CN116715636B - 一种阴离子-π型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学材料技术领域，特别涉及一种阴离子‑π型荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供了一种阴离子‑π型荧光探针，具有式I所示结构。本发明提供的荧光探针具有聚集诱导发光性质，在形成聚集体时，能够对癌细胞进行荧光成像；同时，本发明提供的荧光探针还具有活性氧产生能力，能够在光激发下产生I型超氧阴离子自由基，可用于光动力杀伤癌细胞。 式I。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学材料技术领域，特别涉及一种阴离子-π型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
虽然人类在预防和治疗癌症方面取得了重大进展，但癌症仍是严重威胁人类健康的重大疾病之一。光动力疗法（Photodynamic therapy, PDT）是通过光对光敏剂的激发使其产生活性氧物种（Reactive oxygen species, ROS）来杀死癌细胞，由于其非侵入性和光可控特性，是非常有效的个性化和精准治疗癌症的方法。荧光生物成像技术结合PDT治疗可同时实现癌症早期快速诊断和及时治疗，可有效提高早诊早治率，提高患者的存活率。
聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE）型光敏剂在聚集状态下分子内运动受到限制，非辐射减弱，辐射增强，具有荧光增强特性，同时聚集还能提高ROS产生效率，为光动力抗癌应用提供了新契机。
AIE型光敏剂用于癌症光诊疗已取得了一定的成果，但是，目前大多数AIE光敏剂分子存在靶向能力差，导致难以区分癌细胞和正常细胞的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种阴离子-π型荧光探针及其制备方法和应用，本发明提供的荧光探针靶向性强，可用于光动力杀伤癌细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种阴离子-π型荧光探针，具有式I所示结构；
式I；
式I中，CnH2n+1中n为0~16，CmH2m+1中m为0~16，且m不为0；
式I中，R为Br、Cl或I。
优选地，具有式1、式2或式3所示结构；
式1；/>式2；
式3。
本发明提供了上述阴离子-π型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
当n为0时，所述制备方法包括：
将2,4,6-三甲基碘苯和间氯过氧苯甲酸第一溶解后，进行氧化反应，所得氧化反应物料与苯甲醚、对甲苯磺酸混合，进行亲电取代反应，得到具有式II-1所示结构的第一中间产物；
式II-1；
将所述第一中间产物与偶氮苯和第一催化剂第二溶解后，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式III-1所示结构的第二中间产物；
式III-1；
将所述第二中间产物和三溴化硼第三溶解后，进行脱甲基反应，得到具有式IV-1所示结构的第三中间产物；
式IV-1； CmH2m+1R 式V-1；
将所述第三中间产物和具有式V-1所示结构的第一卤代烃第四溶解后，在保护气氛、第二催化剂和碱性化合物的条件下进行第一取代反应，得到n=0的阴离子-π型荧光探针，结构式如式V-2所示；
式V-2； CnH2n+1R 式V-3；
当n≥1时，所述制备方法还包括：
将具有式V-2结构的化合物V-2和具有式V-3所示结构的第二卤代烃、第二催化剂第五溶解后，在保护气氛下进行第二取代反应，得到所述阴离子-π型荧光探针。
优选地，所述2,4,6-三甲基碘苯和间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:0.5~3；所述氧化反应的温度为20 ~40 ℃，时间为30~60min。
优选地，所述2,4,6-三甲基碘苯、苯甲醚和对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.5~3:0.5~3，所述亲电取代反应温度为20 ~40 ℃，时间为1~3 h。
优选地，所述第一中间产物和偶氮苯的摩尔比为1:1~4，所述缩合反应的温度为60~80 ℃，时间为24~30 h。
优选地，所述第二中间产物与三溴化硼的摩尔比为1:2~6，所述脱甲基反应的温度为-20~0 ℃，时间为6~10 h。
优选地，所述第三中间产物与第一卤代烃的摩尔比为1:1~5；所述化合物V-1与第二卤代烃的摩尔比为1:1~5。
优选地，所述第一取代反应和第二取代反应的温度独立地为30 ~60 ℃，时间独立地为4~10 h。
本发明提供了上述阴离子-π型荧光探针在制备抗肿瘤药物或成像检测试剂中的应用。
本发明提供了一种阴离子-π型荧光探针，具有式I所示结构。本发明提供的荧光探针具有聚集诱导发光性质，在形成聚集态时，能够对癌细胞进行荧光成像；同时，本发明提供的荧光探针还具有活性氧产生能力，能够在光激发下产生I型超氧阴离子自由基，可用于光动力杀伤癌细胞。另外，正常细胞和癌细胞表面电势差存在差异，癌细胞具有更负的表面电势，阴离子-π相互作用赋予光敏剂固有正电荷，因此更容易通过静电相互作用与表面电势更负的癌细胞结合，从而提高靶向性。
本发明提供了上述兼具荧光成像和光动力杀伤癌细胞活性的阴离子-π型荧光探针的制备方法，此法步骤简单，易于操作，适合工业化生产。
附图说明
图1为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12与DPBC-2OC12在水溶液中的紫外吸收图；
图2为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12与DPBC-2OC12在水溶液中的荧光发射图；
图3为在二甲基亚砜和甲苯体系中，DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12与DPBC-2OC12的实时荧光强度与初始荧光强度的比值随甲苯体积分数增大的变化情况；
图4为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12与DPBC-2OC12在水溶液中与活性氧捕获剂DCFH混合溶液在538 nm处的实时荧光值与初始荧光值的比值随光照时间的变化情况；
图5为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12与DPBC-2OC12在水溶液中与超氧阴离子捕获剂DHR123混合溶液在530 nm处的实时荧光值与初始荧光值的比值随光照时间的变化情况；
图6为DPBC-OH-OC12对HeLa细胞进行共定位荧光成像分析测试；
图7为DPBC-OMe-OC12对HeLa细胞进行共定位荧光成像分析测试；
图8为DPBC-2OC12对HeLa细胞进行共定位荧光成像分析测试；
图9为DPBC-OMe-OC12与DPBC-2OC12在HeLa细胞内ROS成像；
图10为DPBC-OMe-OC12对HeLa细胞进行光动力杀伤分析测试。
具体实施方式
本发明提供了一种阴离子-π型荧光探针，具有式I所示结构；
式I；
式I中，CnH2n+1中n为0~16，CmH2m+1中m为0~16，且m不为0；
式I中，R为Br、Cl或I。
在本发明中，CnH2n+1和CmH2m+1中的n为0~16，m为0~16，且m不为0，优选为n=0~4，m=10~14，更优选为n=0~2，m=11~13。
在本发明中，所述阴离子-π型荧光探针优选具有式1，式2或式3所示结构；
式1；/>式2；
式3。
在本发明中，所述荧光探针具有聚集诱导发光性质，在形成聚集态时，能够对癌细胞进行荧光成像；同时，本发明提供的荧光探针还具有活性氧产生能力，能够在光激发下产生I型超氧阴离子自由基。
本发明提供了上述阴离子-π型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
当n为0时，所述制备方法包括：
将2,4,6-三甲基碘苯和间氯过氧苯甲酸第一溶解后，进行氧化反应，所得氧化反应物料与苯甲醚、对甲苯磺酸混合，进行亲电取代反应，得到具有式II-1所示结构的第一中间产物；
式II-1；
将所述第一中间产物与偶氮苯和第一催化剂第二溶解后，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式III-1所示结构的第二中间产物；
式III-1；
将所述第二中间产物和三溴化硼第三溶解后，进行脱甲基反应，得到具有式IV-1所示结构的第三中间产物；
式IV-1；CmH2m+1R 式V-1；
将所述第三中间产物和具有式V-1所示结构的第一卤代烃第四溶解后，在保护气氛、第二催化剂和碱性化合物的条件下进行第一取代反应，得到n=0的阴离子-π型荧光探针，结构式如式V-2所示；
式V-2； CnH2n+1R 式V-3；
当n≥1时，所述制备方法还包括：
将具有式V-2结构的化合物V-2和具有式V-3所示结构的第二卤代烃、第二催化剂第五溶解后，在保护气氛下进行第二取代反应，得到所述阴离子-π型荧光探针。
在本发明中，当n为0时，制备方法包括以下步骤：
本发明将2,4,6-三甲基碘苯和间氯过氧苯甲酸第一溶解后，进行氧化反应，所得氧化反应物料与苯甲醚、对甲苯磺酸混合，进行亲电取代反应，得到具有式II-1所示结构的第一中间产物。
在本发明中，所述第一溶解的有机溶剂优选2,2,2-三氟乙醇和二氯甲烷。在本发明中，对所述第一溶解的有机溶剂的用量不作具体限定，能够溶解反应原料即可。在本发明中，所述2,4,6-三甲基碘苯和间氯过氧苯甲酸的摩尔比优选为1:0.5~3，更优选为1:1。
在本发明中，所述氧化反应的温度优选为20~40 ℃，更优选为30 ℃；时间优选为30~60 min，更优选为45 min。
在本发明中，所述2,4,6-三甲基碘苯、苯甲醚和对甲苯磺酸的摩尔比优选为1:0.5~3:0.5~3，更优选为1:1:1。
在本发明中，所述亲电取代反应的温度优选为20~40 ℃，更优选为30 ℃；时间优选为1~3 h，更优选为2 h。
在本发明中，亲电取代反应后，优选还包括将所述亲电取代反应所得料液进行抽滤，抽滤所得固相进行乙醚洗涤。在本发明中，所述乙醚洗涤的次数优选≥3。
得到第一中间产物后，本发明将所述第一中间产物与偶氮苯和第一催化剂第二溶解后，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式III-1所示结构的第二中间产物。
在本发明中，所述第一催化剂优选为[(Cp*IrCl2)2]、AgSbF6和Ag2CO3。在本发明中，所述第二溶解的试剂优选为三氟乙醇。在本发明中，对所述第二溶解的试剂的用量不作具体限定，能够将第一中间产物、偶氮苯溶解即可。在本发明中，所述保护气氛优选为氮气。
在本发明中，所述第一中间产物、[(Cp*IrCl2)2]、AgSbF6和Ag2CO3的摩尔比优选为5：0.05：0.2:4。在本发明中，所述第一中间产物和偶氮苯的摩尔比优选为1:1~4，更优选为1:2.5。
在本发明中，所述缩合反应的温度优选为60~80 ℃，更优选为80 ℃；时间优选为24~30 h，更优选为24 h。
在本发明中，缩合反应后，优选还包括将所述缩合反应所得料液进行硅藻土过滤，所得滤液依次进行二氯甲烷洗涤、浓缩和硅胶柱层析，硅胶柱层析所得洗脱液重结晶，得到第二中间产物。在本发明中，所述二氯甲烷洗涤的次数优选≥3。在本发明中，对所述浓缩不作具体限定，采用本领域技术人员熟知的操作即可，例如：旋蒸。在本发明中，所述硅胶柱层析的洗脱剂优选为体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇的混合液。
得到第二中间产物后，本发明将所述第二中间产物和三溴化硼第三溶解后，进行脱甲基反应，得到具有式IV-1所示结构的第三中间产物。
在本发明中，所述第三溶解的有机溶剂优选二氯甲烷，更优选为超干二氯甲烷。在本发明中，对所述溶解的有机溶剂的用量不作具体限定，能够溶解反应原料即可。在本发明中，所述第二中间产物与三溴化硼的摩尔比优选为1:2~6，更优选为1:4。
在本发明中，所述脱甲基反应的温度优选为-20 ~0 ℃，更优选为-20 ℃；时间优选为6~10 h，更优选为8 h。
在本发明中，所述脱甲基反应结束时，优选用甲醇猝灭未反应的三溴化硼。在本发明中，脱甲基反应后，优选还包括将脱甲基反应所得料液依次进行浓缩和硅胶柱层析，硅胶柱层析所得洗脱液浓缩去除溶剂后，得到第三中间产物。在本发明中，所述硅胶柱层析的洗脱剂优选为体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇的混合液。
得到第三中间产物后，本发明将所述第三中间产物和具有式V-1所示结构的第一卤代烃第四溶解后，在保护气氛、第二催化剂和碱性化合物的条件下进行第一取代反应，得到n=0的阴离子-π型荧光探针，结构式如式V-2所示。
在本发明中，所述第一卤代烃的结构式为CmH2m+1R 式V-1；式V-1中，R为Br、Cl或I。具体地，所述第二卤代烃优选为十二烷基溴。
在本发明中，所述第四溶解的溶剂优选为乙腈和水。在本发明中，所述乙腈和水的体积比优选为1:1。在本发明中，所述第二催化剂优选为碳酸铯。在本发明中，所述碱性化合物包括碳酸钾；在本发明中，所述第三中间产物与第一卤代烃的摩尔比优选为1:1~5，更优选为1:2。在本发明中，所述第三中间产物和第二催化剂的摩尔比优选为5:1。在本发明中，所述第三中间产物和碱性化合物的摩尔比优选为1:4。
在本发明中，所述第一取代反应的温度优选为30 ~60 ℃，更优选为60 ℃；时间优选为4~10 h，更优选为8 h。
在本发明中，所述第一取代反应后，优选还包括将所述第一取代反应所得料液依次进行过滤、浓缩和萃取，萃取所得有机相依次进行硅胶柱层析、洗脱液浓缩。在本发明中，对所述过滤不作具体限定，采用本领域技术人员常用的操作方式将催化剂过滤去除即可。在本发明中，所述萃取的试剂优选为二氯甲烷。在本发明中，所述硅胶柱层析的洗脱剂优选为体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇的混合液。
当n≥1时，所述制备方法优选还包括：
将将具有式V-2结构的化合物V-2和具有式V-3所示结构的第二卤代烃、第二催化剂第五溶解后，在保护气氛下进行第二取代反应，得到所述阴离子-π型荧光探针；CnH2n+1R式V-3。
在本发明中，所述第五溶解的有机溶剂优选为乙腈。在本发明中，对所述第六溶剂的有机溶剂的用量不作具体限定，能够将化合物V-2、第二卤代烃溶解即可。在本发明中，所述第二卤代烃的结构式优选为CnH2n+1R。具体地，所述第二卤代烃优选为十二烷基溴或碘甲烷。
在本发明中，所述化合物V-2和第二卤代烃的摩尔比优选为1:1~5，更优选为1:2。在本发明中，所述化合物V-2和第二催化剂的摩尔比优选为1:4~5，更优选为1:4~4.5。
在本发明中，所述第二取代反应的温度优选为30 ~60 ℃，更优选为60 ℃，时间优选为4~10 h，更优选为8 h。
在本发明中，所述第二取代反应后，优选还包括将所述第二取代反应所得料液依次进行过滤、浓缩和萃取，萃取所得有机相依次进行硅胶柱层析、洗脱液浓缩。在本发明中，对所述过滤不作具体限定，采用本领域技术人员常用的操作方式将催化剂过滤去除即可。在本发明中，所述萃取的试剂优选为二氯甲烷。在本本发明中，所述萃取优选为用二氯甲烷对反应液中的水相进行多次萃取，每次萃取所用二氯甲烷与水的体积比优选为1:1。在本发明中，所述硅胶柱层析的洗脱剂优选为体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇的混合液。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，如旋蒸。
本发明优选使用TLC板对反应监控各步反应进程。
本发明还提供了上述阴离子-π型荧光探针或上述制备方法制备得到的阴离子-π型荧光探针在抗肿瘤药物或抗肿瘤诊断试剂中的应用。
在本发明中，所述肿瘤优选为乳腺肿瘤细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、膀胱癌细胞。在本发明中，所述抗肿瘤诊断试剂包括原位成像试剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
第一中间产物的合成方法：
称取均三甲基碘苯（2.461 g，10 mmol）溶解于2,2,2-三氟乙醇和二氯甲烷混合溶剂中，加入间氯过氧苯甲酸（1.5 g，10 mmol），室温反应45min。然后称取苯甲醚（1.08 g，10mmol），对甲苯磺酸（1.9 g，10 mmol）加入到反应液中，室温反应2 h。抽滤，得黄色固体，用乙醚冲洗三次，得到白色固体，记为第一中间产物，产率为60%。
对所得第一中间产物固体进行1H NMR表征，具体数据如下：1H NMR (600 MHz,MeOD) δ 7.83 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.69-7.67 (m, 2H), 7.20 (d, J = 13.2 Hz,4H), 7.02 (dd, J =9.0, 2.4 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 2.65 (s, 6H), 2.34 (d, J =11.4 Hz, 6H)。
DPBC-OTs（第二中间产物）的合成方法：
称取偶氮苯（364.4 mg，2.0 mmol），Ag2CO3（1103 mg，4.0 mmol），AgSbF6（68.8 mg，0.2 mmol），[(Cp*IrCl2)2]（39.8 mg，0.05 mmol），第一中间产物（2620.2 mg，5 mmol），冰醋酸（285.4 μL，5 mmol）和三氟乙醇（16.0 mL）于圆底烧瓶中。在氮气保护下80℃反应24h。
反应结束后，将反应料液经硅藻土过滤反应液，用二氯甲烷洗涤。浓缩滤液，用硅胶柱层析提纯，以二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇的混合液为洗脱剂进行洗脱，得到紫色溶液，重结晶后得到紫色固体，记为DPBC-OTs，产率为50%。
DPBC-OTs固体的1H NMR的表征数据如下：1H NMR (500 MHz, MeOD) δ 9.32 (d, J= 9.4 Hz, 1H), 9.15-9.06 (m, 1H), 8.54 (dd, J = 8.5, 7.4 Hz 1H), 8.27 (dd, J= 7.3, 0.9 Hz 1H), 8.07 (dd, J = 9.4, 2.4 Hz, 1H), 7.98-7.88 (m, 2H), 7.88-7.79 (m, 3H), 7.79-7.71 (m, 2H), 7.36 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.14-7.01 (m, 2H),3.97 (s, 3H), 3.87 (s, 3H); 13C NMR (126 MHz, MeOD) δ 163.65, 160.91, 144.63,143.16, 141.51, 140.52, 139.83, 132.34, 131.92, 131.81, 130.11, 128.15,127.91, 127.05, 126.16, 125.88, 125.00, 120.42, 113.65, 99.53, 55.76, 54.49;精确分子量为393.1598，HR-MS分子量为：393.1599。
DPBC-2OH（第三中间产物）的合成方法：
称取DPBC-OTs（564 mg，1.0 mmol）于干燥的圆底烧瓶中，加入30 mL超干二氯甲烷使其完全溶解，避光置于冷浴锅中降温至-20 ℃，缓慢加入三溴化硼4.0 mL（原浓度：1.0mol/L，4.0 mmol）后，室温避光反应6小时。反应结束后，加10 mL甲醇猝灭未反应的三溴化硼，浓缩反应液，用硅胶柱层析提纯，以二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇的混合液为洗脱剂进行洗脱，为洗脱剂得到绿色溶液，重结晶后得到绿色固体，记为DPBC-2OH，产率为90%。
DPBC-2OH的1H NMR表征数据如下：1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.91 (s,1H), 10.72 (s, 1H), 9.36 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 9.15 (dd, J = 16.4, 8.3 Hz,1H), 8.53 (s, 1H), 8.30-8.14 (m, 1H), 7.99 (t, J =17.5 Hz, 4H), 7.84 (s, 3H),7.66 (s, 1H), 7.34-7.13 (m, 1H), 7.07 (d, J= 19.8, 1H), 6.90 (d, J =8.3 Hz,1H)；精确分子量为：365.1285，HR-MS分子量为：365.1300。
DPBC-OH-OC12的合成方法及表征：
称取DPBC-2OH（182.7 mg，0.5 mmol）、碳酸铯（32.6 mg，0.1 mmol）、碳酸钾（276.4mg，2 mmol）于圆底烧瓶中，加入乙腈和水的混合溶液（乙腈和水的体积比为1:1）使DPBC-2OH全部溶解，加入十二烷基溴（705.6 mg，3 mmol）。在氮气的保护下60 ℃进行第一取代反应8h。然后，过滤除去碳酸铯、碳酸钾，浓缩后用二氯甲烷萃取。合并并浓缩有机相后，用硅胶柱层析提纯，以二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇的混合液为洗脱剂进行洗脱，得到绿色溶液，重结晶后得到绿色固体，记为DPBC-OH-OC12，产率为78%。
DPBC-OH-OC12的1H NMR表征数据如下：1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 8.40(dd, J = 9.7, 6.1 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 2.2 Hz,1H), 7.74 (dd, J = 9.1, 7.0 Hz, 1H), 7.63 – 7.52 (m, 6H), 7.52 – 7.45 (m,3H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.4 Hz,2H), 1.85 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.50 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.37 (t, J = 7.8 Hz,2H), 1.34 – 1.24 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H); 13C NMR (151 MHz,Chloroform-d) δ 143.30, 143.03, 140.37, 139.54, 137.48, 135.25, 134.86,130.40, 130.31, 130.02, 129.83, 128.36, 127.49, 125.70, 123.40, 122.16,120.30, 112.45, 100.83, 69.30, 31.91, 29.65, 29.63, 29.57, 29.53, 29.33,29.31, 29.05, 25.97, 22.67, 14.10。
实施例2
称取DPBC-OH-OC12（31.4 mg，0.05 mmol）、碳酸铯（27.6 mg，0.2 mmol）、碳酸钾（276.4 mg，2 mmol）于两口瓶中，加入乙腈使DPBC-OH-OC12完全溶解，加入碘甲烷（14.9mg，0.105 mmol）。在氮气保护下室温反应4h。反应完毕，过滤除去碳酸铯、碳酸钾，合并有机相，浓缩后，用硅胶柱层析提纯，以二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇的混合液为洗脱剂进行洗脱，得到紫色溶液，重结晶后得到紫色固体，记为DPBC-OMe-OC12，产率为32%。
DPBC-OMe-OC12的1H NMR表征数据如下：1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ9.32 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.10 (d, J = 6.1 Hz,1H), 8.00 (d, J = 26.4 Hz, 3H), 7.82 – 7.72 (m, 5H), 7.03 (d, J = 8.3 Hz,3H), 4.02 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 1.82 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.51 –1.46 (m, 2H), 1.33 – 1.26 (m, 16H), 0.91 (t, J = 6.9 Hz, 3H)。
实施例3
称取DPBC-OH-OC12（13.4 mg，0.025 mmol）、碳酸铯（32.6 mg，0.1 mmol）、碳酸钾（276.4 mg，2 mmol）于圆底烧瓶中，加入乙腈使DPBC-OH-OC12完全溶解，加入十二烷基溴（35.3 mg，0.15 mmol）。在氮气的保护下60 ℃反应过夜。反应完毕，过滤除去碳酸铯、碳酸钾，合并有机相，浓缩后，用硅胶柱层析提纯，以二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1的二氯甲烷和甲醇的混合液为洗脱剂进行洗脱，得到紫色溶液，重结晶得到紫色固体，记为DPBC-2OC12，产率为38%。
DPBC-2OC12的1H NMR表征数据如下：1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 9.43(t, J = 8.4 Hz, 1H), 9.15 (q, J = 8.9, 8.0 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 7.1 Hz, 1H),8.12 – 8.03 (m, 3H), 8.01 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 7.97 – 7.87 (m, 3H), 7.77 (d,J = 4.2 Hz, 4H), 7.03 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 4.12 – 4.04 (m, 4H), 1.84 (dq, J =21.4, 7.1 Hz, 4H), 1.55 – 1.43 (m, 4H), 1.35 – 1.27 (m, 32H), 0.90 (td, J =6.9, 2.8 Hz, 6H); 13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 135.29, 132.86, 132.67,131.97, 131.94, 130.38, 128.97, 127.92, 127.78, 127.59, 127.43, 126.56,122.39, 114.62, 112.86, 111.94, 100.51, 69.82, 69.36, 31.92, 29.67, 29.65,29.63, 29.61, 29.58, 29.56, 29.51, 29.43, 29.35, 29.04, 28.74, 25.98, 25.89,22.69, 14.12。
根据上述表征数据可知得到的荧光探针DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12和DPBC-2OC12分别为如式1、式2和式3所示结构。
性能测试
（1）紫外吸收光谱测试：
将2 μL的DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12的DMSO母液（2 mM）加入到2mL的水中，分别配置成2 μM的测试浓度，放于紫外分光光度计进行紫外吸收光谱的采集。结果如图1所示。
图1为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12在水中的紫外吸收图。从图1可以看出，DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12分别在630 nm、520 nm或520 nm处有最大吸收。
（2）荧光光谱测试：
将2 μL的DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12的DMSO母液（2 mM）加入到2mL的水中，分别配置成2 μM的测试浓度，放于荧光光谱仪进行荧光发射光谱的采集。结果如图2所示。
图2为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12在水相中的荧光发射图。从图2可以看出，DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12的最大发射波长分别为750 nm、700nm或660 nm。
（3）AIE性质测试：在不同甲苯体积分数（fT）的DMSO/甲苯混合溶液中加入DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12的DMSO溶液（2 mM），得到浓度为10 μM的DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12溶液，分别以630 nm、520 nm或520 nm为激发波长测定不同甲苯体积分数的混合溶液中3种化合物在750 nm、700 nm或660 nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值变化情况，测试结果如图3所示。
图3为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12在不同甲苯体积分数的DMSO/甲苯混合溶液中750 nm、700 nm或660 nm处的荧光强度比随甲苯体积分数的变化情况，从低到高对应的甲苯的体积分数依次为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和99%，激发光波长为630 nm、520 nm或520 nm。从图3中可以看出，随着甲苯体积分数的增加，DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12和DPBC-2OC12荧光发射强度比逐渐增加，这说明DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12和DPBC-2OC12均具有AIE性质。DPBC-2OC12在40%之后出现一定程度的下降，可能是由于其聚集状态的改变导致的。
（4）活性氧产生能力测试：
2',7'-二氯二氢荧光素(DCFH)用于检测活性氧。将50 μL DCFH（浓度：40 μM）与DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12水溶液（工作浓度：2 μM）混合。通过在50 μLDCFH 中加入2 mL PBS作为对照组。之后，将混合物暴露于白光（10 mW/cm2），前1分钟每隔10秒用荧光光谱仪测试一次DCFH的荧光强度，之后每隔1分钟测试一次，测试的激发条件为489 nm。
图4为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12在水相中与活性氧捕获剂DCFH混合溶液在538 nm处实时荧光值与初始荧光值的比值随光照时间的变化情况。由图4可以看出，仅DCFH存在时，溶液的信号强度在白光照射5min后显示出可忽略不计的变化。相比之下，溶液的荧光信号强度在DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12存在时逐渐增加，说明DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12表现出优异的ROS生产能力。尤其是DPBC-OMe-OC12，荧光强度有150倍的增强。
（5）超氧阴离子（O2 •-）产生能力测试：
以二氢罗丹明123（DHR123）作为指示剂检测荧光探针的O2 •-产生能力。当系统中产生O2 •-时，DHR123将被氧化并在530 nm处发出强荧光。将10 µM DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12溶解在含有60 µM DHR 123的2 mL PBS中。然后将混合物置于比色皿中并用白光(10 mW/cm2)照射。用荧光分光光度计（激发波长：480 nm）记录样品在530 nm处的荧光变化。结果如图5所示。
图5为DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12与超氧阴离子捕获剂DHR123混合溶液在530 nm处实时荧光值与初始荧光值的比值随光照时间的变化情况。含有DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12的溶液暴露于白光照射时，DHR123探针的荧光信号大幅提升，这表明DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12和DPBC-2OC12均具有O2 •-产生能力。
（6）细胞共定位测试：
将人宫颈癌（HeLa）细胞接种在共聚焦显微镜培养皿中并孵育至少24小时。然后加入DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12 (5 μM)孵育1小时。用PBS洗涤细胞3次，并在DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12处理后加入商业染料Mito-Tracker Green或Lyso-Tracker Green（500 nM）再孵育30min。然后，用共聚焦显微镜（Zeiss）观察细胞。DPBC-OH-OC12、DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12（λex = 543 nm，λem = 长通 570 nm）。商业染料（λex = 488 nm，λem =长通 525 nm）。结果如图6、7、8所示。
图6为DPBC-OH-OC12对HeLa细胞进行共定位荧光成像分析测试。结果证实，DPBC-OH-OC12的红色荧光与商业化的溶酶体特异性探针(Lyso-Tracker Green)的绿色荧光重叠。表明DPBC-OH-OC12可以进入癌细胞并以高特异性积聚在溶酶体中。
图7为DPBC-OMe-OC12对HeLa细胞进行共定位荧光成像分析测试。结果证实，DPBC-OMe-OC12的红色荧光与商业化的线粒体特异性探针(Mito-Tracker Green)的绿色荧光重叠。表明DPBC-OMe-OC12可以进入癌细胞并以高特异性积聚在线粒体中。
图8为DPBC-2OC12对HeLa细胞进行共定位荧光成像分析测试。结果证实，DPBC-2OC12的红色荧光与商业化的溶酶体特异性探针(Lyso-Tracker Green)的绿色荧光重叠。表明DPBC-2OC12可以进入癌细胞并以高特异性积聚在溶酶体中。
（7）细胞内ROS成像：
在HeLa细胞中加入DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12 (5 μM)，孵化1小时。再加入DCFH-DA（20 μM）孵化30min，用PBS缓冲洗三遍后，将细胞暴露在白光（10 mW /cm2）下光照1min、5min。然后在倒置荧光显微镜下用426-466 nm波长激发，采集500-550 nm的发光。
图9为DPBC-OMe-OC12或DPBC-2OC12在细胞中的活性氧产生能力。成像结果表明，DPBC-OMe-OC12能在肿瘤细胞中产生大量的活性氧，而DPBC-2OC12在细胞内也能产生活性氧，但是较DPBC-OMe-OC12的活性氧产生能力更弱。
（8）光动力杀伤能力测试：
将HeLa细胞接种在96孔板上，在37 ℃、5% CO2、20% O2的加湿培养箱中，DMEM培养基（含10% FBS、1%青霉素/链霉素）中进行培养。然后，收获对数生长期的细胞，并以5×103个细胞的密度接种在96孔板中，孵育24小时。随后，将培养基更换为含有不同浓度DPBC-OMe-OC12的新鲜培养基。进一步孵育20小时后，将细胞暴露于白光照射(10 mW/cm2)20min。同时，没有激光照射的DPBC-OMe-OC12孵育的细胞作黑暗对照组。进一步孵育4小时后，在96孔板孔中加入等量的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（5 mg/mL，PBS溶液）。每个试验组留一个孔不加MTT当成空白孔。在37 ℃下再孵育4h。去除多余的MTT溶液，每孔中加入二甲基亚砜（100 μL）溶解产生的甲瓒晶体。充分震荡孔板10分钟，使甲瓒晶体完全溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定其光密度（OD）五次。采用以下公式计算细胞活力：
细胞活力(%)=(ODsample-ODbackground)/(ODcontrol-ODbackground)×100%。
其中ODsample为不同化合物孵育后的细胞混合液的OD值，ODcontrol为无化合物时的OD值，ODbackground为无MTT时的OD值。
图10为DPBC-OMe-OC12对HeLa细胞进行光动力杀伤分析测试。黑暗条件下，当DPBC-OMe-OC12的浓度增加到5 μM时，细胞活力保持在90%以上，表明DPBC-OMe-OC12的暗细胞毒性较低。在白光照射(10 mW/cm2，20分钟)后，观察到明显的浓度依赖光毒性，半抑制浓度(IC50)约为1.08 μM。证实了DPBC-OMe-OC12具有出色的光动力治疗作用。
由以上实施例可知，本发明提供的具有荧光成像和光动力杀伤癌细胞活性的荧光光敏剂。合成步骤简单，分离纯化操作简单，具有强的I型活性氧产生能力；对人宫颈癌细胞具有强杀伤能力，可用于构建具有高效光动力治疗效果的抗癌药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种阴离子-π型荧光探针，具有式I所示结构；
式I；
式I中，CnH2n+1中n为12，CmH2m+1中m为12；
式I中，R为Br、Cl或I。
2.根据权利要求1所述的阴离子-π型荧光探针，其特征在于，具有式3所示结构：
式3。
3.权利要求1或2所述的阴离子-π型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将2,4,6-三甲基碘苯和间氯过氧苯甲酸第一溶解后，进行氧化反应，所得氧化反应物料与苯甲醚、对甲苯磺酸混合，进行亲电取代反应，得到具有式II-1所示结构的第一中间产物；
将所述第一中间产物与偶氮苯和第一催化剂第二溶解后，在保护气氛下进行缩合反应，得到具有式III-1所示结构的第二中间产物；
将所述第二中间产物和三溴化硼第三溶解后，进行脱甲基反应，得到具有式IV-1所示结构的第三中间产物；
将所述第三中间产物和具有式V-1所示结构的第一卤代烃第四溶解后，在保护气氛、第二催化剂和碱性化合物的条件下进行第一取代反应，得到如式V-2所示的化合物V-2；
式II-1；/>式III-1；/>式IV-1；
CmH2m+1R 式V-1；式V-2；
将具有式V-2结构的化合物V-2和具有式V-3所示结构的第二卤代烃、第二催化剂第五溶解后，在保护气氛下进行第二取代反应，得到所述阴离子-π型荧光探针；CnH2n+1R 式V-3。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述2,4,6-三甲基碘苯和间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:0.5~3；所述氧化反应的温度为20 ~40 ℃，时间为30~60min。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述2,4,6-三甲基碘苯、苯甲醚和对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.5~3:0.5~3，所述亲电取代反应温度为20 ~40 ℃，时间为1~3 h。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一中间产物和偶氮苯的摩尔比为1:1~4，所述缩合反应的温度为60 ~80 ℃，时间为24~30 h。
7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第二中间产物与三溴化硼的摩尔比为1:2~6，所述脱甲基反应的温度为-20~0 ℃，时间为6~10 h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第三中间产物与第一卤代烃的摩尔比为1:1~5；所述化合物V-1与第二卤代烃的摩尔比为1:1~5。
9. 根据权利要求3或8所述的制备方法，其特征在于，所述第一取代反应和第二取代反应的温度独立地为30 ~60 ℃，时间独立地为4~10 h。
10.权利要求1或2所述的阴离子-π型荧光探针或权利要求3~9任意一项所述制备方法制备得到的阴离子-π型荧光探针在制备抗肿瘤药物或成像检测试剂中的应用。
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