CN116693690A - 一种cGMP G-Flig系列探针及其应用和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种cGMPG‑Flig系列探针。所述的G‑Flig系列包括G‑Flig1h、G‑Flig1m、G‑Fligl1a、G‑Flig1lb；G‑Flig1h的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；G‑Flig1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；G‑Fligl1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；G‑Flig1lb的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明的优点：(1)动态范围更大。(2)检测灵敏度高。(3)亲和力高，适用于低浓度cGMP细胞。(4)可以用在活动物体的cGMP信号检测中。

Description

一种cGMP G-Flig系列探针及其应用和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种cGMPG-Flig系列探针。
背景技术
环磷酸鸟苷(cGMP)是哺乳动物细胞中重要的第二信使分子，细胞及活体水平的cGMP荧光成像是相关信号通路的基础研究和药物开发的重要方向。cGMP荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的(single-FPbased)探针，后者动态范围较前者大且使用简单。目前基于单个荧光蛋白的cGMP探针均为绿色，主要有FlincG1，FlincG3，Green cGull。但这3个探针在37℃培养细胞中亮度均较低，且FlincG1和FlincG3的动态范围很小(ΔF/F0<100％)。
活细胞中cGMP荧光成像是指将cGMP荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是cGMP荧光成像分析的关键。近几年，国际上知名实验室利用不同荧光蛋白和不同cGMP感应模块，开发了不同性能的绿色cGMPcpFP探针(表1)，包括Wolfgang R.Dostmann博士开发的FlincG1探针、John Garthwaite博士经过优化得到的FlincG3探针、Tetsuya Kitaguchi博士开发的Green cGull探针。
但上述探针尚不能较好满足活细胞和活体成像的需求，这主要由于其在关键性能(亮度、动态范围和亲和力)上存在以下不足：(1)在37℃培养细胞中动态范围小，如FlincG1和FlincG3探针(表1)。(2)在37℃培养细胞中荧光亮度低。如FlincG1和Green cGull探针(表1)。(3)Flinc G3和Green cGull对cGMP亲和力较低(μM级别)，不适用于cGMP浓度较低的细胞(如成年心肌细胞和部分神经元等)。
表1基于单个荧光蛋白的绿色cGMP探针
因此，开发高性能绿色cGMP探针，提高其在实际应用中的亮度和动态范围，对于提高探测灵敏度具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种荧光亮度高、动态范围大、检测灵敏度高，可检测细胞受刺激后cGMP浓度改变的cGMP G-Flig系列探针及其应用和试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种cGMP G-Flig系列探针，所述的G-Flig系列包括G-Flig1h、G-Flig1m、G-Fligl1a、G-Flig1lb；
G-Flig1h的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
G-Flig1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
G-Fligl1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
G-Flig1lb的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，所述的G-Flig系列单光子的激发波长为470～500nm。
本发明还提供一种cGMP G-Flig系列探针的制备方法。
一种cGMP G-Flig系列探针的制备方法，所述的方法为：以能够结合cGMP的mPDE5的GAF-A结构域为感应结构域，与环化重排绿色荧光蛋白GFP连接，经过若干氨基酸突变，即得到G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb探针；
G-Flig1h的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
G-Flig1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
G-Fligl1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
G-Flig1lb的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种活细胞中cGMP荧光成像检测方法。
一种活细胞中cGMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)活体细胞培养，细胞密度60±5％时，转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；
(3)单光子的激发波长470～500nm下，荧光显微镜成像分析。
本发明还提供一种哺乳动物细胞中cGMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cGMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)荧光显微镜成像分析，其中单光子的激发波长470～500nm。
本发明还提供另一种一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)单光子的激发波长470～500nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为没15秒一帧，在第十帧加入1mM SNP，检测G-Flig系列探针荧光的强度变化。
本发明还提供一种cGMP G-Flig系列探针的应用。
一种cGMP G-Flig系列探针在检测cGMP中的应用。
本发明还提供另一种cGMP G-Flig系列探针的应用。
一种cGMP G-Flig系列探针在活细胞和/或动物活体中检测cGMP中的应用。
本发明还提供一种G-Flig系列探针的试剂盒
一种包含G-Flig系列探针的试剂盒。
本发明提供的cGMP G-Flig系列探针，以能够结合cAMP的mPDE5的GAF-A结构域为感应结构域(感应模块)，与环化重排绿色荧光蛋白GFP(circularlypermuted GFP，cpGFP))通过图1所示方式连接，经过若干氨基酸突变，即得到G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb探针，其序列见SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4。
本发明提供的cGMP G-Flig系列探针，在GAF-A的特定位点插入环化重排绿色荧光蛋白(circularly permuted GFP，cpGFP)从而获得新的cGMP荧光探针G-Flig系列。
本发明提供的cGMP G-Flig系列探针，为绿色cGMP探针，在37℃生理温度培养细胞中，在单光子激发(470～500nm)下，具较高的亮度(分别为已经发表的最亮的探针FlincG3的490％，749％，338％和368％)和较大的动态范围(ΔF/F0分别为267％，223％，330％，368％)。
本发明提供的cGMP G-Flig系列探针，亲和力高，适用于cGMP浓度较低的细胞。
本发明的核心在于发现了亮度更高和动态范围更大的绿色cGMP探针。实际使用时，将其表达中哺乳动物细胞中，利用普通的荧光显微镜或者双光子显微镜，即可检测细胞受特定刺激后cGMP浓度改变。
与现有技术相比，本发明提供的一种cGMP G-Flig系列探针及其应用和试剂盒的优点：
(1)动态范围更大。
(2)检测灵敏度高。
(3)亲和力高，适用于低浓度cGMP细胞。
(4)可以用在活动物体的cGMP信号检测中。
附图说明
图1是本发明提供的G-Flig系列探针的组成示意图；其中，His为蛋白纯化标签，GAF(154～181)和GAFa(189～301)为感应模块的N端和C端，cpGFP为环化重排绿色荧光蛋白(荧光模块)，连接肽1和连接肽2为感应模块和荧光模块之间的连接部分；
图2是本发明提供的G-Flig系列探针的蛋白序列对比；
图3是本发明提供的G-Flig系列探针在cGMP结合前后的荧光激发和发射光谱；其中，表达探针的细菌悬浮在pH＝7.2的HEPES缓冲液(含150mM KCl及50mM HEPES)中，超声破碎后离心，去上清液测试探针在cGMP结合前后的激发光谱和发射光谱，虚线为激发谱，实线为发射谱；
图4是本发明提供的G-Flig系列探针(G-Flig1h、G-Flig1m、G-Fligl1a、G-Flig1lb)和FlincG1、FlincG3、Green cGull及GCaMP6s在Hek293T细胞中的亮度比较；其中，普遍使用的绿色钙离子探针GcaMP6s作为荧光亮度的参考；
图5是单光子激发下，不同探针在HEK293T细胞中的响应结果；其中，(A)为高亲和力探针G-Flig1h在1mM SNP刺激下的代表性荧光图片和响应曲线，(B)为不同探针的最大响应幅度，激发波长480nm±15nm，发射波长530±15nm)，曲线数据表示：平均值±标准差(Standard deviation，SD)。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
一种cGMP G-Flig系列探针，所述的G-Flig系列包括G-Flig1h、G-Flig1m、G-Fligl1a、G-Flig1lb；
G-Flig1h的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
G-Flig1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
G-Fligl1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
G-Flig1lb的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，所述的G-Flig系列单光子的激发波长为470～500nm。
本发明还提供一种cGMP G-Flig系列探针的制备方法。
一种cGMP G-Flig系列探针的制备方法，所述的方法为：以能够结合cGMP的mPDE5的GAF-A结构域为感应结构域，与环化重排绿色荧光蛋白GFP连接，经过若干氨基酸突变，即得到G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb探针；
G-Flig1h的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
G-Flig1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
G-Fligl1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
G-Flig1lb的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种活细胞中cGMP荧光成像检测方法。
一种活细胞中cGMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)活体细胞培养，细胞密度60±5％时，转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；
(3)单光子的激发波长470～500nm下，荧光显微镜成像分析。
本发明还提供一种哺乳动物细胞中cGMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cGMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗(penicillin-streptomycin)的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的活细胞荧光成像用缓冲液；
(3)荧光显微镜成像分析，其中单光子的激发波长470～500nm。
本发明还提供另一种一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)单光子的激发波长470～500nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为每15秒一帧，在第十帧加入1mM SNP，检测G-Flig系列探针荧光的强度变化。
本发明还提供一种cGMP G-Flig系列探针的应用。
一种cGMP G-Flig系列探针在检测cGMP中的应用。
本发明还提供另一种cGMP G-Flig系列探针的应用。
一种cGMP G-Flig系列探针在活细胞和/或动物活体中检测cGMP中的应用。
本发明还提供一种G-Flig系列探针的试剂盒
一种包含G-Flig系列探针的试剂盒。
实施例1
G-Flig系列探针的构建
结合图1所示，以能够结合cGMP的mPDE5的GAF-A结构域为感应结构域(感应模块)，与环化重排绿色荧光蛋白GFP(circularly permuted GFP，cpGFP)通过图1所示方式连接，经过若干氨基酸突变，即得到G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb探针，其序列见SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4。
His为蛋白纯化标签，GAF(154～181)和GAFa(189～301)为感应模块的N端和C端。cpGFP为环化重排绿色荧光蛋白(荧光模块)。连接肽1和连接肽2为感应模块和荧光模块之间的连接部分。
实施例2
G-Flig系列探针的激发和发射光谱
将G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb探针表达在细菌中，室温培养3天收集菌体，在pH7.2的HEPES缓冲液(含150mM KCl及50mM HEPES)中超声破碎，离心后收集上清液(含探针)。取120μL探针溶液，加2μL HEPES溶液或者含30mM cGMP的HEPES溶液，利用多功能酶标仪Infinite M1000 PRO检测探针对饱和浓度cGMP(～500μM)的响应，结果如图3所示。
从图中可知，G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb探针的信号分别增加6.8，5.5，8.8，和8.4倍。
实施例3
G-Flig系列探针(G-Flig1h、G-Flig1m、G-Fligl1a、G-Flig1lb)和FlincG1、FlincG3、Green cGull及GCaMP6s在Hek293T细胞中的亮度比较。
HEK293T细胞需培养在12孔板中，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％。细胞密度为60％左右时，在不同细胞孔中，用Lipofectamine 2000试剂盒转染相同质量的可表达探针G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb，FlincG1，FlincG3，Green cGull或GCaMP6s(普遍使用的绿色钙离子探针GCaMP6s作为荧光亮度参考)的质粒。约40小时后，用荧光成像用缓冲液清洗细胞，然后将细胞悬浮于200μL荧光成像用缓冲液中，并转移至96孔酶标板，37℃放置10分钟，最后用酶标仪检测检测荧光信号。结果如图4所示。
实施例4
单光子激发下，不同探针在HEK293T细胞中的响应
HEK293T细胞需培养在玻璃底的培养皿中，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％。细胞密度为60％左右时，在不同皿中用Lipofectamine 2000试剂盒转染量的可表达探针G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb，FlincG1，FlincG3或Green cGull的质粒。
过夜培养后，用不含血清和酚红的培养基(购自GIBCO公司)饥饿细胞2到4小时，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液，采用本实验室自行搭建的IX83单光子荧光显微镜(激发波长480nm±15nm左右，发射波长530±15nm)进行成像分析。
成像频率为15s/scan，在第十帧加入终浓度为1mM SNP(NO供体，购自碧云天生物技术公司)(例：培养皿中有500μL荧光成像用缓冲液，将1.6μL500mM的母液溶于300μL荧光成像用缓冲液中，第十帧时将稀释好的300μL SNP溶液滴入正在成像的细胞皿中)。以G-Flig1h为例，1mM刺激后，细胞中荧光强度的变化，见图5。
不同探针最大ΔF/F0(peakΔF/F0)比较见图5。至此完成哺乳动物细胞内cGMP浓度变化的荧光成像步骤。
图5中的曲线数据表示：平均值±标准差；ΔF/F0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。
从图5中可以看出，HEK293T细胞经SNP刺激后，G-Flig1h具有更大的信号变化幅度(ΔF/F0)，在动态范围和灵敏度方面有了很大的提高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种cGMP G-Flig系列探针及其应用和试剂盒
<130> 0
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Met Gly Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro
20 25 30
Gly Ser Leu Ala Val Thr Ala Leu Cys His Leu Ile Pro Leu His Ile
35 40 45
His Gly Leu Ile Ser Ala Ala Ala Thr Ser Leu Pro Leu Val Cys Thr
50 55 60
Pro Ala Val Thr Ile Thr Ala Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ile Leu Ala
65 70 75 80
Ala Pro Leu Ile Gly His Ala Val Gly Gly Gly Gly Val Gly Leu Ala
85 90 95
Thr His Thr Gly Gly Ala Thr Pro Ile Gly Ala Gly Pro Val Leu Leu
100 105 110
Pro Ala Ala His Leu Leu Ser Val Gly Ser Leu Leu Ser Leu Ala Pro
115 120 125
Ala Gly Leu Ala Ala His Met Val Leu Leu Gly Pro Val Thr Ala Ala
130 135 140
Gly Ile Thr Pro Gly Met Ala Gly Leu Thr Leu Gly Gly Thr Gly Gly
145 150 155 160
Ser Met Val Ser Leu Gly Gly Gly Leu Pro Thr Gly Val Val Pro Val
165 170 175
Leu Val Gly Leu Ala Gly Ala Val Ala Gly His Leu Pro Ser Val Ala
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Pro
195 200 205
Ile Cys Thr Thr Gly Leu Leu Pro Val Pro Thr Pro Thr Leu Val Thr
210 215 220
Thr Leu Thr Thr Gly Val Gly Cys Pro Ala Ala Thr Pro Ala His Met
225 230 235 240
Leu Gly His Ala Pro Pro Leu Ser Ala Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly
245 250 255
Gly Ala Thr Ile Val Pro Leu Ala Ala Gly Thr Thr Leu Thr Ala Ala
260 265 270
Gly Val Leu Pro Gly Gly Ala Thr Leu Val Ala Ala Ile Gly Leu Leu
275 280 285
Gly Ile Ala Pro Leu Gly Ala Gly Ala Ile Leu Gly His Leu Leu Gly
290 295 300
Thr Ala Thr Val Pro Leu Ile Ser Ala Leu Pro Ala Val Ala Gly Gly
305 310 315 320
Ser Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Ala Cys Ile Ala Leu Gly Thr Ala
325 330 335
Leu Gly Ile Val Gly His Val Ala Ala Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ile
340 345 350
Leu Ala Ala Thr Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Gly Val Ala Gly Ile
355 360 365
Thr Gly Thr Leu Thr Gly Ser Ile Leu Cys Met Pro Ile Leu Ala His
370 375 380
Ala Gly Gly Val Val Gly Val Ala Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ser Gly
385 390 395 400
Ala Gly Gly Thr Pro Thr Gly Leu Ala Gly Leu Ala Pro Ala Gly Thr
405 410 415
Leu Ala Thr Cys Gly Gly Val Leu His Ala
420 425
<210> 2
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Met Gly Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro
20 25 30
Gly Ser Leu Ala Val Thr Ala Leu Cys His Leu Ile Pro Leu His Ile
35 40 45
His Gly Leu Ile Ser Ala Ala Ala Thr Ser Leu Pro Leu Val Cys Thr
50 55 60
Pro Ala Val Thr Ile Thr Ala Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ile Leu Ala
65 70 75 80
Ala Pro Leu Ile Ala His Ala Val Gly Gly Gly Gly Val Gly Leu Ala
85 90 95
Thr His Thr Gly Gly Ala Thr Pro Ile Gly Ala Gly Pro Val Leu Leu
100 105 110
Pro Ala Ala His Thr Leu Ser Val Gly Ser Leu Leu Ser Leu Ala Pro
115 120 125
Ala Gly Leu Ala Ala His Met Val Leu Leu Gly Pro Val Thr Ala Ala
130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Pro
195 200 205
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210 215 220
Thr Leu Thr Thr Gly Val Gly Cys Pro Ala Ala Thr Pro Ala His Met
225 230 235 240
Leu Gly His Ala Pro Pro Leu Ser Ala Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly
245 250 255
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260 265 270
Gly Val Leu Pro Gly Gly Ala Thr Leu Val Ala Ala Ile Gly Leu Leu
275 280 285
Gly Ile Ala Pro Leu Gly Ala Gly Ala Ile Leu Gly His Leu Leu Gly
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425
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<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
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1 5 10 15
Gly Gly Gly Met Gly Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro
20 25 30
Gly Ser Leu Ala Val Thr Ala Leu Cys His Leu Ile Pro Leu His Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Gly Leu Ala Ala His Met Val Leu Leu Gly Pro Val Thr Ala Ala
130 135 140
Gly Ile Thr Leu Gly Met Ala Gly Leu Thr Leu Gly Gly Thr Gly Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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245 250 255
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275 280 285
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<211> 445
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<213> 人工序列()
<400> 4
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340 345 350
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405 410 415
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420 425 430
Pro Ala Gly Thr Ala Pro Leu Gly Ser Ala Gly Pro Val
435 440 445

Claims (9)

1.一种cGMP G-Flig系列探针，其特征在于：所述的G-Flig系列包括G-Flig1h、G-Flig1m、G-Fligl1a、G-Flig1lb；
G-Flig1h的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
G-Flig1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
G-Fligl1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
G-Flig1lb的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的一种cGMP G-Flig系列探针，其特征在于：所述的G-Flig系列单光子的激发波长为470～500nm。
3.一种cGMP G-Flig系列探针的制备方法，其特征在于，所述的方法为：以能够结合cGMP的mPDE5的GAF-A结构域为感应结构域，与环化重排绿色荧光蛋白GFP连接，经过若干氨基酸突变，即得到G-Flig1h，G-Flig1m，G-Fligl1a，G-Flig1lb探针；
G-Flig1h的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
G-Flig1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
G-Fligl1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
G-Flig1lb的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种活细胞中cGMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)活体细胞培养，细胞密度60±5％时，转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；
(3)单光子的激发波长470～500nm下，荧光显微镜成像分析。
5.一种哺乳动物细胞中cGMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)荧光显微镜成像分析，其中单光子的激发波长470～500nm。
6.一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染G-Flig系列探针的质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)单光子的激发波长470～500nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为每15秒一帧，在第十帧加入1mM SNP，检测G-Flig系列探针荧光的强度变化。
7.一种cGMP G-Flig系列探针在检测cGMP中的应用。
8.一种cGMP G-Flig系列探针在活细胞和/或动物活体中检测cGMP中的应用。
9.一种包含权利要求1或2所述的G-Flig系列探针的试剂盒。
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