CN116693689A - cAMP荧光探针R-Flamp2m及其应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种cAMP荧光探针R‑Flamp2m及其应用和试剂盒。一种cAMP荧光探针R‑Flamp2m，所述的R‑Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述的荧光探针R‑Flamp2m单光子的激发波长峰值为570nm，发射波长峰值约为600nm。本发明的优点：(1)动态范围更大。(2)检测灵敏度高。(3)可以用在活动物体的cAMP信号检测中。(4)应用范围广，可与短波长(400‑500nm)探针或光敏蛋白联合使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种cAMP荧光探针R-Flamp2m及其应用和试剂盒。
背景技术
环磷酸腺苷(cAMP)是目前最大药物靶标G蛋白偶联受体(GPCR)家族的下游信使分子，细胞及活体水平的cAMP荧光成像是GPCR信号通路的基础研究和药物开发的重要方向。cAMP荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的探针，后者动态范围较前者大且使用简单。目前基于单个荧光蛋白的cAMP探针分为绿色和红色2小类，前者主要有Flamindo2、cADDis及cAMPr，后者主要有R-Flamp1m、Pink Flamindo、Red cADDis及R-FlincA。
活细胞中cAMP荧光成像是指将cAMP荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是cAMP荧光成像分析的关键。近几年，国际上知名实验室利用不同荧光蛋白、不同cAMP感应模块及不同的融合位点，开发了不同性能和光谱的cAMP单荧光蛋白探针，包括Tetsuya Kitaguchi博士开发的Flamindo/Flamindo2/PinkFlamindo探针、Anne Marie Quinn博士开发的cADDis/Red cADDis探针、Kazuki Horikawa博士开发的R-FlincA探针及Justin Blau博士开发的cAMPr探针。对于绿色cAMP探针，申请人已开发更高性能的探针G-Flamp1(CN201911251920.X和CN202010354936.X)。
相较于短波长的绿色探针，长波长的红色探针具有诸多优点：(1)红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用；(2)红色探针具有更低的荧光背景干扰、更小的光毒性和更深的组织穿透能力。
然而对于cAMP探针，现有的红色探针具有以下不足：(1)在37℃培养哺乳动物细胞中亮度很低，不利于细胞的定位和神经元树突等微小细胞结构的观察。(2)在37℃培养哺乳动物细胞中动态范围(荧光亮度变化幅度ΔF/F0)很小，严重影响检测灵敏度。
因此，开发高性能红色探针，提高其在实际应用中的亮度和动态范围，对于提高探测灵敏度具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种动态范围大、检测灵敏度高，可检测细胞受刺激后cAMP浓度改变，可与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用，同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用的cAMP荧光探针R-Flamp2m及其应用和试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m，所述的R-Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步的，所述的荧光探针R-Flamp2m单光子的激发波长峰值为570nm。
进一步的，所述的荧光探针R-Flamp2m可在单光子的激发波长为550-570nm下使用。
本发明还提供一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的制备方法。
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的制备方法，所述的方法为：以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白连接，经过若干氨基酸突变，即得到R-Flamp2m探针；
R-Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)活体细胞培养，细胞密度60±5％时，转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；
(3)单光子的激发波长550-570nm下，荧光显微镜成像分析。
本发明还提供一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)荧光显微镜成像分析，其中单光子的激发波长550～570nm。
本发明还提供另一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)单光子的激发波长550-570nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为每15秒一帧，在第十帧加入Forskolin，至Forskolin终浓度60μM，检测R-Flamp2m探针荧光的强度变化。
本发明还提供一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的应用。
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m在检测cAMP中的应用。
本发明还提供另一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的应用。
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m在活细胞和/或动物活体中检测cAMP中的应用。
本发明还提供一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的试剂盒。
一种包含荧光探针R-Flamp2m的试剂盒。
本发明提供的荧光探针R-Flamp2m，以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白通过图1所示方式连接，经过若干氨基酸突变，即得到R-Flamp2m探针。
本发明提供的荧光探针R-Flamp2m为红色cAMP探针，激发波长峰值为570nm，发射波长峰值约600nm。37℃生理温度培养细胞中，R-Flamp2m在550-570nm单光子激发下，动态范围(ΔF/F0)约为10，较R-Flamp1m(ΔF/F0约为6)提高66％左右，动态范围更大，且在细胞成像中具有更高的检测灵敏度。R-Flamp1m氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供的荧光探针R-Flamp2m，是目前动态范围最大的红色cAMP探针。
与绿色cAMP探针相比，本发明提供的荧光探针R-Flamp2m是红色探针。红色探针能够与已有的大量绿色探针或者蓝光敏感的工具蛋白联合使用，可同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用。
将本发明提供的荧光探针R-Flamp2m表达在哺乳动物细胞中，利用普通的荧光显微镜，即可检测细胞受特定刺激后cAMP浓度改变。
与现有技术相比，本发明提供的一种cAMP荧光探针R-Flamp2m及其应用和试剂盒的优点：
(1)动态范围更大。
(2)检测灵敏度高。
(3)可以用在活动物体的cAMP信号检测中。
(4)应用范围广，可与短波长(400-500nm)探针或光敏蛋白联合使用。
附图说明
图1是本发明提供的R-Flamp1m及R-Flamp2m的组成示意图，其中，His为蛋白纯化标签，mApple-N和mApple-C分别为为红色荧光蛋白mApple的氨基端部分和羧基端部分(2个部分构成探针的荧光模块)，mEpac1(205～353)为可结合cAMP的结构域(感应模块)，连接肽1和连接肽2为感应模块与荧光蛋白不同部分的连接部分；
图2是本发明提供的R-Flamp1m及R-Flamp2m序列比对；
图3是R-Flamp1m和本发明提供的R-Flamp2m探针的亲和力曲线比较，其中，R-Flamp1m和R-Flamp2m探针在不同cAMP浓度下的荧光响应。表达探针的细菌悬浮在pH＝7.2的HEPES缓冲液，超声破碎后，取上清液测量探针对不同浓度cAMP的响应；
图4是R-Flamp1m和本发明提供的R-Flamp2m在HEK293T细胞中的亮度比较；
图5单光子激发下，Flamp1m和本发明提供的R-Flamp2m探针在HEK293T细胞中的响应，其中，(A)为加Fsk刺激前后代表性荧光图片；标尺：20μm；激发波长为568nm±10nm，荧光接收波长为630nm±25nm；(B)为荧光变化曲线；曲线数据表示：平均值±均值标准误差(Standard error of mean，SEM)。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m，所述的R-Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步的，所述的荧光探针R-Flamp2m单光子的激发波长为570nm。
进一步的，所述的荧光探针R-Flamp2m可在单光子的激发波长为550-570nm下使用。
本发明还提供一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的制备方法。
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的制备方法，所述的方法为：以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白连接，经过若干氨基酸突变，即得到R-Flamp2m探针；
R-Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)活体细胞培养，细胞密度60±5％时，转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；
(3)单光子的激发波长550-570nm下，荧光显微镜成像分析。
本发明还提供一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的live cell imaging buffer；
(3)荧光显微镜成像分析，其中单光子的激发波长550-570nm。
本发明还提供另一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法。
一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的live cell imaging buffer；
(3)单光子的激发波长550-570nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为每15秒一帧，在第十帧加入Forskolin，至Forskolin终浓度60μM，检测R-Flamp2m探针荧光的强度变化。
本发明还提供一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的应用。
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m在检测cAMP中的应用。
本发明还提供另一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的应用。
一种cAMP荧光探针R-Flamp2m在活细胞和/或动物活体中检测cAMP中的应用。
本发明还提供一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的试剂盒。
一种包含荧光探针R-Flamp2m的试剂盒。
实施例1
R-Flamp2m的构建
结合图1所示，以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白通过图1所示方式连接，经过若干氨基酸突变，即得到R-Flamp2m探针。R-Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。R-Flamp1m的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
His为蛋白纯化标签，mApple-N和mApple-C分别为为红色荧光蛋白mApple的氨基端部分和羧基端部分(2个部分构成探针的荧光模块)，mEpac1(205～353)为可结合cAMP的结构域(感应模块)，连接肽1和连接肽2为感应模块与荧光蛋白不同部分的连接部分。
实施例2
R-Flamp2m探针的激发和发射光谱
将R-Flamp2m探针表达在细菌中，室温培养3天收集菌体，在pH7.2的HEPES缓冲液(含150mM KCl及50mM HEPES)中超声破碎，然后离心获取上清液(含探针)。
取120μL探针溶液，利用多功能酶标仪Infinite M1000 PRO检测探针对不同cAMP浓度的的响应。荧光的激发波长为560±5nm，接收波长为610±10nm。获取ΔF/F0与cAMP浓度的曲线，即可比较R-Flamp1m与R-Flamp2m在不同cAMP浓度下动态范围，结果如图3所示。
从图中可知，本发明提供的R-Flamp2m的动态范围ΔF/F0更大，检测灵敏度更高。
实施例3
R-Flamp1m和R-Flamp2m在HEK293T细胞中的亮度比较
HEK293T细胞培养在12孔板中，培养基为含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗(penicillin-streptomycin)的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％。用Lipofectamine2000试剂盒转染相同质量的可表达R-Flamp1m或R-Flamp2m的质粒至不同孔的细胞中。约40小时后，用无色透明的live cell imaging buffer清洗细胞一遍，然后将细胞重悬在200μl的活细胞荧光成像缓冲液(live cell imaging buffer)中，转移至96孔酶标板，37℃静置10分钟后，用酶标仪检测细胞的荧光强度，结果如图4所示。
实施例4
单光子激发下，Flamp1m和R-Flamp2m探针在HEK293T细胞中的响应
将HEK293T细胞培养在玻璃底的培养皿中，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％。
细胞密度为60％左右时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R-Flamp1m或R-Flamp2m质粒。
过夜培养后，用不含血清和酚红的培养基(购自GIBCO公司)饥饿细胞2到4小时，然后将培养基换为无色透明的live cell imaging buffer，采用本实验室自行搭建的IX83单光子荧光显微镜(激发波长568nm±10nm，发射波长630nm±25nm)进行成像分析。成像频率为每15秒一帧，在第十帧加入Forskolin(购自碧云天生物技术公司)，Forskolin终浓度为60μM(培养皿中有500微升live cell imaging buffer，将4μL 12mM的母液溶于300微升live cell imaging buffer中，第十帧时将稀释好的300微升Forskolin溶液滴入正在成像的细胞皿中)。
Forskolin刺激后，细胞中R-Flamp1m和R-Flamp2m荧光强度的变化，结果如图5所示。至此完成哺乳动物细胞内cAMP浓度变化的荧光成像步骤。
图5中的曲线数据表示：平均值±标准差；ΔF/F0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。
从图5中可以看出，HEK293T细胞经Forskolin刺激后，R-Flamp2m相对于Flamp1m具有更大的信号变化幅度(ΔF/F0)，在动态范围和灵敏度方面有了很大的提高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种cAMP荧光探针R-Flamp2m，其特征在于：所述的R-Flamp2m的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种cAMP荧光探针R-Flamp2m，其特征在于：所述的荧光探针R-Flamp2m在单光子的激发波长为550-570nm下使用。
3.根据权利要求1或2所述的一种cAMP荧光探针R-Flamp2m，其特征在于：所述的荧光探针R-Flamp2m单光子的激发波长峰值为570nm。
4.一种cAMP荧光探针R-Flamp2m的制备方法，其特征在于，所述的方法为：以能够结合cAMP的mEpac1为感应结构域，与mApple荧光蛋白连接，经过若干氨基酸突变，即得到R-Flamp2m探针；
R-Flamp2m的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)活体细胞培养，细胞密度60±5％时，转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的缓冲液；
(3)单光子的激发波长550-570nm下，荧光显微镜成像分析。
6.一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)荧光显微镜成像分析，其中单光子的激发波长550-570nm。
7.一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的DMEM，培养温度为37℃，CO2含量为5％；
细胞密度60±5％时，用Lipofectamine 2000试剂盒转染R-Flamp2m质粒；
(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4h后，将培养基换为无色透明的荧光成像用缓冲液；
(3)单光子的激发波长550-570nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为每15秒一帧，在第十帧加入Forskolin，至Forskolin终浓度60μM，检测R-Flamp2m探针荧光的强度变化。
8.一种cAMP荧光探针R-Flamp2m在检测cAMP中的应用。
9.一种cAMP荧光探针R-Flamp2m在活细胞和/或动物活体中检测cAMP中的应用。
10.一种包含权利要求1～9任意一项所述的荧光探针R-Flamp2m的试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210187183.7A CN116693689A (zh) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | cAMP荧光探针R-Flamp2m及其应用和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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Family Applications (1)
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Country Status (1)
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-
2022
- 2022-02-28 CN CN202210187183.7A patent/CN116693689A/zh active Pending
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