CN116699016A - 一种液相色谱质谱联用检测水质中咖啡因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种液相色谱质谱联用检测水质中咖啡因的方法，所述方法包括S1.取的待测样品；S2.采用液相色谱‑质谱联用仪对样品进行检测；本发明的咖啡因检测方法的精密度和准确度都在75％以上，该范围在EPA验证生物分析方法的范围内；与已有定量分析方法相比，该方法具有很低的检测限(10pg/mL)，以及很低的定量限(20pg/mL)，并且在20‑5000pg/ml范围内有着良好线性回归，与已有的方法比较，我们的方法的检测限下降了200倍。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种液相质谱联用检测水质中咖啡因方法及其应用。
背景技术
咖啡因，1,3,7-三甲基黄嘌呤，化学式为C8H10N4O2，兼具亲水性和亲脂性，是海洋和河水系统中普遍存在的人为污染物。咖啡因是一种天然的生物碱，存在于60多种植物中，目前，还未在温带太平洋海域发现可以产生咖啡因的生物，但是在七大洲的水域中均可检测到咖啡因。通常认为环境中咖啡因的主要来源是已消耗咖啡因的排泄物残留、未消耗的含咖啡因饮料、不适当地沉积过期或不需要的含咖啡因药品、制造厂废物、医院废物等。在靠近人口稠密地区的采样点，咖啡因残留浓度往往较高。
目前为止，咖啡因定量测定技术主要是高效液相色谱质谱联用(LC-MS)和气相色谱质谱联用(GC-MS)。由于咖啡、血浆与地表水、废水中的咖啡因含量存在着很大差异，因此对于咖啡因检测方法的定量限(LOQ)也有着不同的要求。咖啡因通过地面径流汇出大海，海水大大稀释了咖啡因含量。原有的检测方法LOQ较高，限制了对近海水域咖啡因残留污染水平的评价。
发明内容
第一方面，本发明提供一种超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1.取待测水质样品；
S2.将水质样品和内标溶液(Caffeine-13C3)混匀后，进行固相萃取并洗脱得到标准的检测样品；
S3.将上述得到的标准检测样品采用液相色谱-质谱联用仪对样品进行检测；其中液相色谱条件为：反相色谱柱；液相流动相A为去离子水，同时含有甲酸；流动相B为有机流动相，有机相成分为100％甲醇，同时含有甲酸；色谱柱温度为40℃；进样量为10.0μL；流速为0.3mL/min；基于洗针液R0的梯度洗脱程序为0～1.00min、70％A，1.00～2.50min、40％A，2.50～3.00min、40％A，3.01～4.00min、5％A，4.00～5.00min、70％A，5.00～6.00min、70％A；质谱条件为：在离子化模式下进行样品扫描，采集数据，离子源为大气压化学电离源，选择适宜温度和脱溶剂温度，脱溶剂气流速为800L/h，毛细管电压为15kV。
进一步的，所述待测样品和内标溶液(Caffeine-13C3)以体积比500-2000:1混匀得到含有内标的样品。
进一步的，所述固相萃取选用固相萃取柱。
进一步的，所述洗脱是选用甲醇进行洗脱。
进一步的，所述甲醇的用量为1–5mL。
进一步的，流动相A中含有的甲酸浓度为0.1–1.0％。
进一步的，流动相B中甲酸浓度为0.1–1.0％。
进一步的，所述洗针液(R0)优选乙腈、水溶液，其浓度为70-90％(范围是否合适)。
进一步的，所述质扫描选择反应检测扫描，扫描范围为质荷比(m/z)100-300，扫描时间间隔为2ms。
进一步的，所述质谱优选负离子模式，离子源优选大气压化学电离源，源温度为120–180℃，所述脱溶剂温度为300–500℃。
进一步的，所述质谱数据采集选择棒状图形式。
进一步的，所述质谱检测时优选待测物的质荷比m/z为195.09；内标物的m/z为198.09。
进一步的，所述检测方法的检测限为10pg/mL，最低定量限为20pg/mL，检测范围为20–5000pg/ml。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的检测方法在检测水质痕量咖啡因中的应用。
进一步的，所述痕量咖啡因是指浓度在20–150pg/L之间。
第三方面，本发明提供一种检测水质痕量咖啡因的试剂盒，所述试剂盒含有说明书、工作液；所述工作液包含本发明第一方面所述的内标溶液、流动相A、流动相B、洗针液。
进一步的，所述试剂盒检测限为10pg/L，最低定量限为20pg/L，检测范围为20–5000pg/L。
本发明的有益效果：
本发明开发的一种简单便捷的液相色谱质谱联用的检测方法可以有效满足海水中的痕量咖啡因的定量分析；液相部分的色谱柱使用甲酸缓冲盐体系以满足咖啡因的检测工作，经验证，本发明的咖啡因检测方法的精密度和准确度都在75％以上，该范围在EPA验证生物分析方法的范围内；与已有定量分析方法相比，该方法具有很低的检测限(10pg/mL)，以及很低的定量限(20pg/mL)，并且在20-5000pg/ml范围内有着良好线性回归，与已有的方法比较，我们的方法的检测限下降了200倍。
附图说明
图1为咖啡因在海水中的浓度检测标准曲线。
具体实施方式
实施例1海水中痕量咖啡因的测定方法的建立1.1实验材料
1.1.1实验仪器
表1实验仪器列表
1.1.2实验试剂
表2实验试剂列表
1.1.3溶剂信息
表3-1溶剂表
表3-2溶剂表
表3-3溶剂表
表3-4溶剂表
1.1.4液相质谱条件
(1)液相条件
表4液相条件列表
(2)质谱条件
表5质谱条件列表
1.2样本的处理过程
表6样品处理程序
1.3定量方法
表7处理程序列表
1.4基于1.1-1.3的条件，具体实施方式述如下：
(1)流动相A的配制
精移取200mLH2O至1000mL玻璃瓶中，加入100μL甲酸，混匀；其中，甲酸的用量仅为0.1％，可以减少对色谱系统和质谱仪器的损害，同时可以增加方法的稳定性；
(2)流动相B的配制
精移取200mL甲醇至1000mL玻璃瓶中，加入100μL甲酸，混匀；其中，甲酸的用量仅为0.1％，可以减少对色谱系统和质谱仪器的损害，同时可以增加方法的稳定性；
(3)化合物的洗脱机洗脱条件
洗脱条件：梯度洗脱时，液相保留主要是让化合物在高比例的流动相A存在的条件下在色谱柱上结合，然后通过流动相B进行洗脱；其中，流动相A通过流动相A的配制的方式进行配制，流动相B通过流动相B的配制的方式进行配制；
(4)质谱检测
质谱条件的确定是先确认正离子模式下的caffeine及其内标caffeine-13C3的分子离子峰，最后通过SRM模式检测。
实施例2：烟台市区海域中痕量咖啡因浓度检测
具体方法如实施例1。
2.1样品的处理
(1)收集不同采样点的样品，并保存于–20℃条件下。试验开始时，在4℃条件下解冻融化后，涡旋混匀。
(2)先用滤纸过滤，将样品中大颗粒的泥沙过滤掉，再用滤膜将海水中不溶的颗粒物质除掉；
(3)取1升待测样品至烧杯中，向烧杯中加入1mL内标溶液(Caffeine-13C3)，涡旋混匀。
(4)组装固相萃取装置，使用甲醇/水活化固相萃取柱。
(5)将样品流入固相萃取柱进行固相萃取，将含有内标的海水加载到活化后的SPE柱上，样品以1mL/min的速度均匀地通过SPE柱，依次使用2mL水和2mL甲醇洗涤，收集甲醇洗脱液，使用真空离心浓缩仪去除有机溶剂，并在1mL甲醇/水的混合液(70/30，v/v)中重新溶解，震荡，然后将溶液转移到进样板中进样。
(6)收集洗脱液，放入真空冷冻离心浓缩仪浓缩，去除溶剂。
(7)使用工作溶液稀释液定容至1mL，涡旋混匀。
(8)转移至液相小瓶中，进样。
2.2标准曲线制备
标准曲线采用浓度为1mg/mL的母液进行逐级稀释获得浓度为10,20,50,100,200,500,1000,2000,and 5000pg/mL的待测液。待测溶液中加入1000pg内标caffeine-13C3。将待测液上机，获得标准曲线，标准曲线图如图1所示。
浓度计算方法按照回归方式：
y＝a x+b
其中，y为分析物与内标的峰面积比值；x为分析物浓度，公式中a表示斜率，b表示截距。
依据上述标准曲线的制备，得到的标准曲线y＝0.165261x+36.1443；其中a＝0.15261；b＝36.1443；曲线相关系数r为0.999570，r2为0.993006。
2.3样品检测浓度汇总
表8烟台市区海域海水中痕量咖啡因浓度检测
| 站位 | 经度 | 纬度 | 浓度(ng/L) |
| S1 | 121.8065 | 37.5093 | 1.45 |
| S2 | 121.7322 | 37.5212 | 0.94 |
| S4 | 121.6443 | 37.5496 | 0.12 |
| S5 | 121.4618 | 37.5914 | 0.35 |
| S6 | 121.4279 | 37.5734 | 0.64 |
| S7 | 121.5061 | 37.5496 | 0.10 |
| S8 | 121.6032 | 37.5047 | 0.67 |
| S9 | 121.7329 | 37.4659 | 1.03 |
| S10 | 121.8130 | 37.4659 | 0.79 |
实施例3咖啡因浓度检测方法的验证
所有验证实验均在咖啡因溶液上进行。通过配置不同浓度的标准溶液测定所建立方法的线性。通过标准面积与内标面积之比的1/χ最小二乘回归估计相关系数。该方法的定量限由信噪比大于等于10(S/N≥10)确定，而检测限为信噪比大于等于3(S/N≥3)。在每个质控样品浓度下重复测量5次以评估该方法的回收率。
方法的准确度和精密度分别通过测定同一天(日内)和5天(日间)内不同浓度质控样品的5次重复测量值来计算。每个样品的相对峰面积由目标峰面积与内标峰面积之比表示。准确度由测定浓度与加标浓度的比值表示。精密度由重复测量的变异系数确定。
表9咖啡因LC/MS方法的日内、日间准确度和精密度(n＝5)
如表9所示，日内准确度(n＝5)在100.33％至100.7％之间，精密度在2.5％至6.6％之间。日间准确度(n＝5)在99.73％-101.09％之间，精确度在2.8-8.6％之间。咖啡因在日间和日内的精密度和准确度都在75％以上，这在EPA验证生物分析方法的范围内。因此，所开发的程序是可靠和可重复的。
本发明利用固相萃取对海水中的咖啡因进行富集，使用超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)方法测定海水中痕量咖啡因。与已有定量分析方法相比，该方法具有很低的检测限(10pg/mL)，以及很低的定量限(20pg/mL)，并且在20-5000pg/mL范围内有着良好线性回归。虽然P.R.Gardinali等人开发的检测方法有着更低的检测限(4pg/mL)，但是线性范围仅为5-500ng/mL，难以满足海水中痕量咖啡因的定量检测。与已有的方法比较，我们的方法的检测限下降了200倍。
基于上述实施例，本发明开发的一种简单便捷的液相质谱联用的检测方法可以有效满足于海水中的痕量咖啡因的定量分析；液相部分的色谱柱使用甲酸缓冲盐体系以满足咖啡因的检测工作，同时利用质谱进行筛选式采集方式解决了其他传统方法干扰大的问题，很好的提高了咖啡因液相方法的稳定性以及灵敏度，并通过计算机辅助有效解决了液相质谱方法对痕量咖啡因的色谱柱型号和离子源条件优化的问题。
Claims (10)
1.一种超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1.取待测水质样品；
S2.将水质样品和内标溶液(Caffeine-13C3)混匀后，进行固相萃取并洗脱得到标准的检测样品；
S3.将上述得到的标准检测样品采用液相色谱-质谱联用仪对样品进行检测；其中液相色谱条件为：反相色谱柱；液相流动相A为去离子水，同时含有甲酸；流动相B为有机流动相，有机相成分为100％甲醇，同时含有甲酸；色谱柱温度为40℃；进样量为10.0μL；流速为0.3mL/min；基于洗针液R0的梯度洗脱程序为0～1.00min、70％A，1.00～2.50min、40％A，2.50～3.00min、40％A，3.01～4.00min、5％A，4.00～5.00min、70％A，5.00～6.00min、70％A；质谱条件为：在离子化模式下进行样品扫描，采集数据，离子源为大气压化学电离源，选择适宜温度和脱溶剂温度，脱溶剂气流速为800L/h，毛细管电压为15kV。
2.如权利要求1所述的超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，其特征在于，所述待测样品和内标溶液(Caffeine-13C3)以体积比500-2000:1混匀得到含有内标的样品。
3.如权利要求1所述的超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，其特征在于，所述洗脱选用甲醇进行洗脱，所述甲醇的用量为1–5mL。
4.如权利要求1所述的超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，其特征在于，流动相A中含有的甲酸浓度为0.1–1.0％。
5.如权利要求1所述的超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，其特征在于，流动相B中甲酸浓度为0.1–1.0％。
6.如权利要求1所述的超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，其特征在于，所述洗针液(R0)选用乙腈、水溶液，其浓度为70–90％。
7.如权利要求1所述的超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，其特征在于，所述质扫描选择反应检测扫描，扫描范围为质荷比(m/z)100-300，扫描时间间隔为2ms。
8.如权利要求1所述的超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UPLC-qTOF-MS)检测水质咖啡因的方法，其特征在于，所述质谱检测时待测物的质荷比m/z为195.09；内标物的m/z为198.09。
9.一种如权利要求1所述的方法在检测水质痕量咖啡因中的应用，所述痕量咖啡因是指浓度在20–150pg/L之间。
10.一种检测水质痕量咖啡因的试剂盒，所述试剂盒含有说明书、工作液；所述工作液包含权利要求1-6所述的内标溶液、流动相A、流动相B、洗针液。
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