CN116699129A - 一种快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条包括PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上；硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C，检测线T设置于靠近结合垫的一端，质控线C设置于靠近吸水垫的一端；结合垫包被有时间分辨荧光微球标记的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和兔抗IgG；检测线T包被有抗TGEV N蛋白的单克隆抗体B；所述质控线C包被有羊抗兔IgG。该试纸条操作简单，及时、快速、灵敏可用于TGEV临床样本的检测，为猪场精准防控提供技术支持。

Description

一种快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析 试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)，是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病。临床上常表现为水样腹泻、呕吐和脱水等，所有年龄猪均易感，其中小于2周龄的仔猪最为易感，感染后死亡率高达100％。虽然仔猪健康生长到5周龄以上时死亡率会明显降低，但该病近年来经常与猪流行性腹泻同时流行，对养猪业造成了严重的经济损失，因此该病当前仍是严重威胁养猪业的主要腹泻疾病之一。在目前尚无安全有效的药物和疫苗的条件下，快速准确地诊断对于该病的防控至关重要。
常用的病原学检测方法包括病毒的分离鉴定、免疫组化、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA)或聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR等方法。
然而，这些方法周期长、操作复杂繁琐，需要专业的技术人员和特定的仪器才可以完成，很难满足临床样品的快速、廉价、高效监测的要求。相较于上述方法，免疫层析检测技术能够在保证高灵敏度和强特异性的条件下将整体反应时间严格控制在10-15min内，极大的缩短了操作时间，提高了检测效率。
免疫层析快速检测技术是现阶段有效结合了免疫层析技术、单克隆抗体技术及新型材料标记技术的一种新型诊断检测技术。依据镧系元素螯合物本身发光的特点建立时间分辨荧光免疫层析检测方法(Time-resolved fluorescence immunochromatographicassay，TRFIA)。据报道TRFIA的灵敏度是胶体金的10～100倍，是乳胶的2～4倍。
发明内容
本发明提供了一种方便、快速且灵敏度高的检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法。该方法采用双抗体夹心测抗原的方式，以镧系元素铕偶联TGEV N蛋白特异性单克隆抗体作为标记物，研制出快速检测TGEV的时间分辨荧光免疫层析试纸条，该试纸条操作简单，及时、快速、灵敏可用于TGEV临床样本的检测，为猪场精准防控提供技术支持。
本发明具体包括以下内容：
本发明提供了一种用于猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，所述时间分辨荧光免疫层析试纸条包括PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C，所述的检测线T设置于靠近结合垫的一端，所述的质控线C设置于靠近吸水垫的一端；所述结合垫包被有时间分辨荧光微球标记的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和兔抗IgG(购自abcam公司，货号：ab6702)；所述检测线T包被有抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9；所述质控线C包被有羊抗兔IgG。
本发明的单克隆抗体1B7的重链可变区包括氨基酸序列为GFNIKDTY的CDR1、氨基酸序列为IDPADGYT的CDR2、氨基酸序列为ARPGTLDY的CDR3，本发明的单克隆抗体2A9的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDFN的CDR1、氨基酸序列为INPNNGRS的CDR2、氨基酸序列为ARRHWDWYFDV的CDR3。
本发明的单克隆抗体1B7的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2、氨基酸序列为QHIRELTR的CDR3，本发明的单克隆抗体2A9的轻链可变区包括氨基酸序列为KSLLHSN的CDR1、氨基酸序列为QMS的CDR2、氨基酸序列为AQNLEFPWT的CDR3。
本发明的单克隆抗体1B7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明的单克隆抗体2A9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的单克隆抗体1B7的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:5所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；本发明的单克隆抗体2A9的重链可变区的DNA序列如SEQID NO:7所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明的抗猪传染性胃肠炎冠状病毒N蛋白单克隆抗体重链恒定区为IgG1或IgG2b型。本发明的抗猪传染性胃肠炎冠状病毒N蛋白单克隆抗体轻链恒定区为Kappa型。
所述样品垫采用样品垫封闭液浸泡处理；所述样品垫封闭液为含有2％ BSA、1％S17、2％PEG20000、0.3％酪蛋白酸钠和0.05％Krovin 300的硼酸溶液。其中S17为表面活性剂。
所述结合垫的制备方法为：
将结合垫采用结合垫封闭液浸泡处理；所述结合垫封闭液为含有5％m/v海藻糖、1％m/vPEG20000、1％m/vTween-20、1％m/vTritonX-100和0.05％Krovin 300的硼酸溶液。
将时间分辨荧光微球用N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，离心，用硼酸缓冲液重悬，超声使荧光微球充分分散，随后加入抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7或兔抗IgG，室温孵育，再加入荧光微球标记物封闭液，室温孵育，离心；用荧光微球标记物保护剂将沉淀重悬，即得抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7或兔抗IgG的时间分辨荧光微球标记溶液；
将上述制备的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7的时间分辨荧光微球标记溶液和兔抗IgG的时间分辨荧光微球标记溶液按照1:1体积比混合后均匀喷洒在已处理好的结合垫上。
所述荧光微球标记物封闭液为含有10％m/v BSA的超纯水溶液；
所述荧光微球标记物保护剂为含有2％ BSA、1％m/v PVP-40、0.5％v/v Tween-20和0.05％Krovin 300的硼酸溶液。
所述抗TGEV N蛋白单克隆抗体1B7的时间分辨荧光微球标记溶液组成为：每1ml荧光微球溶液含120μgTGEV N蛋白单克隆抗体1B7。
所述兔抗IgG时间分辨荧光微球标记溶液组成为：每1ml荧光微球溶液含50μg兔抗IgG。
优选地，所述检测线T包被有1mg/ml的TGEV N蛋白单克隆抗体2A9。
优选地，所述质控线C包被有0.5mg/ml的羊抗兔IgG。
第二方面，本发明提供了一种于猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备样品垫和喷涂有时间分辨荧光微球标记抗体复合物的结合垫；
(2)将抗TGEV N蛋白单克隆抗体2A9(1mg/ml)和羊抗兔IgG抗体(0.5mg/ml)间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线T和质控线C；
(3)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上，得到检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条。
第三方面，本发明试纸条的使用方法，其步骤如下：
(1)准备待检样品。
(2)样品检测
取待测样品(根据实际需求确定是否稀释)，滴入样品垫的加样区，13min后放入便携式干式免疫分析仪中观察结果。所述样品稀释液为：含有0.5％v/v Tween-20的PBS溶液。
(3)结果判定
反应结束后30s内，将试纸条插入检测仪中，通过读取荧光信号的大小进行检测。
本发明的有益效果是：
本发明提供的检测TGEV的时间分辨荧光检测试纸条可用于TGEV病原的特异性检测，与干式免疫荧光分析仪连用可以读取特定的T线和C线的荧光强度值，检测结果的数字化避免了人主观性偏差。试纸条能够检出培养物中病毒的最低限位为103.2TCID50/0.1mL，且与临床症状相似的其他猪源肠道冠状病毒，如：SADS-CoV、PEDV和PDCoV均不发生交叉反应。因此，本发明所制备的试纸条具有较好的特异性、灵敏性、操作简单、时间短等优点，为猪传染性胃肠炎病毒的现场或基层的快速检测提供了一种快速检测方法。
附图说明
图1为TGEV N基因PCR扩增结果。M:DL2000相对分子质量标准；1：对照水；2：N基因，大小约为1000bp。
图2为pET32a-N重组蛋白表达及纯化结果。(A)M：蛋白Marker；1：pET32a-N诱导前；2：pET32a-N诱导后；3：pET32a-N裂解上清；4：pET32a-N裂解后沉淀。(B)M：蛋白Marker；1：纯化后的pET32a-N蛋白。
图3为N蛋白免疫后ELISA检测小鼠抗体效价。1～3：1、2和3号免疫鼠，NC：阴性对照。
图4为IFA鉴定单克隆抗体的反应性。(A)1B7单克隆抗体；(B)2A9单克隆抗体；(C)SP2/0细胞培养液。
图5为Westernblot鉴定单克隆抗体的反应性。(A)1B7单克隆抗体；(B)2A9单克隆抗体；(C)内参对照。M：蛋白Marker，Mock：PK细胞对照；TGEV：TGEV感染PK细胞。
图6为亚类鉴定结果。
图7为抗体纯化SDS-PAGE鉴定结果。M：蛋白Marker，1：1B7单克隆抗体；2：2A9单克隆抗体。
图8为可变区PCR扩增结果。(A)重链可变区PCR扩增结果。M：DL2000 marker；1：水对照；2：1B7单克隆抗体；3：2A9单克隆抗体；(B)轻链K可变区PCR扩增结果。M：DL2000marker；1：水对照；2：1B7单克隆抗体；3：2A9单克隆抗体。
图9最适荧光微球标记抗体量的确定。
图10最适T线处抗体标记浓度的确定。
图11试纸条组装示意图。
图12试纸条最佳反应时间的确定。
图13试纸条临界值的确定。
图14试纸条敏感性检测结果图。
图15试纸条特异性检测结果图。
图16试纸条稳定性检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
实施例1猪传染性腹泻冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备
1.TGEV N蛋白重组质粒的构建、表达、纯化
1.1pET32a-N重组质粒的构建
TGEV毒株为HLJ-17毒株(Genbank登录号：MT522161.1)，以该毒株N蛋白为参考，设计特异性引物，上游P1：5′-CGCGGATCCATGGCCAACCAGGGACAACG-3′，下游P2：5′-CCGCTCGAGTTAGTTCGTTACCTCATCAATTATC-3′，上、下游引物5′端引入了BamHI与XhoI酶切位点(下划线部分)。引物合成后，提取感染PK15细胞的TGEV细胞上清RNA，反转录为cDNA，进而以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA1μL，ddH2O补至50μL。反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，TGEV的N片段大小约为1000bp。随后按Omega公司EZNAGel Extraction Kit的使用说明书进行胶回收。
TGEV的N基因PCR胶回收产物与pET32a载体用BamHⅠ与XhoI双酶切后，进行连接、转化DH5α感受态细胞。将构建好的重组质粒进行测序鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a-N。
1.2N重组蛋白的诱导表达与纯化
将重组质粒pET32a-N转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落于5mL氨苄抗性的LB培养基中，待OD600约为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导后5h，12000rpm离心2min收集沉淀，沉淀用适量的PBS重悬后，进行超声处理5min(超3s，停3s)，超声后4℃，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。取上清液和沉淀加入5×loadingbuffer，沸水中煮沸10min，进行SDS-PAGE鉴定。结果显示pET32a-N在上清和沉淀中均有表达(图2A)，说明N蛋白有部分是可溶性的。
按照上述方法扩大pET32a-N蛋白的诱导表达量，取超声后裂解上清，进行镍柱纯化。纯化的具体操作步骤如下：
(1)装树脂：取一个空柱，加入2mL镍柱NTA树脂，待保存液下降至树脂表面时，用5倍柱体积蒸馏水清洗柱子一次，然后用5倍柱体积平衡液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5mM咪唑，pH7.4)对柱子进行平衡；
(2)上样：待平衡液降至树脂表面时，加入3mL含重组蛋白的裂解上清，重复上样2～3次，每次作用2min，收集样品流穿液；加入5倍柱体积的平衡液冲洗柱子1次；
(3)蛋白洗脱：用平衡液配置不同浓度咪唑(25mM，50mM，75mM，100mM，150mM，200mM和300mM)对蛋白样品进行洗脱，每次1mL，每个浓度重复两遍，其目的是为了确定咪唑的最佳洗杂和蛋白洗脱浓度；
(4)柱子清洗及保存：5倍体积的0.5M的NaOH冲洗柱子一次，然后用蒸馏水冲洗一次，随后加入适量的70％无水乙醇，置4℃冰箱保存。每次收集的样品进行SDS-PAGE鉴定。由图2B所示，获得了纯度较高的N蛋白。
2.动物免疫
选取6W(周)龄雌性BALB/c小鼠3只，将纯化的N重组蛋白按30μg/只的量免疫小鼠。首次免疫，将N蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后进行乳化，采用多点皮下注射小鼠(背部一个点，腹部两个点)。每隔2W进行加强免疫，共免疫四次，加强免疫是将N重组蛋白和弗氏不完全佐剂等体积混匀进行乳化，免疫方法同首次免疫。四免后7d(天)尾部采血测定抗体效价。
3.ELISA方法检测多克隆抗体效价
将TGEV病毒液与包被液1:1稀释包被ELISA板，50μL/孔，4℃过夜包被，用PBST洗四次后，加入2％海藻糖4℃封闭10h。将阳性血清和阴性血清用PBST倍比稀释，稀释梯度从1:100至1:12800，稀释8个梯度，37℃作用1h，PBST洗四次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:20000稀释)，PBST洗四次后，TMB显色，置酶标仪上测定OD450。
结果如图3所示，以未免疫小鼠血清作为阴性对照(NC)，血清1:102400稀释时，1、2和3号免疫鼠OD450仍大于NC组，说明该抗体效价能达到1:102400以上。
4.单克隆抗体的制备
具体操作步骤如下：
(1)制备饲养层细胞：将HAT培养液注射雌性BALB/c小鼠腹腔，慢慢反复抽吸，液体吸出后，铺于96孔板中。
(2)细胞融合：将脾细胞和适量的SP20细胞在融合剂PEG作用下进行细胞融合。融合后的细胞铺于含有饲养层细胞的96孔板中。
(3)阳性克隆的筛选：
a)间接ELISA检测方法，将纯化的N蛋白包被ELISA板，检测融合细胞分泌抗体的情况。
b)间接免疫荧光(IFA)检测方法，将ELISA抗体阳性细胞孔中的上清，加入TGEV感染PK15细胞，然后加入FITC标记的山羊抗鼠IgG，反应完毕后置荧光显微镜下观察结果。
(4)阳性杂交瘤细胞的亚克隆：选取ELISA和IFA阳性孔，采用有限稀释法对筛选到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清，利用上述ELISA和IFA方法进行抗体检测。阳性细胞进入下一轮的亚克隆，共进行三次。
(5)腹水的制备：取10～12W的Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，1W后每只小鼠腹腔注射5×105个杂交瘤细胞(0.2mL)，7～10天后，鼠体腹腔明显隆起，采集腹水，ELISA检测其效价，分装，-80℃保存。
(6)腹水的纯化：按照PIERCE公司NAbTM Protein G Spin Purification Kit进行亲和层析纯化，后经SDS-PAGE电泳鉴定纯度，纯化后的1B7单抗和2A9单抗的重链和轻链分别约为55kDa和约25kDa(图7)说明该纯化法纯化后抗体条带正确，且纯度较高。
5.单克隆抗体的鉴定
(1)特异性鉴定：包括IFA及Westernblot验证。
a)IFA验证：将TGEV感染PK15细胞，病毒感染后36h，用多聚甲醛固定细胞，细胞固定后，腹水用PBS稀释(500倍)加入病毒感染细胞，随后孵育FITC-抗鼠二抗(100倍稀释)，待反应结束后置荧光显微镜下观察。结果如图4A和4B所示，单克隆抗体1B7和2A9作用TGEV感染的PK15细胞能够检测到特异性的绿色荧光信号，而SP2/0细胞上清液作用TGEV感染细胞未见荧光信号(图4C)。
b)Westernblot验证：取纯化的N蛋白或收集病毒感染和未感染的PK15细胞进行SDS-PAGE，随后将蛋白胶转移至NC膜上，进行western blot验证。一抗为单克隆抗体1B7或2A9，二抗为HRP-抗鼠IgG。结果如图5A和5B所示，单克隆抗体1B7和2A9均能识别病毒感染细胞中的N蛋白。图5C为检测细胞内参β-actin。
(2)亚类鉴定：按照Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明对所获得的单抗进行抗体亚类鉴定。结果显示如图6，1B7单抗重链恒定区为IgG1型，2A9为IgG2b型，它们的轻链恒定区为Kappa型。
6.单克隆抗体可变区基因PCR扩增与序列测定
首先提取单克隆抗体杂交瘤细胞的RNA，利用Oligo-dt或随机引物分别将其逆转录合成cDNA(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA，6210A)。
抗体可变区基因采用套式PCR扩增。首先以上述cDNA为模板，利用第一轮鼠源抗体IgG1及κ轻链引物扩增抗体可变区基因，然后以第一轮产物为模板，利用第二轮鼠源抗体IgG1及κ轻链引物扩增抗体可变区基因。PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA 1μL，ddH2O补至50μL。反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。抗体可变区基因扩增的引物参照文献(von Boehmer,L.,Liu,C.,Ackerman,S.,Gitlin,A.D.,Wang,Q.,Gazumyan,A.,Nussenzweig,M.C.,2016.Sequencing and cloning of antigen-specific antibodiesfrom mouse memory B cells.Nature protocols 11,1908-1923.)。
扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，重链、κ轻链可变区基因大小均约为300bp(图8A和8B)，切胶回收目的片段。将回收的目的片段插入pMD-19T载体中，进行序列测定。
单克隆抗体1B7的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:5所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；单克隆抗体2A9的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
单克隆抗体1B7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；单克隆抗体2A9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
单克隆抗体1B7的重链可变区包括氨基酸序列为GFNIKDTY的CDR1、氨基酸序列为IDPADGYT的CDR2、氨基酸序列为ARPGTLDY的CDR3；单克隆抗体2A9的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDFN的CDR1、氨基酸序列为INPNNGRS的CDR2、氨基酸序列为ARRHWDWYFDV的CDR3。
单克隆抗体1B7的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2、氨基酸序列为QHIRELTR的CDR3；单克隆抗体2A9的轻链可变区包括氨基酸序列为KSLLHSN的CDR1、氨基酸序列为QMS的CDR2、氨基酸序列为AQNLEFPWT的CDR3。
实施例2检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备
1.结合垫的制备
1.1最适荧光微球标记TGEV N蛋白单克隆抗体1B7量的确定
将制备好的TGEV N蛋白单克隆抗体1B7与时间分辨Eu荧光微球(购自南京微测生物科技有限公司)进行偶联，使得1B7的终浓度分别为160μg/mL、140μg/mL、120μg/mL、100μg/mL、50μg/mL，偶联成功后置于4℃储存过夜后发现当终浓度为50μg/mL时，结合物几乎全部聚沉，说明偶联效率太低而未成功。用其余4种标记成功的结合物分别检测阳性对照和阴性对照，如图9所示，抗体终浓度为120μg/mL时，T1/T2值最大，因此选择该浓度为最佳荧光微球标记抗体量。
1.2TGEV N蛋白单克隆抗体1B7和兔抗IgG时间分辨荧光微球标记物的制备
取2份800μl 0.05M pH8.2硼酸缓冲液分别加入2mL离心管中，各加入200μL固体含量为1％的时间分辨Eu荧光微球(南京微测生物科技有限公司)轻轻混匀；再加入20μL10mg/mL EDC(购自sigma，货号：03449)和50μL 10mg/mL的NHS(购自sigma，货号：8045180025)，充分混匀后室温活化15min，14000r 30min离心；去除上清溶液，用0.05mol/LpH8.2的硼酸缓冲液重悬；如果有明显无法混匀的沉淀，100W超声，超3s，停3s，共超声1min，使时间分辨Eu荧光微球完全分散；分别向溶液中加入120μg TGEV N蛋白单克隆抗体1B7及50μg兔抗IgG，常温孵育2h；分别加入110μl 10％ BSA溶液进行封闭，常温孵育2h，14000r 30min离心后弃掉上清；最后分别加入1mL荧光微球标记物保护剂重悬；如果有明显无法混匀的沉淀，100W超声，超3s，停3s，共超声1min，4℃保存备用。
1.3时间分辨荧光微球抗体结合物结合垫的制备
在37℃～38℃条件下，将结合垫浸泡于结合垫封闭液(含有5％m/v海藻糖、1％m/vPEG20000、1％m/vTween-20、1％m/vTritonX-100和0.05％Krovin 300的硼酸溶液)中2h，取出置于烘箱中烘干2～3h。将制备的荧光微球标记抗TGEV N蛋白的单克隆抗体1B7和兔抗IgG的两种复合物按1:1体积比混匀后用喷膜仪均匀喷洒在结合垫上，置于37℃烘箱中干燥2～3h，取出后储存在4℃，密封保存。
2.样品垫的制备
在37℃～38℃条件下，将样品垫浸泡于样品垫封闭液(含有2％ BSA、1％S17、2％PEG20000、0.3％酪蛋白酸钠和0.05％Krovin 300的硼酸溶液)中2h，取出置于烘箱中烘干2～3h，再置于铝箔袋中干燥备用。
3.硝酸纤维素膜的制备
为了确定T线处抗体最佳包被浓度，将抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9稀释至0.5、1、1.5、2mg/ml，喷于T线处，加入TGEV细胞毒(阳性对照)及未接毒的健康细胞上清液(阴性对照)，反应13min后，置于干式荧光免疫分析仪读值。记录阳性对照T线处荧光值T1；记录阴性对照T线处荧光值T2，选取T1/T2最大时参数为最佳条件。其检测结果如图10所示，抗TGEVN蛋白的单克隆抗体2A9的浓度为1mg/ml时，T1/T2值最大。
将1mg/ml的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体2A9和0.5mg/ml的羊抗兔IgG抗体间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线(T)和质控线(C)，线划好后置于37℃～38℃干燥2～3h。
4.试纸条的组装
在PVC底板上依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫进行连接，得到试纸条，按照试纸条卡壳的大小对试纸条进行切条，然后将切条后的试纸条装入试纸条卡壳中。其中试纸条的结构示意图如图11所示。
实施例3检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条的应用
1.试纸条的使用方法
(1)检测：取出试纸条平衡至室温，在样品垫的加样区上加入待检样品，室温静置，判定结果。
(2)结果判定：将试纸条插入干式免疫分析仪中，通过读取荧光信号的大小判定结果。
2.试纸条最佳反应时间的确定
对于试纸条而言，检测时间的确定很大程度影响着整体反应的过程，如果时间过短，可能会导致整体反应不充分，相反，如果时间过长反而会导致检测时间的浪费。因分别加入TGEV阳性对照和阴性对照后按照0、1、3、5、7、9、11、13、15、17min间隔进行检测，及时记录荧光值T1和T2，计算T1/T2值，并绘制T1/T2值随着时间的变化的趋势图。结果如图12所示，当作用13min时，其T1/T2值最大，说明试纸条的最佳反应时间为13min。
3.试纸条临界值的确定
用组装好的试纸条检测30份TGEV阴性的肛拭纸样本，检测结束后记录T值，并计算对应的平均值和标准差(SD)。根据公式/>判定为阴阳性的临界值。结果如图13所示，30份阴性样本T值的平均值/>为1254，SD值为610，因此该试纸条的临界值为3084。
4.试纸条的敏感性
将TGEV TCID50为107.8/0.1mL的病毒5倍比稀释后，再进行2倍比稀释检测已建立的试纸条的敏感性。结果表明，当病毒以1:21至1:213稀释时，检测线T值大于临界值；而1:214释时，T值小于临界值。因此，试纸条的敏感性达到1:213，即本发明的最低病毒检测量103.2TCID50/0.1mL，如图14所示。
5.试纸条的特异性
用试纸条检测TGEV、SADS-CoV、PEDV和PDCoV，发现只有TGEV呈阳性，其余均无交叉反应，说明本发明建立的该方法可以特异性识别TGEV，如图15所示。
6.试纸条稳定性检测
稳定性是未来应用于的一个重要因素，将试纸条分别在室温(18～25℃)和4℃条件下避光保存，在第0、1、2、3、6、9、12、15个月时对试纸条进行稳定性试验，由表1和图16可知，试纸条可在常温下稳定保存9个月，在4℃可稳定保存12个月。
表1试纸条稳定性检测结果
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (10)

1.一种快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C，所述的检测线T设置于靠近结合垫的一端，所述的质控线C设置于靠近吸水垫的一端；其特征在于，所述结合垫包被有时间分辨荧光微球标记的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和兔抗IgG；所述检测线T包被有抗TGEV N蛋白的单克隆抗体B；所述质控线C包被有羊抗兔IgG；
单克隆抗体A的重链可变区包括氨基酸序列为GFNIKDTY的CDR1、氨基酸序列为IDPADGYT的CDR2、氨基酸序列为ARPGTLDY的CDR3；单克隆抗体A的轻链可变区包括氨基酸序列为KSVSTSGYSY的CDR1、氨基酸序列为LVS的CDR2、氨基酸序列为QHIRELTR的CDR3；
单克隆抗体B的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTDFN的CDR1、氨基酸序列为INPNNGRS的CDR2、氨基酸序列为ARRHWDWYFDV的CDR3；单克隆抗体B的轻链可变区包括氨基酸序列为KSLLHSN的CDR1、氨基酸序列为QMS的CDR2、氨基酸序列为AQNLEFPWT的CDR3。
2.根据权利要求1所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，
单克隆抗体A的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
单克隆抗体B的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，
单克隆抗体A的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
单克隆抗体B的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
4.根据权利要求1所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，
所述样品垫采用样品垫封闭液浸泡处理；所述样品垫封闭液为含有2% BSA、1%S17、2%PEG20000、0.3%酪蛋白酸钠和0.05%Krovin 300的硼酸溶液。
5.根据权利要求1所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫的制备方法为：
将结合垫采用结合垫封闭液浸泡处理；
将时间分辨荧光微球用N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化后，离心，用硼酸缓冲液重悬，超声使荧光微球充分分散，随后加入抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A或兔抗IgG，室温孵育，再加入荧光微球标记物封闭液，室温孵育，离心；用荧光微球标记物保护剂将沉淀重悬，即得抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A或兔抗IgG的时间分辨荧光微球标记溶液；
将抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A的时间分辨荧光微球标记溶液和兔抗IgG的时间分辨荧光微球标记溶液按照1:1体积比混合后均匀喷洒在已处理好的结合垫上。
6.根据权利要求5所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，
所述结合垫封闭液为含有5%m/v海藻糖、1%m/vPEG20000、1%m/vTween-20、1%m/vTritonX-100和0.05%Krovin 300的硼酸溶液；
所述荧光微球标记物封闭液为含有10% m/v BSA的超纯水溶液；
所述荧光微球标记物保护剂为含有2% BSA、1% m/v PVP-40、0.5% v/v Tween-20和0.05%Krovin 300的硼酸溶液。
7.根据权利要求1所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，
所述TGEV N蛋白单克隆抗体1B7时间分辨荧光微球标记溶液组成为：每1ml荧光微球溶液含120µgTGEV N蛋白单克隆抗体1B7；
所述兔抗IgG时间分辨荧光微球标记溶液组成为：每1ml荧光微球溶液含50µg兔抗IgG。
8.根据权利要求1所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，
所述检测线T包被有1mg/ml的TGEV N蛋白单克隆抗体B；
所述质控线C包被有0.5mg/ml的羊抗兔IgG。
9.权利要求1所述的快速检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备样品垫和喷包被有时间分辨荧光微球标记的抗TGEV N蛋白的单克隆抗体A和兔抗IgG的结合垫；
（2）将抗TGEV N蛋白单克隆抗体B和羊抗兔IgG抗体间隔喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线T和质控线C；
（3）将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上，得到检测猪传染性胃肠炎病毒的时间分辨荧光免疫层析试纸条。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，检测线T和质控线C之间间隔5～8mm。
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