CN116693491A - 一种天然儿茶素及其制备方法 - Google Patents

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陈晓琼
加峰
朱国旭
刁冰清
陆炫宗
杨小莉
张红宇
徐培洲
廖泳祥
周浩
刘禹彤
吴先军
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Abstract

本发明涉及一种天然儿茶素及其制备方法，从红米中提取出该天然儿茶素，取红穤米粉碎，将经过破碎的红穤米与乙醇溶液混合在超声作用下提取，随后进行固液分离将液相通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和浓缩液，再通过分离纯化柱分离并通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和类黄酮化合物浓缩液，采用层析柱分离类黄酮化合物浓缩液得到儿茶素。该儿茶素能够降低PEPCK、G6pase的活性、促进糖原合酶GYS2的活性，还能够提高AKT基因的表达并抑制PEPCK、PGC‑1、FoxO1基因表达以阻碍糖异生同时促进糖原合成以降低血糖。

Description

一种天然儿茶素及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药保健品领域，尤其涉及一种天然儿茶素及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素利用缺陷引起的。长期保持高血糖，会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害。胰岛素利用缺陷又称胰岛素抵抗，是指正常的胰岛素分泌水平下，胰岛素靶细胞摄取和利用葡萄糖的生理作用大大减弱。导致胰岛素抵抗的原因主要包括炎症假说和氧化应激。自由基和活性氧已被证明在哺乳动物糖调节系统中起重要作用。与糖尿病、胰岛素抵抗和代谢综合征相关的促氧化剂环境的形成可能主要是由于细胞氧化应激的能力降低导致的。糖尿病和胰岛素抵抗也与总抗氧化活性、SOD活性、GPx 活性和谷胱甘肽还原酶活性的降低有关。
糖尿病的治疗主要从抑制葡萄糖的吸收、改善胰岛B细胞功能、组织胰岛素抵抗、降低氧化应激和提高抗氧化活性几个方面入手。目前糖尿病的治疗主要以注射胰岛素或口服降糖药为主。糖尿病主要包括两类，I型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。诊断为I型糖尿病的个体需要每天通过注射或者泵递送胰岛素，而诊断为Ⅱ型糖尿病的个体由于存在胰岛素抵抗，口服降糖药几乎不产生效果，患者只能依靠注射胰岛素；而随着胰岛素需求量的升高，胰腺会逐渐失去产生胰岛素的能力。补充外源胰岛素的方式能够弥补患者的胰岛素分泌不足，但胰岛素本身成本较高，给患者带来的经济负担较重。因此现有较多针对降糖的辅助性食物的研究，例如CN104069098B提供了一种用于调节糖尿病的异戊二烯类黄酮化合物，特别是涉及一种异戊二烯类黄酮化合物的新颖用途，其用于制备调节血糖的组合物，组合物可用于治疗或预防糖尿病。该发明还公布了将一种中国台湾绿蜂胶或其萃取物用于制备治疗或预防糖尿病的药剂的用途。类黄酮类的某些物质用于降血糖血脂以及抗氧化的效果已经被广泛报道，但类黄酮类物质的种类广泛，各种类针对具体病症的使用效果也各异，仍有较多种类的类黄酮类物质的效果和应用有待研究。类黄酮是大米中的主要活性成分，但其种类繁多，且不同大米内的类黄酮的种类及含量不同，因此实际产生降糖作用的成分及成分的有效作用量并不明确，且目前并无任何报告公布或现有技术使用大米中的类黄酮有效成分用于降糖药物制备。
此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。
发明内容
针对现有技术之不足，本发明提供了一种天然儿茶素，是从大米中提取出的。
根据一种优选的实施方式，所述大米是有色稻。
本发明还提供一种如前述的天然儿茶素用于制备预防和治疗糖尿病及其并发症的药物的用途。
根据一种优选的实施方式，所述天然儿茶素能够抑制PEPCK和G6pase的活性并提高糖原合酶 GYS2的活性以阻碍糖异生同时促进糖原合成从而降低血糖。
根据一种优选的实施方式，所述天然儿茶素能够提高AKT基因的表达并且抑制PEPCK、PGC-1、 FoxO1基因表达以阻碍糖异生并且促进糖原合成从而降低血糖。
根据一种优选的实施方式，所述天然儿茶素是作为药剂、健康食品或膳食补充品使用的。
根据一种优选的实施方式，所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。
本发明还提供一种天然儿茶素的施用方法，经注射或口服向患者施用有效量的如前所述的天然儿茶素。
本发明还提供一种如前述的天然儿茶素的制备方法，取红穤米粉碎，将经过破碎的红穤米与乙醇溶液混合在超声作用下提取，随后进行固液分离将液相通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和浓缩液，通过分离纯化柱分离并通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和类黄酮化合物浓缩液，采用层析柱分离类黄酮化合物浓缩液得到儿茶素。
本发明还提供一种红米提取物用于制备糖尿病及其并发症中预防和治疗药物中的用途，所述红米提取物为类黄酮类物质。
附图说明
图1是本发明在四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠体内评估超氧化物歧化酶活性的结果数据；
图2是本发明不同水稻瓶中对高脂血症模型小鼠血脂水平的影响数据；
图3是本发明不同水稻品种对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖浓度的影响结果数据；
图4是本发明在四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠体内检测多酚含量的结果数据；
图5是本发明的UHPLC的结果数据图；
图6是本发明根据UHPLC测出的三种水稻品种中的C3G、P3G、儿茶素和表儿茶素的含量数据；
图7是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验用到的主要试剂表；
图8是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验用到的主要仪器表；
图9是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验中测量糖原含量的加样表；
图10是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验中的反转录反应体系；
图11是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验中的定量PCR体系；
图12是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验中的电泳缓冲液的配制表；
图13是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验中的转膜缓冲液的配制表；
图14是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验中的TBST缓冲液的配制表；
图15是本发明水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用实验中的SDS-PAGE胶的配制表；
图16是本发明不同浓度类黄酮成分处理后对HepG2细胞的存活率影响结果图；
图17是本发明诱导的不同药物对IR的HepG2细胞的葡萄糖消耗的影响结果图；
图18是本发明诱导的不同药物对IR的HepG2细胞的葡萄糖摄取的荧光图像和定量分析；
图19是本发明高糖和PA对HepG2细胞诱导的不同类黄酮成分对糖原含量的影响结果图；
图20是本发明不同类黄酮成分诱导下PEPCK、G6P、GYS2酶活检测结果图；
图21是本发明的不同类黄酮成分诱导下糖代谢相关基因的RT-qPCR结果图；
图22是本发明的不同类黄酮成分诱导下糖代谢途径中关键基因的蛋白WB；
图23是本发明的不同类黄酮成分诱导下糖代谢途径中关键基因的表达水平；
图24是本发明的RT-qPCR的定量引物列表。
具体实施方式
下面结合附图1-24进行详细说明。
实施例1
本实施例公开一种天然儿茶素，该天然儿茶素来自于有色稻中。优选地，该有色稻为红米红穤。
根据一种优选的实施方式，所述天然儿茶素是作为药剂、健康食品或膳食补充品使用的。
根据一种优选的实施方式，所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。
根据一种优选的实施方式，所述糖尿病还能够是Ⅰ型糖尿病。
本发明还提供一种如前述的天然儿茶素的施用方法，经注射或口服向患者施用有效量的所述天然儿茶素或包含有效量如前所述的天然儿茶素的降糖药物组合物。
实施例2不同水稻品种对糖尿病小鼠的降血糖作用
1.1材料与试剂
1.1.1材料
籼稻品种：红穤(红米)、联鉴33(黑米)和宜香1B(白米)。水稻植株于2018年4月至9月在中国四川省成都市温江区(北纬30°429，东经103°509，海拔539.3m)的稻田中栽培。用红穤、联鉴33、宜香1B成熟颖果进行体内SOD活性、血糖和血脂分析。
128只健康雄性昆明小鼠和ICR小鼠(18-22g，购自成都大硕实验动物有限公司)。每个笼子中饲养四只小鼠，环境温度(24±1℃)和湿度(50±10％)，光照/黑暗周期为(12:12h)，所有实验在上午10:00至下午15:00进行，按照成都中医药大学实验动物管理规定进行。
1.1.2试剂与仪器
葡萄糖类似物、四氧嘧啶、矢车菊素-3-葡萄糖苷、芍药苷-3-葡萄糖苷、儿茶素和表儿茶素；盐酸二甲双胍片(中美上海斯奎布制药有限公司)；总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒和 SOD试剂盒(中国科学院成研究所生物)；血糖测试条(ACCU-CHEK 145施乐)；COSMOSIL C18 (4.6mm I.D×150mm I.D)、SPD-M20A(UV-278nm)。
1.2实验方法与步骤
1.2.1样品制备
使用超速离心研磨机研磨从每个水稻品种中随机选择的颖果。将精米粉末(2.0g)在1％盐酸甲醇中浸泡，然后在室温下搅拌连续提取12h。用1％盐酸甲醇将提取物的总体积调节至50mL。提取的样品用于UHPLC分析。大米样品的制备方法是称取米粉7.5g(米粉过120目筛)，然后与纯水混合定容至50mL。大米样品每两天制备一次。按照0.2mL/10g的体积，通过灌胃给小鼠喂食。大米样品在小鼠体内的剂量为3g/kg。
1.2.2糖尿病小鼠血糖、肝指数和SOD活性测定
通过单剂量腹膜内注射溶解在盐水中的新鲜四氧嘧啶(280mL/kg)诱导糖尿病小鼠，而非糖尿病对照小鼠只注射0.9％的NaCl溶液。在给药后，所有的老鼠都被转移到笼子里。在给药后72h，从 12h禁食小鼠的尾静脉收集血样，用血糖仪分析血糖。选择血糖浓度高于11.1mmol/L的小鼠，然后将小鼠平均分配到五个组中，包括二甲双胍组、模型组和三种米组(黑米组、红米组和白米组)。此外，还有由未经处理的小鼠组成的空白组。将粉末大米样品和盐酸二甲双胍溶于纯净水。将溶解的米溶液以3g/kg体重的剂量通过管饲法给予三个不同的米组，持续19天(大米组)。溶解的二甲双胍以1.25g/kg体重的剂量通过灌胃给药(二甲双胍组)，空白组和模型组仅用纯水给药。血样通过切断禁食12h的小鼠的尾尖获得，并在第5、10、15和19天用血糖仪测量。肝匀浆在0.9％的NaCl溶液中制备，用试剂盒测定SOD活性。
1.2.3糖尿病小鼠血脂测定
将雄性ICR小鼠随机分为六组，包括三个大米试验样品组(黑米组、红米组和白米组)、二甲双胍组、模型组和空白组。三个大米实验样品组以3g/kg的剂量通过灌胃给予不同的水稻品种；模型组和空白组用纯水代替。所有组均给药18天，在第18天最后给药后2h，除空白组外，所有组均腹腔注射75％蛋黄乳剂(0.2mg/10g)。腹腔注射后9h，所有小鼠禁食11h，然后给不同组施用不同的测试样品溶液。最终给药后1h，从小鼠收集全血样品，并以3500r/min离心10min以收集血清。血清中的总胆固醇和甘油三酯含量使用试剂盒测量。
1.2.4超高效液相色谱法定量
使用UHPLC系统进行表儿茶素和儿茶素的分离。使用10μL的注射体积，并在室温下以1mL/min 的流速操作。使用甲醇CH3OH(溶剂A)和H2O/H3PO4＝99.95/0.05，v/v(溶剂B)的系统进行如下洗脱：0-3min，25％A和75％B；C3G和P3G注射量和操作条件(与儿茶素相同)进行，在紫外 530nm下检查分光光度值。使用CH3OH/H2O＝1/99，V/V(溶剂A)和CH3OH/C2H3N＝1/99，V/V (溶剂B)的系统进行洗脱，如下：0-2min，92％A和8％B；2-5min，88％甲和12％乙；5-10min， 82％甲和18％乙；10-12min，80％甲和20％乙；12-15min，75％甲和25％乙；15-18min，70％A 和30％B；18-20min，55％甲和45％乙；20-22min，20％甲和80％乙；22-30min，92％A和8％B。使用四种标准品，C3G、P3G、表儿茶素和儿茶素，在三个大米样品中进行定量分析。将大米样品的峰值时间与标准的峰值时间进行比较，并且使用UHPLC来量化每个大米样品中每个检测到的类黄酮成分的结果。重复三次。
1.3数据统计与分析
统计分析选用SPSS 16.0 for Windows统计软件，各数据使用平均值±标准偏差表示。两个均值的比较采用Student's t检验、多组比较用Duncan's检验进行方差分析和显著性检验，p<0.05认为有统计学显著性意义。
1.4结果与分析
1.4.1红穤显著降低血糖水平
在19天的实验过程中，相比空白对照组(5.31±0.89mmol/L)，糖尿病模型小鼠(23.06± 0.55mmol/L)的血糖水平显著高于对照组，表明成功构建了糖尿病模型小鼠。在实验的第5、10、 15和19天分别采集血样，用以测量糖尿病小鼠的血糖。如图3结果表明，与模型组相比，二甲双胍、宜香1B(白米)、联鉴33(黑米)组小鼠在连续给药5天后均表现出轻微的降血糖作用。相比之下，红米组无效果。与模型组相比，二甲双胍组在连续给药10天后表现出显著的降低血糖效应，血糖指数(11.16mmol/L)比模型组(21.33mmol/L)降低了48.69％。然而，这种效应随着治疗持续时间的延长而降低；连续给药15天和19天后，二甲双胍组降低血糖的百分比分别为31.85％和10.84％。关于三种不同大米组的比较，在连续给药10天后，模型组血糖值达到21.33mmol/L，红穤组小鼠表现出比联鉴33和宜香1B组更好的降血糖效果，红穤组(19.88mmol/L)与模型组相比降低了20％。连续给药15天后，红穤组的降血糖作用增强，相比模型组(20.08mmol/L)降低率为45％。连续给药19天后，只有红穤组仍表现出明显的降血糖作用，降血糖率仍保持在30％以上。联鉴33组在15 和19天的降血糖作用仅为红穤组的三分之一，而宜香1B组的降血糖作用最弱。
1.4.2红穤对甘油三酯有轻微影响
如图2对急性高脂血症模型小鼠的血脂分析表明，相比模型组，三个水稻品种几乎没有降低总胆固醇。甘油三酯分析表明，宜香组(3.18mmol/L)相比模型组(7.33mmol/L)显著降低，其次红穤组，比模型组降低甘油三酯(2.04mmol/L)27.86％。然而，联鉴33组小鼠(7.2mmol/L)与模型组相比甘油三酯并未显著降低。红穤轻微降低甘油三酯。
1.4.3 SOD活性和多酚含量检测
在四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠体内评估超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)活性。如图1所示的结果表明，白米宜香1B组小鼠的SOD活性低于黑米联鉴33和红米红穤组小鼠。红穤组小鼠具有最高的SOD活性(610.47U/mg prot)，其次是黑米联鉴33组小鼠的SOD活性 (582.16U/mg prot)，白米宜香1B组小鼠的活性最低(487.25U/mgprot)，红穤和联鉴33组小鼠的SOD活性和宜香1B组小鼠成显著性差异。
多酚含量的检测结果表明黑米联鉴33的多酚含量最高，达到2mg/g，其次是红米红穤含量为 1.5mg/g，白米宜香1B的多酚含量最低，仅为0.5mg/g，三者之间均存在显著的差异(图4)。
高血糖会导致抗氧化酶的糖基化，同时降低抗氧化酶的活性，高血糖代谢紊乱，同时抗氧化剂的水平遭到抑制，明显影响机体清除自由基的能力。抗氧化酶例如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等。而红米红穤组小鼠的SOD活性含量显著高，说明其未被抑制。
综上所述，有色水稻品种对血糖活性有较强的降低作用，红米红穤的效果最好，其次是联鉴33，宜香1B几乎没有表现出降血糖作用。相比之下，三个水稻品种均表现出较低的降血脂效果。而三个品种中黑米的多酚含量最高，但是降糖效果没有红穤高，因此，进一步进行超高效液相色谱检测三个品种中的显著差异成分，以便发现在降低血糖效果中起关键作用的重要成分。
1.4.4花青素、儿茶素和C3G、P3G的鉴定与定量
根据如图5和图6所示的UHPLC的结果，A是标准儿茶素和表儿茶素的混合色谱图；B是红穤米(红米)的色谱图；C是联鉴33(黑米)的色谱图；D是宜香1B(白米)的色谱图；E是花青素-3- 葡萄糖苷(C3G)和芍药素-3-葡萄糖苷(P3G)的混合色谱图；F是红穤色谱图；G是联鉴的色谱图； H是宜香1B的色谱图。在联鉴33(黑米)中鉴定到两种花色素苷C3G和P3G，含量分别为18.37mg/kg 和7.12mg/kg(图5G)。且C3G是主要的花色素苷，是P3G的2.6倍。儿茶素和表儿茶素仅在红穤中检测到，含量分别为193.68mg/kg和42.51mg/kg(图5B)。宜香1B不含上述4种类黄酮成分(图 5D，H)。UHPLC的结果说明三个品种中的花青素、儿茶素和C3G、P3G差异极为显著。因此，本研究推测，上述四种差异成分可能是使得三种大米在小鼠中产生不同生理效应的功能成分。
1.5讨论
根据动物实验，通过比较三个水稻品种(宜香1B、红穤和联鉴33)提取物在糖尿病模型小鼠中降糖、降脂和抗氧化作用。结果显示，红米红穤能显著降低糖尿病小鼠的血糖水平，相比白米，黑米联鉴33和红米红穤能够提高模型小鼠的抗氧化水平。根据如图5和图6所示的UHPLC结果，三种稻米中差异成分主要是儿茶素、表儿茶素、C3G和P3G，前两者在红米红穤中富集，后两者在黑米联鉴33中富集，而白米宜香1B均不含这四种类黄酮成分。
本申请中，通过检测SOD及多酚含量在三个品种中的差异和超高效液相色谱法分析，结果显示红米中的类黄酮物质儿茶素和表儿茶素的含量最高，显著高于联鉴33和宜香1B；黑米中的C3G和 P3G的含量最高，显著高于红穤和宜香1B，白米中均不含上述四种类黄酮成分，结合动物实验结果、代谢组学分析及前人的研究，推测红米的功能成分主要是儿茶素、表儿茶素，而黑米联鉴33的功能成分主要是C3G和P3G。
实施例3水稻类黄酮成分对HepG2细胞糖代谢调控的作用
2.1材料与试剂
2.1.1材料
儿茶素、表儿茶素、C3G、P3G标准品。
人体肝癌细胞HepG2(Thermo)。
2.1.2试剂与仪器
如图7和图8所示。
2.2实验方法与步骤
2.2.1细胞培养和处理
在37℃，5％的CO2条件下，在添加10％胎牛血清、100IU/mL青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中培养人肝癌细胞HepG2。在细胞达到70-80％融合后，用PBS洗涤细胞两次，用正常葡萄糖(5.5mM)或高葡萄糖(30mM)加棕榈酸(PA)(0.2mM)孵育24h。用正常葡萄糖(5.5mM) 处理的细胞用作阴性对照，用二甲双胍(2mM)处理的细胞用作阳性对照，不同浓度的C3G、P3G、儿茶素和表儿茶素做样品处理组。
2.2.2细胞毒性试验
(1)HepG2细胞长满后用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度(6-8)×104cells/mL，接种于96 孔培养板中，在37℃，5％CO2的条件下培养24h；
(2)更换含药的培养基100μL，每组设置3个复孔，培养24h；
(3)每孔加入10μL的MTT，避光孵育3-4h。
(4)吸净孔内的液体，加入200μL的DMSO，震荡10min。
(5)酶标仪490nm测OD值。
2.2.3葡萄糖消耗测定
(1)用无糖培养基配置30mM葡萄糖的无血清培养基，用其稀释棕榈酸为终浓度0.2mM备用。
(2)胰岛素抵抗模型的建立：HepG2细胞指数期传代，接种于24孔板中，37℃培养24h后，弃去上清液，用不含血清的基础培养基饥饿12h，弃去上清液，用PBS清洗2次，按照上述分组，设置空白对照组(不含细胞)、正常对照组、模型组和药物组，除对照组不做处理，其余组加入PA (0.2mmol/L)的无血清含30mM葡萄糖培养基诱导12h，模型建立后更换含药或不含药培养基继续培养24h；
(3)24h后收集细胞上清测定细胞上清中的葡萄糖含量计算葡萄糖消耗量。
2.2.4葡萄糖摄取测定
(1)用无糖培养基配置30mM葡萄糖的无血清培养基，用其稀释棕榈酸为终浓度0.2mM备用
(2)HepG2细胞指数期传代，接种于24孔板中，37℃培养24h后，弃去上清液，用不含血清的基础培养基饥饿12h，弃去上清液，用PBS清洗2次，加入含有棕榈酸(0.2mmol/L)的无血清含 30mM葡萄糖培养基诱导12h，模型建立后更换含加有样品的培养基继续培养24h；
(3)10mg/mL母液用基础培养基稀释成50μM备用；
(4)吸弃细胞培养基，用探针工作液避光孵育10-30min，观察荧光强度。
2.2.5糖原含量的测定
(1)细胞沉淀加0.75mL提取液超声波破碎细胞，BCA法测定蛋白含量；
(2)煮沸20min，每隔5min震荡混匀，用蒸馏水定容至5mL，混匀待测；
(3)试剂二中加入6mL蒸馏水，缓慢倒入24mL浓硫酸，混匀；
(4)按图9加样混匀至1.5mL EP管中；
(5)95℃水浴10min，吸取200μL至96孔板中，重复3次，测定620nm处的吸光值，计算糖原含量；
(6)糖原(mg/mg prot)＝1.11*(Cb标准*V1)*(A3-A1)/(A2-A1)/(V1*Cpr)＝0.111*(A3-A1) /(A2-A1)/Cpr
2.2.6细胞qPCR分析
2.2.6.1 Trizol法提取RNA
(1)在6孔板中加入Trizol试剂；
(2)加入100μLTrizol溶液，并用振荡器震荡均匀约1min；
(3)室温放置5min，使其充分裂解；
(4)加入200μL氯仿，振荡器震荡30min；
(5)室温放置3min；
(6)4℃，12000r/min离心15min；
(7)吸取上层水相(约400μL)至新的EP管中；
(8)加入500μL异丙酮，上下颠倒摇匀，室温放置20min；
(9)4℃，12000r/min离心10min，弃上清(RNA沉于管底)；
(10)加入1000μL 75％乙醇(DEPC-H2O配置)，4℃，12000r/min离心5min，弃上清；
(11)加入700μL无水乙醇，15℃，12000r/min离心5min；
(12)晾干EP管中加入DEPC-H2O溶解RNA，用枪头反复拨打几次，常温放置10-20min；
(13)电泳检测，核酸仪器检测，记录OD值，吸收峰值曲线、浓度。
2.2.6.2 RNA反转录
根据核酸仪所测得的RNA浓度，计算模板RNA和ddH2O的用量。反应体系如图10。
(1)基因组DNA去除：配制体系，移液枪吸打混匀，42℃，2min；
(2)反转录：在完成第一步的EP管里加入4μLⅡ qRT SuperMixⅡ轻轻吸打混匀。进行反转录，50℃，30min；85℃，5sec。
2.2.6.3荧光定量PCR，PCR体系如图11所示，PCR引物如图24所示。
在图24中，引物序列从上到下依次是Homo-β-actin的引物1、引物2序列；Homo-PI3K的引物1、引物2序列；Homo-PEPCK的引物1、引物2序列；Homo-AKT2的引物1、引物2序列；Homo-FoxO1的引物1、引物2序列；Homo-GSK3β的引物1、引物2序列；Homo-PGC-1α的引物1、引物2序列；Homo-GYS2的引物1、引物2序列。
2.2.7细胞总蛋白的提取
细胞培养皿中加入适量裂解液(含1mM PMSF)，在冰上充分裂解后，用细胞刮收集至1.5mL离心管中，12000rpm，4℃离心15min，上清液即为提取好的蛋白样品，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后，保存在-80℃备用。
2.2.8 G6Pase、PEPCK、GYS2酶活检测
按照ELISA试剂盒说明书，分别测定各处理组细胞提取液中G6Pase、PEPCK和GYS2的含量，并根据蛋白浓度进行校正。
2.2.9 Western blot
2.2.9.1样品制备
(1)在基础裂解液中加入PMSF和TritonX-100；吸掉各组细胞的培养液，并将六孔板倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液。
(2)每孔细胞加1mL PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上；
(3)每孔细胞加裂解液150μL，冰上裂解30min，来回摇动培养板；
(4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于孔的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5mL 离心管中。4℃下12000rpm离心15min；
(5)BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白质的浓度；
(6)对蛋白浓度进行调整，保证各组蛋白浓度一致；按比例加入loading buffer，煮沸5min；
2.2.9.2电泳胶的制备
安装电泳装置，配置分离胶，将分离胶灌入玻璃板空隙内到适当的高度，用ddH2O覆盖分离胶，待胶完全聚合后倒出ddH2O，加入浓缩胶，插入梳齿。待浓缩胶凝固后取出梳齿。
(1)缓冲液的配置：如图12到图15所示。
(2)上样与电泳：将变性的蛋白上样到胶孔内。电压为80V，当溴酚蓝进入分离胶时，将电压调至150V，溴酚蓝到达胶的底端时，停止电泳。
(3)转膜与封闭：将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min；取出凝胶切下目的条带，PVDF膜和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。安装好转膜装置，夹紧板后放入转膜仪内。在转膜槽中加满缓冲液， 100V/100mA，然后用含3％BSA(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。
(4)抗体的孵育：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。 TBST洗涤PVDF膜5-6次洗去多余一抗，5min/次；按比例稀释二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h；TBST充分洗涤PVDF膜5-6次洗去多余二抗，5min/次。
(5)蛋白检测：在蛋白膜上加入ECL发光液，将膜放入仪器中曝光显影，得到清晰的条带。
2.3数据统计与分析
荧光图片和Western blot蛋白条带采用Image ProPlus 6.0软件统计光密度值。统计分析选用 SPSS 16.0 for Windows统计软件，各数据使用平均值±标准偏差表示。两个均值的比较采用Student's t检验、多组比较用Duncan's检验进行方差分析和显著性检验，p<0.05认为有统计学显著性意义。
2.4结果与分析
2.4.1类黄酮成分对HepG2细胞活性无显著影响
人体肝癌细胞HepG2是用于糖代谢及胰岛素抵抗研究的常用细胞。二甲双胍是用于治疗糖尿病的经典药物，因此用做阳性对照。
为了观察四种类黄酮标准品是否会对肝细胞产生毒性作用，用MTT法测定不同浓度类黄酮成分处理后对HepG2细胞的存活率影响。如图16所示，20mg/L以内的儿茶素对HepG2细胞活性无明显影响，在20mg/L和100mg/L条件下诱导时，细胞活力仅达到86.07％和70.03％；100mg/L以内的表儿茶素对HepG2细胞活性无明显影响；240mg/L以内的C3G对HepG2细胞活性无明显影响， 250mg/L以内的P3G对HepG2细胞活性无明显影响，二甲双胍浓度在1300mg/L以上诱导的细胞活力为78.2％。因此，选择上述浓度范围内的无毒标准品，进行细胞糖代谢指标的测定。
2.4.2类黄酮成分促进胰岛素抵抗(IR)模型细胞的葡萄糖消耗
胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和Ⅱ型糖尿病。将HepG2 细胞于30mM葡萄糖和0.2mM棕榈酸中培养24h，然后用胰岛素(100mM)孵育30min。如图17 所示，使用高糖和PA诱导IR的HepG2细胞，诱导的不同药物对葡萄糖消耗的影响。图中A是儿茶素组；B是表儿茶素组；C是C3G组；D是P3G组；E是二甲双胍组。与对照相比，模型组细胞的葡萄糖消耗和摄取明显减少，表明成功建立了肝细胞胰岛素抵抗模型。根据MTT实验，选择无细胞毒性的样品浓度，用以研究糖消耗、糖原含量和摄取。
葡萄糖消耗结果显示，以IR模型组为对照，四种类黄酮成分均表现出较好的效果(图17)。在相当低的浓度下，儿茶素处理组细胞的葡萄糖消耗量显著高于IR模型组，在0.1mg/L、0.8mg/L和 10mg/L剂量下葡萄糖消耗分别增加了11％、16％和26％；表儿茶素在5mg/L剂量时开始起作用，在50mg/L剂量时达到最高(4.87mmol/L)，在5mg/L、25mg/L和50mg/L浓度时，分别比IR模型组(3.20mmol/L)增加28％、35％和52％；P3G在250mg/L的浓度下对葡萄糖消耗值最高 (5.50mmol/L)，超过了对照组(5.30mmol/L)，相比IR模型组提高了72％。但是P3G需要更高的诱导剂量才会增加葡萄糖的消耗，如12.50mg/L剂量才开始对葡萄糖消耗产生影响；C3G与P3G相同，需要较高的诱导剂量，24mg/L剂量才开始出现显著的糖消耗效果；二甲双胍诱导剂量为13mg/L 时葡萄糖消耗量为4.83mmol/L，比IR模型组增加了67.51％，而随着剂量的增加，增加的作用不明显，例如在1300mg/L浓度下的葡萄糖消耗量仅比13mg/L增加了10％。
以上结果显示，和IR模型细胞相比，二甲双胍和四种类黄酮成分在一定浓度范围内可以显著促进葡萄糖的消耗。
2.4.3类黄酮成分促进IR模型细胞葡萄糖的摄取
2-NBDG，一种脱氧葡萄糖类似物的荧光素，常常用来直接监测活细胞和组织对葡萄糖的摄取，判断细胞活力的指标之一。2-NBDG荧光探针图像显示，使用儿茶素、表儿茶素、C3G和P3G诱导的肝癌细胞对葡萄糖摄取的贡献与二甲双胍诱导的相同(图18)。采用ImageProPlus 6.0软件统计光密度值结果显示，IR模型组细胞的光密度值最低(36AU)，处理组和对照组相比IR模型组光密度值均有显著的升高，其中药物二甲双胍组的值最高(96AU)，其次是对照组(95AU)，然后依次是表儿茶素(87AU)、P3G(85AU)、儿茶素(78AU)和C3G(75AU)。因此，二甲双胍和儿茶素、表儿茶素、C3G及P3G能够显著增加IR模型细胞的葡萄糖摄取。
2.4.4类黄酮成分促进IR模型细胞的糖原合成
糖原含量检测结果显示，在二甲双胍和四种类黄酮成分处理后都有助于促进糖原的合成(图19)。然而，不同类黄酮成分之间的结果存在差异。0.1mg/L的儿茶素比IR模型糖原含量增加了6％，在 20mg/L剂量糖原的合成最高，比IR模型组增加了39％。表儿茶素作为诱导剂比儿茶素、C3G和P3G 的效果更好，在5mg/L的剂量下和模型组相比呈现出极显著的差异，在50mg/L时糖原合成量提高了48％。C3G和P3G相比模型组糖原合成量也增加，但是诱导剂量更高，分别在48mg/L和50mg/L 剂量诱导下才开始出现显著差异，相比模型组糖原含量分别提高了33％和35％。
2.4.5类黄酮化合物抑制PEPCK和G6pase活性，促进GYS2活性
综上实验，二甲双胍、儿茶素、表儿茶素、C3G和P3G可以提高胰岛素抵抗模型细胞的葡萄糖消耗水平和糖原合成量，并综合上述结果，分别选取降糖效果最优的浓度：儿茶素10mg/L、表儿茶素50mg/L、C3G 240mg/L、二甲双胍650mg/L、P3G 250mg/L进行后续降糖机制的研究。
PEPCK和G6pase直接影响血糖浓度，它们在糖异生途径中起着关键作用。GYS2参与身体能量平衡。通过ELISA试剂盒检测肝细胞中酶活结果显示(图20)，在二甲双胍处理后，PEPCK的酶活活性(156.44ng/L)明显低于IR模型(212.85ng/L)。儿茶素(159.39ng/L)、表儿茶素(160.13ng/L)、 C3G(144.50ng/L)和P3G(145.06ng/L)诱导后酶活性与二甲双胍诱导结果相似，酶活水平基本和二甲双胍组相同，相比IR模型组具有显著差异。G6pase的活性在不同组分之间存在差异。50mg/L 的表儿茶素和10mg/L的儿茶素作为诱导剂处理细胞后显著抑制G6pase的活性，比胰岛素抵抗模型组分别降低14.82ng/L和10.76ng/L。相比之下，240mg/L的C3G和250mg/L的P3G仅分别下降了8.38ng/L和5.09ng/L，此外，650mg/L的二甲双胍作为阳性对照，显著抑制G6pase活性，降低13.95ng/L，各处理组均与IR模型组呈显著差异。GYS2是糖原合成的关键酶，GYS2的活性在表儿茶素组(215.39ng/L)几乎达到空白对照组(217.37ng/L)，其次是P3G组(172.51ng/L)，C3G 组(154.1ng/L)，儿茶素组(153.31ng/L)和二甲双胍组(121.58ng/L)。与IR模型组(109.32ng/L) 相比，四种类黄酮成分组均达到了显著差异。
以上结果显示，四种类黄酮物质儿茶素、表儿茶素、C3G、P3G及药物二甲双胍处理IR模型细胞后，相比模型组，样品组和药物组能够降低糖异生通路关键酶PEPCK和G6pase的活性、促进糖原合酶GYS2的活性来达到降低血糖的目的。
2.4.6类黄酮成分对IR模型细胞糖代谢调控机制研究
首先我们利用q-PCR检测糖代谢相关基因的表达水平(图21)。结果表明，经过诱导剂刺激后 PI3K的基因表达水平无明显变化，而AKT基因的表达显著提高。不同的诱导剂对AKT的影响存在差异，如经过药物诱导后，AKT的表达水平与阴性对照组相同；儿茶素和C3G组诱导后，AKT表达水平显著高于IR模型的表达水平。相对于AKT的表达，四种类黄酮成分显著抑制PEPCK、PGC-1、FoxO1 基因表达，且四种黄酮类化合物与药物二甲双胍作为诱导剂，呈现相同的诱导效应，如PEPCK和FoxO1 的表达水平几乎是IR模型的一半，并且降低到阴性对照的表达水平。基因GSK3在诱导的不同成分中表现出表达差异，例如C3G表达增加，但P3G、儿茶素和表儿茶素几乎不表现出作用，而二甲双胍表现出一定的抑制作用。基因GYS2通过不同的诱导因子同样表现出不同的诱导效应，例如，儿茶素和表儿茶素促进表达，以儿茶素为诱导因子几乎比在IR模型中提高了10倍以上，其次是表儿茶素，比IR模型提高了4倍以上，而C3G几乎不呈现诱导效应，表达水平与胰岛素抵抗模型相同。因此，四种类黄酮成分对糖代谢通路的不同基因呈现不同的诱导效应。
进一步进行蛋白实验，以便了解四种黄酮类成分的遗传机制(图22和图23)。如图22的蛋白 Western Blot结果显示，本研究中，经过四种类黄酮物质的诱导，和IR模型组相比，PI3K/AKT信号通路发生了改变。但各诱导剂的效应又有差异。如图23糖代谢途径中关键基因的表达水平结果显示。对照组和儿茶素作为诱导剂能够增加PI3K的蛋白磷酸化水平，而其余组的PI3K蛋白磷酸化水平比模型组降低，但是各组的PI3K表达水平均有显著升高。各组的AKT2的蛋白表达水平及AKT2和GSK3 β蛋白磷酸化水平均比模型组显著升高，其中C3G组的AKT磷酸化水平最高，几乎是模型组的5倍，其次是儿茶素和表儿茶素，达到模型组的3倍，P3G组的水平最低。对照组的GSK3β蛋白磷酸化水平最高，其次二甲双胍大约是模型组的两倍，P3G、儿茶素、表儿茶素、C3G依次降低，但都比模型组有显著的升高。同时FoxO1蛋白的磷酸化水平也有显著升高(图23)，最高的是空白对照组几乎是模型组的6倍，水平最低的是P3G组，不到模型组的2倍，且各组的GSK3β、FoxO1的蛋白表达水平也比模型组低，说明二甲双胍和四种类黄酮物质可能通过调节胰岛素信号转导途径PI3K/AKT来调节细胞的血糖水平。
综上所述，四种类黄酮物质儿茶素、表儿茶素、C3G、P3G及药物二甲双胍处理胰岛素抵抗模型细胞后，相比IR模型组，样品组能够促进AKT蛋白的磷酸化进而进一步磷酸化下游的GSK3β和 FoxO1，抑制其表达，促进糖原合成，同时提高糖原合酶的活性，从而导致细胞的糖原合成增多，葡萄糖的消耗增加，进而降低血糖水平。
2.5讨论
黑米和红米含有相当多的类黄酮成分，如花青素、儿茶素、表儿茶素，具有降低高血糖、抗氧化能力等。大量的研究表明，花青素可以降低高血糖、血脂和抗氧化能力，而C3G在降低血糖效应中起着重要作用。红米可能改善高血糖效应，其中起关键作用的成分仍然是花青素。细胞实验结果表明，黑米的C3G和P3G确实有助于降低血糖效应，但分别在48mg/L和50mg/L剂量诱导下开始呈现活性。最佳剂量分别为240mg/L和250mg/L。相比之下，儿茶素和表儿茶素对血糖效应表现出更好的效果，分别在0.1mg/L和5mg/L的诱导剂量下就开始呈现降糖活性。UHPLC结果显示红米红穤中儿茶素和表儿茶素的含量分别为193.68mg/kg和42.51mg/kg，黑米联鉴33含有C3G 18.37mg/kg 和P3G 7.12mg/kg。相比之下，从食物摄入儿茶素和表儿茶素的含量足以降低血糖水平，因为红穤含有儿茶素和表儿茶素的浓度已经达到了降糖效果的浓度。这也和动物实验结果对应，红穤能够显著降低模型小鼠的血糖水平，而黑米联鉴33没有明显的降糖效果是由于用于动物实验的黑米中的C3G和 P3G的浓度还没有达到降血糖需要的浓度。
经过HepG2细胞造模，模型组细胞的葡萄糖消耗相比对照组显著降低、葡萄糖的摄取相比对照组显著降低，而糖原的含量相比对照组有显著的升高，表明成功构建了胰岛素抵抗模型。而其余各个处理组细胞的葡萄糖消耗、摄取和糖原的含量发现，四种类黄酮成分相比模型组，能够促进葡萄糖的消耗和摄取、增加糖原的合成来达到降糖效果(图17、18、19)，表明四种类黄酮成分在IR模型细胞中有降糖效果。进一步研究类黄酮成分的降糖分子机制，在RNA和蛋白质水平上检测了糖异生和糖原合成相关的基因和蛋白表达，四种类黄酮成分对PI3K/AKT信号通路及其下游效应物的影响。 PI3K/AKT途径在葡萄糖摄取和代谢中起重要作用。胰岛素首先与靶细胞上的受体结合，使受体酪氨酸蛋白激酶活化，酪氨酸发生自身磷酸化引起构象改变，从而与三磷酸腺苷(ATP)及胰岛素受体底物(IRSs)接触，将受体底物蛋白的酪氨酸残基磷酸化。活化的胰岛素受体经PI3K/AKT信号转导途径进行信号转导，最终产生多种生物学效应，包括葡萄糖转运增加、抑制脂肪分解、糖原、蛋白及脂肪合成、抗细胞凋亡等。
PI3K/AKT信号途径：当血糖升高时，胰岛B细胞会分泌胰岛素，胰岛素分泌至靶细胞，与靶细胞上的受体α亚基结合，二者结合后会使受体β亚基的抑制得到解除，与ATP及胰岛素受体底物 (IRSs)的接触，使受体底物蛋白的酪氨酸残基磷酸化得到激活。活化的胰岛素受体主要经PI3K/AKT 信号转导途径进行信号转导(图1)，此途径是一系列磷酸化级联反应形成的：PI3K/AKT信号转导的第一个蛋白为PI3K，PI3K由p85亚基和p110亚基组成，活化的胰岛素受体底物首先与PI3K的调节亚基p85结合，结合后催化亚基p110得到活化从而激活PI3K，后者使PI磷酸化生成PIP2、PIP3， PIP3可将PIP3依赖的蛋白激酶-1(PDK-1)、非典型蛋白激酶C(aPKC)以及蛋白激酶B(AKT)募集至胞浆膜附近，进一步催化底物磷酸化，使糖原合成酶-3(GSK-3)磷酸化变成无活性形式，从而活化糖原合成酶，促进糖原合成，并通过抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)的活性来抑制糖异生。另一方面可促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的活性，来增加葡萄糖的摄取，最终产生多种生物学效应。包括葡萄糖转运增加、抑制脂肪分解、糖原、蛋白及脂肪合成、抗细胞凋亡、促进内皮细胞产生一氧化氮及特定基因表达等。
PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，在传递化学信号方面起着至关重要的作用，作为细胞中的第二信使，是胰岛素调控葡萄糖的摄取和葡萄糖转运蛋白GLUT4转位必须的信号分子。此外，在胰岛素信号转导途径，活化的胰岛素受体底物与PI3K调节亚基p85结合，使催化亚基p110活化激活PI3K，从而激活下游一系列蛋白磷酸化引起胰岛素信号的转导，本实验中定量结果显示，模型组和各处理组的PI3K基因转录水平无显著差异，检测PI3K蛋白的表达水平和磷酸化水平发现，经过四种类黄酮物质的诱导后能够显著的提高PI3K的蛋白表达(图23)，因此能够增强胰岛素敏感性，促进葡萄糖的转运，但是各组的PI3K的磷酸化水平没有呈现出相同升高趋势(图23)，可能PI3K并不是作用的靶位点，但是四种物质仍能增加PI3K的蛋白表达水平来促进葡萄糖的转运。
AKT是PI3K/AKT信号通路下游的一个关键节点，能够调节糖异生和糖原合成。本实验中儿茶素、表儿茶素、C3G、P3G和二甲双胍能够促进AKT的蛋白表达及磷酸化和GSK3β的蛋白磷酸化，同时降低GSK3β的总蛋白表达水平(图23)，GSK3β糖原合成酶激酶3是肝脏细胞糖代谢的关键酶，GSK3 β活性受到抑制后，又能进一步使GYS2的活性增强。因此，处理组的GYS2酶活活性相比模型组显著升高，从而导致了细胞合成的糖原含量增加。
另一方面，AKT的活化还可以促进Fox01磷酸化而抑制其从胞浆进入细胞核中，抑制其转录活性，从而抑制下游PEPCK和G6Pase表达，PEPCK催化葡萄糖的合成，G6Pase催化最后一步。Fox01 是forkhead家族转录因子的成员，能够调节成熟肝脏细胞的糖代谢，通过直接结合靶DNA序列以及与核受体的相互作用来调节PEPCK和G6Pase基因的表达，达到调节肝脏细胞糖异生的目的。此外， PGC-1α基因也参与调节肝脏中的糖异生途径，当PGC-1α表达过高时，会增强PEPCK和G6Pase的活性从而导致血糖升高。在肥胖和糖尿病条件下，肝脏中PGC-1α的表达升高，从而导致肝葡萄糖生成增加。PEPCK和G6Pase这两种酶都在葡萄糖的合成中起重要作用，两种关键酶受到抑制后糖异生也受到抑制。在本申请的研究中，经western blot检测FoxO1的蛋白磷酸化水平相比模型组有显著上升，FoxO1蛋白的表达水平降低(图23)，此外酶活检测结果也如预期，各处理组PEPCK和G6Pase 的酶活水平相比模型组显著降低，同时，FoxO1和PGC-1α基因的转录水平量有下调的趋势。
综合以上结果，四种类黄酮物质和药物二甲双胍均能促进PI3K/AKT信号通路来降低血糖，促进 PI3K的表达来促进葡萄糖的转运，同时促进AKT的磷酸化从而进一步促进GSK3β的磷酸化而抑制 GSK3β的活性，GSK3β的活性的减弱导致了GYS2活性的增强，增加糖原的合成。另一方面，AKT 磷酸化的增加还抑制了Fox01和PGC-1α的表达，导致PEPCK和G6Pase活性降低，糖异生过程减弱。
实施例4
本实施例还提供一种红米红穤降糖的应用。
实施例5
本实施例还提供一种如前述的天然儿茶素的制备方法，取红穤米粉碎，将经过破碎的红穤米与乙醇溶液混合在超声作用下提取，随后进行固液分离将液相通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和浓缩液，通过分离纯化柱分离并通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和类黄酮化合物浓缩液，采用层析柱分离类黄酮化合物浓缩液得到儿茶素。
实施例6
本发明还提供一种如前述的天然儿茶素的施用方法，经注射或口服向患者施用有效量的如前所述的天然儿茶素或包含有效量如前所述的天然儿茶素的药物组合物。
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种天然儿茶素及其制备方法
<130> 21CN1341AF
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 Homo-β-actin 引物1()
<400> 1
tcatgaagtg tgacgtggac atc 23
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列 Homo-β-actin 引物2()
<400> 2
caggaggagc aatgatcttg atct 24
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tggacggcga agtaaagcat t 21
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<400> 4
<213> 引物2()
agtgtgacat tgagggagtc g 21
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<400> 9
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ccgatggcag attccaaagg 20
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tgaagttgct tgggaagtga c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 Homo-GYS2()
<400> 16
<213> 引物2()
aggttcacac tgttccacct g 21

Claims (10)

1.一种天然儿茶素，其特征在于，是从大米中提取出的。
2.如权利要求1所述的天然儿茶素，其特征在于，所述大米是有色稻。
3.如权利要求1所述的天然儿茶素在制备预防和治疗糖尿病及其并发症的药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述天然儿茶素能够降低PEPCK和G6pase的活性、提高糖原合酶GYS2的活性以阻碍糖异生并且促进糖原合成从而降低血糖。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述天然儿茶素能够提高AKT基因的表达、降低PEPCK、PGC-1、FoxO1基因表达以阻碍糖异生并促进糖原合成从而降低血糖。
6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述天然儿茶素是作为药剂、健康食品或膳食补充品使用。
7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。
8.一种天然儿茶素的施用方法，其特征在于，经注射或口服向患者施用有效量的如权利要求1和2所述的天然儿茶素或含有有效量的如权利要求1和2所述的天然儿茶素的药物组合物。
9.一种如权利要求1和2所述的天然儿茶素的制备方法，其特征在于，取红穤米粉碎，将经过破碎的红穤米与乙醇溶液混合在超声作用下提取，随后进行固液分离将液相通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和浓缩液，再通过分离纯化柱分离并通过负压低温浓缩得到冷凝乙醇和类黄酮化合物浓缩液，采用层析柱分离类黄酮化合物浓缩液得到儿茶素。
10.一种红米提取物用于制备预防和治疗糖尿病及其并发症的药物的用途，其特征在于，所述红米提取物为类黄酮类物质。
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