278315位点的引物在制备心源性猝死检测试剂盒中的应用。
进一步地，扩增TBX5基因rs11278315位点的引物包括有义引物和反义引物，所述有义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第四个目的是提供一种基于TBX5基因插入缺失多态性的心源性猝死检测试剂盒，该试剂盒包括用于扩增TBX5基因rs11278315位点的引物，用于检测TBX5基因rs11278315位点的基因型。
本发明的原理为：发明人通过分子生物学研究发现TBX5基因下游500bp的一个插入缺失多态rs11278315的不同等位基因型可通过影响TBX5基因mRNA结构的稳定性，并可能作为调控元件与邻近基因的启动子交互，远距离调控邻近基因的转录活性；此外，通过一定规模人群的SCD病例对照研究发现，该插入缺失多态的插入型等位基因与SCD发生呈正相关，即使在调整年龄、性别等因素后，这种相关性仍然存在。因此认为这个插入缺失多态可用于评估个体患SCD的易感性。
本发明的第三个目的是提供一种扩增TBX5基因rs11278315位点的引物在制备心源性猝死检测试剂盒中的应用，该引物能够鉴定TBX5基因rs11278315位点的基因型，即通过该检测推断当个体携带插入型等位基因时其罹患SCD的风险将显著增高。
进一步地，扩增TBX5基因rs11278315位点的引物包括有义引物和反义引物，有义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列信息如下：
SEQ ID NO.1：5′-ACTTTTCTTCTCCAGTGCCTAC-3′，
SEQ ID NO.2：5′-TCCATTGTCCTTGAGTGTGAT-3′。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明所述试剂盒中包含的特异性引物对是针对TBX5基因上的rs11278315号插入缺失位点而设计，能特异性扩增出包含该位点的DNA片段并通过检测不同长度片段在毛细管电泳中的迁移率来识别不同基因型，结合病例对照研究发现，可认为被检测DNA的TBX5基因上的rs11278315号插入缺失位点携带有插入型等位基因者为SCD易感型。因此，该技术通过检测个体的TBX5基因上的rs11278315号插入缺失位点的基因型，可以起到预测个体SCD的易感性的作用。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为对照组与SCD病例组在该位点的基因频率差异与患病风险OR值；
图2为基因测序图示和SDS-PAGE凝胶电泳分型图示。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
使用血液基因组DNA提取系统(非离心柱型)提取外周血的基因组DNA。
步骤2：PCR反应-目的片段的复制
使用可检测SCD易感性的PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物：
SEQ ID NO.1：5′-ACTTTTCTTCTCCAGTGCCTAC-3′，Tm值为56℃
SEQ ID NO.2：5′-TCCATTGTCCTTGAGTGTGAT-3′，Tm值为53℃；
该引物对可特异性地扩增TBX5基因中包含rs11278315号插入缺失位点多态性的片段。
PCR反应体系总体积为10ul，中包括：1μl DNA模板，50μM特异性引物对两条各0.04μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.08μl；2.5mM dNTP混合液0.2μl；25mM MgCl2溶液0.6μl；10×PCR反应缓冲液1μl；去离子水补足；在Eppendorf Mastercycler nexus PCR扩增仪上进行反应，反应条件是：94℃3min；再进行30个PCR循环：94℃30s，59℃30s，72℃1min；最后72℃5min。
步骤3：插入缺失基因型分析
扩增结束后产物采用ABI 3500基因测序仪进行毛细管电泳分离从而得到检测个体的基因型，并由专业人员提供解释。
6、本发明的实验效果：
对照组与SCD病例组在该位点的基因频率差异与患病风险OR值见图1。
如图1所示，在共显性模型中，95％置信区间内，基因型为插入/缺失型个体发生SCD的风险是插入/插入型个体的0.67倍，基因型为缺失/缺失型个体发生SCD的风险是插入/插入型个体的0.30倍；隐性模型中，基因型为缺失/缺失型个体发生SCD的风险是插入/插入型或插入/缺失型个体的0.72倍；加性模型中，携带缺失型等位基因的个体发生SCD的风险是携带插入型等位基因个体的0.75倍。
基因测序图示和SDS-PAGE凝胶电泳分型图示见图2。
其中，图2A为模板链测序结果示例，下划线处对应编码链在rs11278315处的八碱基插入缺失；图2B为对12个来自不同个体的DNA样本使用本发明的PCR扩增体系得到产物电泳示意图，4、8、9为插入型纯合子，1、6、7、11为缺失型纯合子，其余为杂合子；“*”,DNAMarker。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种检测心源性猝死发病风险的插入缺失多态性分子标记，其特征在于：所述插入缺失多态性分子标记为TBX5基因的rs11278315位点，该位点插入或缺失碱基GTGGATCA。
2.根据权利要求1所述的插入缺失多态性分子标记，其特征在于：插入型指示心源性猝死发病风险高。
3.TBX5基因插入缺失多态性位点在制备心源性猝死检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述心源性猝死检测试剂盒用于检测TBX5基因rs11278315位点的基因型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述心源性猝死检测试剂盒中包括扩增TBX5基因rs11278315位点的引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：扩增TBX5基因rs11278315位点的引物包括有义引物和反义引物，所述有义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述扩增TBX5基因rs11278315位点的引物上带有识别标记。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述心源性猝死检测试剂盒中还包括用于PCR扩增和毛细管电泳的组件。
8.扩增TBX5基因rs11278315位点的引物在制备心源性猝死检测试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：扩增TBX5基因rs11278315位点的引物包括有义引物和反义引物，所述有义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反义引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
10.一种基于TBX5基因插入缺失多态性的心源性猝死检测试剂盒，其特征在于：所述心源性猝死检测试剂盒包括用于扩增TBX5基因rs11278315位点的引物，用于检测TBX5基因rs11278315位点的基因型。
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