CN116687941A - 用环吡酮、环吡酮胺或环吡酮前药治疗膀胱癌的方法 - Google Patents

用环吡酮、环吡酮胺或环吡酮前药治疗膀胱癌的方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供治疗膀胱癌的方法。治疗膀胱癌的方法可包括:提供药物组合物，其含有环吡酮或环吡酮胺或具有本申请所提供的结构式之一的结构的环吡酮‑POM前药或其衍生物或其立体异构体或其药学上可接受的盐；和将所述药物组合物给予患有膀胱癌的受试者。所述环吡酮或环吡酮胺或环吡酮‑POM前药可以治疗有效量给予。

Description

用环吡酮、环吡酮胺或环吡酮前药治疗膀胱癌的方法
本申请是中国发明专利申请(申请日：2015年11月10日；申请号：201580061284.8(国际申请号：PCT/US2015/059955)；发明名称：用环吡酮、环吡酮胺或环吡酮前药治疗膀胱癌的方法)的分案申请。
相关申请的交叉参考
本专利申请要求2015年3月18日提交的美国临时专利申请62/134,747的优先权。本专利申请还要求2014年11月11日提交的美国临时专利申请62/078,069的优先权。将前述临时申请通过专门提及全文并入本申请作为参考。
背景技术
分子6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮也被称作环吡酮(ciclopirox)，其是可商购的局部抗真菌剂。环吡酮已被用于治疗浅表性真菌病和花斑癣(Tineaversicolor)。可商购的局部药物产品中含有环吡酮的乙醇胺盐(olamine salt)。在口服给药于人后，环吡酮胺被完全吸收，接着发生迅速且完全的药物消除。环吡酮胺在人中的口服生物利用度还未见报道。然而，在动物中，口服环吡酮胺的绝对生物利用度很低。在动物和人中，已将反复口服给药环吡酮的乙醇胺盐与胃肠毒性关联起来。最后，环吡酮的乙醇胺盐不具有配制为可注射药物产品所需的水溶解度。因此，有利的是对环吡酮进行构造以提高水溶解度，目的是通过注射给予所述药物。
在美国，膀胱癌是第五大最常见的癌症诊断。由于患者具有高的复发和进展风险，因此就每位患者的寿命而言，膀胱癌是治疗起来最昂贵的癌症。尽管其有如此的发病率和流行率，但膀胱癌的研究资金不足，导致改善膀胱癌治疗的进展收效甚微。膀胱癌的范围内包括两种疾病，非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)(曾被称作“浅表性膀胱癌”)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。NMIBC可通过内镜切除术和膀胱滴注(膀胱内给药)给予局部疫苗和药物来治疗。MIBC需要更具攻击性的干预，通常为根治性膀胱切除术和/或全身化疗的形式。有三种类型的NMIBC病变，非浸润性乳头状癌(Ta)、固有层的肿瘤浸润(T1)和原位癌(Tis)。Ta和T1肿瘤分为低级别肿瘤和高级别肿瘤。高级别Ta和T1，以及Tis肿瘤具有较高的复发率，伴随中度至高度进展至MIBC的风险。内镜切除术和膀胱内治疗后，半数NMIBC患者会在12个月内复发。根据肿瘤类型和等级，即使有手术、免疫疗法和化疗干预，NMIBC的五年复发或新发病率为31-78％。因此，有利的是对NMIBC的改进治疗，以防止复发和进展成MIBC。
发明内容
在一个实施方案中，其提供治疗膀胱癌的方法。治疗膀胱癌的方法可包括:提供药物组合物，该组合物含有环吡酮或环吡酮胺或具有本申请提供的通式之一的结构的环吡酮-POM前药，或其衍生物或其立体异构体或其药学上可接受的盐；和将所述药物组合物给予患有膀胱癌的受试者。可给予有效量的环吡酮或环吡酮胺或环吡酮-POM前药。在一个方面，所述有效量足以抑制NOTCH信号传导途径、γ-分泌酶复合物和Notch下游靶标蛋白、细胞周期蛋白D1和c-Myc。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制TGFβ信号传导途径。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制STAT3信号传导途径。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制膀胱癌细胞的生长。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制DNA修复。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制核糖核苷酸还原酶。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制膀胱癌干细胞的生长。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制S-期膀胱癌细胞的生长。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制膀胱癌球状体形成。在一个方面中，所述治疗有效量足以抑制膀胱癌细胞增殖。
在一个实施方案中，其提供通过全身递送环吡酮治疗上泌尿道中的膀胱癌疾病的方法。所述方法可包括:提供药物组合物，该组合物含有环吡酮或环吡酮胺或具有本申请提供的通式之一的结构的环吡酮-POM前药，或其衍生物或其立体异构体或其药学上可接受的盐；和向患有上泌尿道中的膀胱癌疾病的受试者给予所述药物组合物。
附图说明
通过下面的描述和随附权利要求并结合附图，上述和下面的信息以及本申请的其他特征会变得更显而易见。理解的是，这些附图仅描绘了符合本申请的数个实施方案，并因此不应被理解是限制其范围，将通过使用附图描述本申请的其他特征和细节，其中:
图1图示说明了制备6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮的方法，其在本申请中被称作环吡酮(方案1)。
图2图示说明了制备二叔丁基(氯甲基)磷酸酯的方法(方案2)。
图3图示说明了制备6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮的前药的方法(方案3)。
图3A图示说明了被称作方案3A的子反应方法，该方案可为图3的方案3的子方法。
图3B所示质谱色谱显示了图3A的方案3A的反应产物。
图3C所示质谱色谱显示了存在((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基二氢磷酸酯的游离酸形式。
图3D显示了环吡酮-POM前药的二聚物型形式。
图3E显示了图3D的环吡酮-POM前药的二聚物型形式的质谱色谱。
图4图示说明了使((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基二氢磷酸酯成盐，得到((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐(方案4)；然而，合成可导致所述化合物的任何其他药学上可接受的盐。
图4A所示质谱色谱显示存在图4的((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐。
图5图示说明了制备二苄基(氯甲基)磷酸酯的方法(方案5)。
图6图示说明了制备二苄基(((6-环己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯的方法(方案6)。
图7图示说明了制备((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐的方法(方案7)。
图8图示说明了制备POM反应物二苄基(氯甲基)磷酸酯的方法(方案8)。
图9所包括的图显示环吡酮(CPX)在小的浓度范围内抑制NMIBC(T24)膀胱癌细胞增殖。
图10所包括的图像显示CPX抑制膀胱癌球状体形成。
图11所包括的图显示环吡酮(CPX)在较大浓度范围内抑制NMIBC(T24)和MIBC(253JBV)膀胱癌细胞增殖。
图12A显示向每时间点处理组的六只小鼠给予10mg/kg IV环吡酮胺(CPX-O),10mg/kg IV CPX-POM,30mg/kg PO CPX-O和30mg/kg PO CPX-POM后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布图。
图12B显示向每时间点每处理组的三只小鼠给予10mg/kg IV和50mg/kg IP CPX-POM后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布图。
图13A显示向每处理组的六只大鼠给予10mg/kg IV CPX-POM和CPX-O后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间半对数分布图。
图13B显示向每处理组的六只大鼠给予20mg/kg IV CPX-POM,30mg/kg SQ CPX-POM和30mg/kg CPX-O后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布图。
图14显示向四只雄性比格犬给予3mg/kg IV CPX-POM和CPX-O后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布图。
图15显示向四只雄性比格犬给予3mg/kg静脉内(IV)CPX-POM,9mg/kg皮下(SQ)CPX-POM和9mg/kg口服(PO)CPX-O后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布图。
图16包括的Western印迹显示来自CPX的T24膀胱癌细胞的凋亡。
图17包括的Western印迹显示来自CPX的T24膀胱癌细胞的凋亡。
图18包括的图显示相对于孵育时间，CPX自CPX-POM的形成。
图19包括的图像显示，与对照相比在CPX存在下T24细胞的细胞生长的差异。
图20包括的图像显示，与对照相比在CPX存在下253JBV细胞的细胞生长的差异。
图21包括的图显示在253JBV和T24细胞系中，CPX都抑制球状体形成。
图22包括的图像显示在T24膀胱癌细胞系中CPX诱导细胞死亡。
图23A-23C包括的图显示在T24膀胱癌细胞中，CPX抑制细胞内Notch,Wnt和Hedgehog信号传导途径。
图24包括的图和图像显示CPX在WT和NCID过表达的T24细胞中对细胞增殖的作用以及对Notch 1和Actin水平的作用。
图25A-25D包括的图显示CPX对膀胱癌细胞的作用。
图26A包括的图显示每种CPX-POM处理时膀胱的重量。
图26B包括的图显示每种CPX-POM给药处理时的肿瘤阶段。
图27A包括的图像显示CPX-POM抑制体内Notch1信号传导和γ-分泌酶复合物蛋白。
图27B包括的图像显示CPX-POM在BBN诱导的膀胱肿瘤模型中抑制Notch下游靶标蛋白,细胞周期蛋白D1和c-Myc。
图28显示CPX-POM在体外和体内抑制增殖细胞核抗原(PCNA)。
发明详述
在下面的详述中会提到附图，其构成本文的一部分。在所述附图中，相似的符号通常代表相似的组分，除非上下文另有说明。在发明详述、附图和权利要求中描述的示例性实施方案并不意在加以限制。可以使用其他实施方案，并且可以进行其他改变，这些都不背离本文所呈现的主题的主旨或范围。容易理解的是，可对本文中大体描述和在附图中说明的方面以多种不同的形态进行布置、取代、组合、分离和设计，这些全部是本文明确考虑的。
大体上，本发明涉及6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮(也被称作环吡酮)及其前药。本文所述的环吡酮和环吡酮前药可用在治疗膀胱癌中，其得到本文数据的支持。所述环吡酮前药可包括磷酰基氧基甲基(POM)部分，目的是通过提高的水溶解度和通过注射给予所述药物的能力而向目标作用位点递送活性部分环吡酮。本发明的所述环吡酮-POM前药也可包括环吡酮的衍生物，该衍生物包括所述POM前药部分，该衍生性前药在本文中通常被冠以术语环吡酮-POM或可被具体称作环吡酮-POM衍生物。本发明的环吡酮-POM前药可用传统的化学技术制备，例如本文中描述的那些技术。在膀胱癌治疗中，所述环吡酮可按环吡酮胺形式使用。
所述环吡酮-POM前药已被证明提高环吡酮的水性溶解度，从而使其有机会通过注射环吡酮-POM而向整个泌尿道选择性递送显著浓度的环吡酮。通过向整个泌尿道递送生物活性环吡酮，通过注射给予所述环吡酮-POM前药克服了经由膀胱滴注局部递送的局限，因为药物被递送至上泌尿道包括输尿管、收集系统和肾脏。因此，所述环吡酮-POM前药克服了环吡酮或其他形式的环吡酮例如环吡酮盐如环吡酮胺在配制和/或递送途径上的局限。现在，所述环吡酮-POM前药改进的溶解度可允许获得改进的药物组合物，该组合物通过注射给予有效量的环吡酮。所述药物组合物可被配制为适于可注射的给药途径，例如静脉内、皮下和肌内。
所述环吡酮-POM前药可经构造以使POM部分通过磷酸酶被断裂，目的是产生具有生物活性的原始母体药物环吡酮。环吡酮-POM向生物活性的环吡酮的代谢转化是迅速且完全的。因此，可将所述环吡酮-POM给予有生命的受试者，然后其在所述受试者的体内被酶性加工成生物活性的环吡酮。尽管所述受试者通常是人，但发现环吡酮-POM前药可适用于多种动物，例如哺乳动物、禽类、爬行动物等。
尽管环吡酮已常规被用作局部抗真菌剂，但用于本发明的环吡酮-POM前药的不同制剂可为其他疾病提供治疗有效量的环吡酮，所述其他疾病已被证明或被开发适于环吡酮治疗。因此，所述环吡酮-POM前药可被用在用于以下的疗法中:抑制、治疗和/或预防真菌；治疗、预防和/或控制癌症(例如，膀胱癌或其他癌症)；抑制、治疗和/或预防皮肤炎；抑制、治疗和/或预防浅表真菌病；抑制、治疗和/或预防炎症(例如，作为抗炎药或NSAID)；抑制、治疗和/或预防脚癣,股癣和体癣中的一种或多种,红色毛癣菌,须毛癣菌,絮状表皮癣菌，和犬小孢子菌,念珠菌病(moniliasis),白色念珠菌,花斑癣(糠疹)或糠秕马拉色菌，和用于抑制、治疗和/或预防病毒感染包括HIV。现在，发现环吡酮例如环吡酮胺或环吡酮前药可用在膀胱癌的治疗中。换言之，该药物可在没有前药部分的情况下使用或在具有前药部分的情况下以前药形式使用。环吡酮的这种用法可如本申请所述加以给药。而且，所述环吡酮可包括在局部递送系统中以经由膀胱滴注直接递送至膀胱癌。还发现，CPX选择性消除由HIV-1引起的病毒感染，所述CPX可按环吡酮、环吡酮-POM前药或环吡酮胺形式递送。
所述环吡酮-POM前药提高所述前药的溶解度，从而实现全身和泌尿道向环吡酮的暴露增加。换言之，整个受试者以及受试者的各细胞内可获得更多的环吡酮。可获得的环吡酮的量增加提高了生物活性和治疗潜能，以及提高了调节细胞进程的能力。因此，所述环吡酮-POM前药可被用于破坏细胞中的DNA修复,细胞分裂或核内转运。此外，环吡酮-POM可被用于抑制Notch信号传导，从而影响干细胞特性(stemness)并促进膀胱癌的侵入和转移。所述细胞可为体内、离体或体外。因此，所述环吡酮-POM可被用于抗宽谱癌系，采用的方式是在细胞中破坏DNA修复,细胞分裂或核内转运、抑制Notch信号传导和抑制本申请所述的任何其他生物途径。
尽管已描述了环吡酮的前药，但所述前药已被限于与可用羟基和/或氨基形成的常规酯，例如通过在碱存在下酰化经活化的酸。所描述的酯可包括具有以下酯的前药：苯基酯、脂肪族(C8-C24)酯,酰基氧基甲基酯、氨基甲酸酯和氨基酸酯(参见，WO 2010/048712，将其全文并入本申请作为参考)。
此外，针对化合物(包括含仲胺和叔胺的药物)，已生产具有增加的溶解度的前药。所述前药的实例包括N-磷酰基氧基甲基(POM)前药，其中所述POM部分的甲基基团连接至仲胺或叔胺(参见美国专利5,985,856，将其全文并入本申请作为参考)。
现在已发现，其他化学技术可将POM前药实体连接至环吡酮，目的是获得本发明的环吡酮-POM前药。化学合成方案可如下所示通过环吡酮的羟基而不是仲胺或叔胺共轭连接。尽管环吡酮确实包括环氮，但已经发现，由于与氮连接的羟基或氧对于环吡酮的生物活性可能是重要的，因此这样的氮不适合与POM相连。因此，本发明提供的化学技术将POM部分与连接于环吡酮的环氮的羟基基团结合。
在一个实施方案中，本发明包括环吡酮的前药或其衍生物。所述前药可包括式1的结构或其衍生物或其立体异构体以及其药学上可接受的盐。
在该式中，R1-R14各自独立地可包括氢,卤素,羟基,烷氧基,直链脂肪族基团,支链脂肪族基团,环状脂肪族基团,取代的脂肪族基团,未取代的脂肪族基团,饱和的脂肪族基团,不饱和的脂肪族基团,芳族基团,多芳族基团,取代的芳族基团,杂芳族基团、胺、伯胺,仲胺,叔胺,脂肪族胺,羰基,羧基,酰胺,酯,氨基酸,肽,多肽,它们的衍生物,取代的或未取代的或它们的组合以及其他公知的化学取代基。R13和/或R14可为阳离子例如钠离子，从而所述化合物形成盐。而且，R13和/或R14独立地可包括阳离子以与所述前药或以下中的一个或多个形成盐：氢,卤素,羟基,烷氧基,直链脂肪族基团,支链脂肪族基团,环状脂肪族基团,取代的脂肪族基团,未取代的脂肪族基团,饱和的脂肪族基团,不饱和的脂肪族基团,芳族基团,多芳族基团,取代的芳族基团,杂芳族基团、胺、伯胺,仲胺,叔胺,脂肪族胺,羰基,羧基,酰胺,酯,氨基酸,肽,多肽或它们的组合。甲基连接基可被扩展为较大的脂肪族基团，该基团视需要为取代的或未取代的，从而n可为约0-20，更优选1-10和最优选1-4。所述连接基也可具有一个或两个氧原子，从而m可为0、1或2。对于本申请所示的所有通式，n可为1-4和m为1，或n和m都可为1。
在一个实施方案中，R13和/或R14可独立地为多种阳离子中的任一个。在一个实例中，R13和/或R14可独立地包括带有正电荷+1的离子。R13和/或R14可为碱金属。而且，R13和/或R14可独立地为1个离子的基团例如钠离子。因此，氧和R13和/或R14之间的键可为共价的或离子的。
在一个实施方案中，R13和/或R14可独立地为保护基。保护基的实例可包括叔丁基和苄基；然而，可使用其他基于有机物的保护基。这些保护基可留在所述前药上用于给药，或可在给药前除去。
在一个实施方案中，R1为短的脂肪族基团，例如甲基或其他烷基。
在一个实施方案中，R2-R12全部为氢。
在一个实施方案中，R13和/或R14各自独立地为氢。
在一个实施方案中，R13和/或R14各自独立地为苄基或叔丁基。
在一个实施方案中，R13或R14包括环吡酮-POM，并且另一个为氢，其显示在下面的式10中。
在一个实施方案中，本发明包括具有式2结构的化合物或其衍生物或其立体异构体。n,m,R1和R13和/或R14可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式3结构或其衍生物或其立体异构体。n,m,R1和R13和/或R14可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式4结构或其衍生物或其立体异构体。n和m可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式5结构或其衍生物或其立体异构体。n和m可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式6结构或其衍生物或其立体异构体。n和m可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式7结构或其衍生物或其立体异构体。N和m可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式8结构或其衍生物或其立体异构体。n和m可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式9结构或其衍生物或其立体异构体。n和m可与上面就式1所述的相同。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式10结构或其衍生物或其立体异构体。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式11的结构或其衍生物或其立体异构体。其中，所述化合物具有两个带负电荷的氧原子，其可与阳离子离子缔合，从而形成盐，例如任意药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式12的结构或其衍生物或其立体异构体。其中，所述化合物具有两个带与阳离子缔合的氧原子，从而形成盐，例如任意药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述化合物可包括式13的结构或其衍生物或其立体异构体。其中所述化合物具有两个可失去氢然后变成与阳离子缔合的氧原子，从而形成盐，例如任意药学上可接受的盐。
如果可能的话，任何化合物都可以作为药学上可接受的盐制备。可以使用任何常见的药学上可接受的盐离子。这种盐的实例可包括碱金属和碱土金属盐，例如锂，钠，钾，镁，钙，锶及它们的水合物；更优选钠，镁，钙及它们的水合物；并且更优选的是镁、钙及它们的水合物。所述盐还可以包括各种有机酸的相应盐，例如甲酸，乙酸，丙酸，三氟乙酸，酒石酸，苹果酸，马来酸，富马酸，琥珀酸，草酸等，以及各种无机酸的盐，例如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸等。任意其他盐也为合适的。
此外，本文所述并由化学式表示的任何化合物可以具有任何R基团(R1-R14)，其独立地选自取代基，该取代基选自：氢,C1-C24烷基,C2-C24烯基,C2-C24炔基,C5-C20芳基,C6-C24烷芳基,C6-C24芳烷基,卤素,羟基,巯基,C1-C24烷氧基,C2-C24烯基氧基,C2-C24炔基氧基,C5-C20芳基氧基,酰基(包括C2-C24烷基羰基(—CO-烷基)和C6-C20芳基羰基(—CO-芳基)),酰基氧基(—O-酰基),C2-C24烷氧基羰基(—(CO)—O-烷基),C6-C20芳基氧基羰基(—(CO)—O-芳基),卤羰基(—CO)—X，其中X为卤素),C2-C24烷基碳酸酯基(—O—(CO)—O-烷基),C6-C20芳基碳酸酯基(—O—(CO)—O-芳基),羧基(—COOH),羧酸根(—COO-),氨基甲酰基(—(CO)—NH2),单-(C1-C24烷基)-取代的氨基甲酰基(—(CO)—NH(C1-C24烷基)),二-(C1-C24烷基)-取代的氨基甲酰基(—(CO)—N(C1-C24烷基)2),单-取代的芳基氨基甲酰基(—(CO)—NH-芳基),硫代氨基甲酰基(—(CS)—NH2),脲基(—NH—(CO)—NH2),氰基(—C≡N),异氰基(—N+≡C-),氰氧基(—O—C≡N),异氰酸基(—O—N+≡C-),异硫氰酸基(—S—C≡N),叠氮基(—N＝N+＝N-),甲酰基(—(CO)—H),硫代甲酰基(—(CS)—H),氨基(—NH2),单-和二-(C1-C24烷基)-取代的氨基,单-和二-(C5-C20芳基)-取代的氨基,C2-C24烷基酰胺基(—NH—(CO)-烷基),C6-C20芳基酰胺基(—NH—(CO)-芳基),亚氨基(—CR＝NH，其中R为氢,C1-C24烷基,C5-C20芳基,C6-C24烷芳基,C6-C24芳烷基,等等),烷基亚氨基(—CR＝N(烷基)，其中R＝氢,烷基,芳基,烷芳基,芳烷基,等等),芳基亚氨基(—CR＝N(芳基)，其中R＝氢,烷基,芳基,烷芳基,等等),硝基(—NO2),亚硝基(—NO),磺基(—SO2—OH),硫羰酸根(sulfonato)(—S2—O-),C1-C24烷基硫基(—S-烷基；也称作“烷基硫基”),芳基硫基(—S-芳基；也称作“芳基硫基”),C1-C24烷基亚磺酰基(—(SO)-烷基),C5-C20芳基亚磺酰基(—(SO)-芳基),C1-C24烷基磺酰基(—SO2-烷基),C5-C20芳基磺酰基(—SO2-芳基),磷酸基(—P(O)(OH)2),磷酸根(—P(O)(O-)2),次磷酸根(-P(O)(O-)),磷酰基(—PO2),膦基(—PH2),它们的衍生物，和它们的组合。
药物组合物
在一个实施方案中，所述环吡酮-POM前药可包括在药物组合物中。所述药物组合物可被配制成适合于可注射的给药途径，例如静脉内,皮下和肌内。可以给药到肾脏中，或给药到膀胱中，或给药到尿道中，或给药到通往它们的任何血管的上游。
在一个实施方案中，所述环吡酮或环吡酮胺可包括在药物组合物中。所述药物组合物可被配制成适合于可注射的给药途径，例如静脉内,皮下和肌内。在一个实例中，环吡酮或环吡酮胺或CPX-POM可包括在局部递送系统中，例如可以作为储库被施用于膀胱癌或与其相邻位置的聚合物载体。所述聚合物载体可以是可以被递送到局部位点的纳米颗粒，微粒，水凝胶或其它物质，并允许环吡酮或环吡酮胺或CPX-POM通过膀胱滴注局部递送至膀胱癌细胞。递送系统可以是可生物降解的递送系统，或允许试剂从其中扩散。
在一个实施方案中，药物组合物可包括本文所述的环吡酮-POM前药。例如，所述药物组合物可以包括药学上可接受的载体。由于环吡酮-POM前药现在是高度水可溶的，因此药学上可接受的载体可以包括水。然而，为了给予所述环吡酮-POM前药，载体可以是充足的，以使其达到被给药的受试者例如人或其细胞的水环境。
在一个实施方案中，所述药物组合物可包括环吡酮或环吡酮胺或环吡酮-POM前药，其存在量大于约0.77％，更优选大于约1％；或最优选大于约2％。
在一个实施方案中，所述药物组合物可包括水作为载体。
在一个实施方案中，环吡酮或其乙醇胺(olamine)或环吡酮-POM前药可以根据已知的递送环吡酮或其乙醇胺的方式来递送。然而，局部直接给药到膀胱癌细胞的可为有利的。此外，可注射的给药途径，例如静脉内，皮下和肌内可为合适的。
本文所述的组合物可以通过已知的用于制备可被给予至受试者的药学上可接受的组合物的方法来制备，从而使有效量的活性物质与药学上可接受的媒介物组合在混合物中。合适的媒介物描述在例如Remington'sPharmaceutical Sciences中。在此基础上，所述组合物包括但不限于与一种或多种药学上可接受的媒介物或稀释剂缔合的物质的溶液，并且包含在具有合适pH的缓冲溶液中，与生理溶液等渗。
在一个实施方案中，环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药的有效量在约0.01至约200mg/kg受试者体重的范围内。在一个方面中，环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药的有效量在约0.5至约50mg/kg体重的范围内。环吡酮，环吡酮胺或环吡酮-POM前药可被制成含有约1mg至约1000mg环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药的可注射剂型。在一个方面中，所述组合物可包括约1mg至约200mg环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药/kg受试者体重，并且可被配制成液体剂型或可注射剂型。然而，可使用其他量。例如，药物可以在宽剂量范围内施用，例如0.5mg/m2至300mg/m2,1mg/m2至200mg/m2,5mg/m2至150mg/m2,10mg/m2至75mg/m2，或任何合适的量。
在一个实施方案中，本发明可包括被构造用于治疗白血病性障碍的药物组合物。所述组合物可包括有效量的环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药，其可通过口服、局部给药，或通过静脉内,皮下或肌内注射给药。
药物组合物包括但不限于冻干粉末或水性或非水性无菌可注射溶液或悬浮液，其可以进一步含有使组合物与预期接受者的组织或血液基本相容的抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质。可存在于所述组合物中的其它组分包括例如水，表面活性剂(例如，)，醇，多元醇，甘油和植物油。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末，颗粒剂，片剂或浓缩溶液或悬浮液制备。所述组合物可以以例如但不限于冻干粉末形式供应，其在给予患者之前用无菌水或盐水重构。
合适的药学上可接受的载体包括基本上化学惰性和无毒的组合物，其不干扰所述药物组合物的生物活性的有效性。合适的药物载体的实例包括但不限于水，盐溶液，甘油溶液，乙醇，N-(1(2,3-二油酰基氧基)丙基)N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和脂质体。所述组合物应该含有治疗有效量的化合物以及合适量的载体，以提供用于直接给予患者的形式。
本申请描述的所述环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药组合物可例如通过胃肠外，静脉内，皮下，肌内，颅内，眶内，眼内，心室内，囊内，脊柱内，脑池内，腹膜内，鼻内，气雾剂，透皮或口服来给予。常用载体或赋形剂可用于制备被设计用于所述给药途径的药物组合物。
另一方面提供了一种商业包装，其包含本文所述的组合物，以及与该组合物相关的用其治疗环吡酮有效的病症(例如本文所述的那些)的说明书。例如，所述包装可包括合适的量，该量用于在需要这种治疗的受试者中治疗白血病性障碍例如急性髓细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病。在另一个实施方案中,所述商业包装可以包括用于治疗慢性骨髓性白血病，淋巴瘤或多发性骨髓瘤的给药说明书和/或治疗方案。另一个实施方案提供包含本文所述的组合物的商业包装，以及与该组合物相关的用其诱导细胞死亡和/或抑制白血病性障碍细胞例如白血病细胞中的存活活性或水平的说明书。这也适用于用环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药治疗膀胱癌。
在一个实施方案中，所述组合物没有乙醇胺。事实上，所述前药可不含乙醇胺。因此，所述组合物可没有环吡酮胺或其衍生物。在一个实施方案中所述组合物可没有缺少前药部分的环吡酮。
在一个实施方案中，所述环吡酮,环吡酮胺或环吡酮-POM前药可以治疗有效量存在，用作疗法。例如，所述治疗有效量对于以下的一个或多个方面是足够的:用在治疗真菌中；用在治疗癌症中(膀胱癌或其他癌症)；用在治疗皮肤炎中；用于在细胞中破坏DNA修复,细胞分裂或核内转运；用在浅表真菌病的治疗中；用作抗炎药；用在治疗脚癣,股癣和体癣,红色毛癣菌,须毛癣菌,絮状表皮癣菌和犬小孢子菌,念珠菌病(moniliasis),白色念珠菌,花斑癣(糠疹)或糠秕马拉色菌的一种或多种中；用在治疗急性髓细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病；慢性髓细胞性白血病,淋巴瘤或多发性骨髓瘤或其他疾病中；和用于抑制、治疗和/或预防病毒感染包括HIV。而且，所述治疗可被用于治疗任意合适的癌症例如膀胱癌。
合成
通常，获得环吡酮，然后通过本文所述的反应方案反应，以产生环吡酮-POM前药。同样，可以按照本文所述的合成方案获得环吡酮衍生物并进行反应，其中环吡酮衍生物反应物将得到相应的环吡酮-POM衍生物前药。在一些情况下，环吡酮或其衍生物可以以盐如乙醇胺盐的形式获得。因此，反应方案可以包括在与POM前药部分结合之前将所述环吡酮脱盐。
在图和下面相关的就化学反应和相应反应物的描述中，缩写用于描述化学物质，其缩写定义如下:EDAC为N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐；DIAD为偶氮二羧酸二异丙酯；BBDI为1-叔丁氧基-2-叔丁氧基羰基-1,2-二氢异喹啉；DICD为碳二亚胺二异丙酯；和DBP为二苄基磷酸酯。
在一个实施方案中，本发明提供制备6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮的方法，该方法可包括如图1中所示的反应方案1。方案1的反应从环吡酮的乙醇胺盐制备环吡酮。简言之，可将环吡酮胺(5g,18.6mmol)溶解在2N HCl中，用EtOAc萃取，并用己烷沉淀以得到环吡酮(约84％的收率)。
在一个实施方案中，本发明提供制备反应物的方法，该反应物用在制备6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮的前药中，该方法可包括如图2中所示的反应方案2。所述反应方案2提供反应物，该反应物用于制备POM前药部分(为二叔丁基(氯甲基)磷酸酯)的反应物。简言之，将磷酸二叔丁酯钾(5g,20mmol)溶解在最少量的冷水中，滴加6N HCl以形成沉淀物，然后将该沉淀物用冷水洗涤，然后过滤并真空干燥以形成磷酸二叔丁酯。然后将所述磷酸二叔丁酯(4g,19mmol)溶解在约100mL丙酮中，滴加四甲基氢氧化铵直到达到约pH 7,然后除去溶剂并真空干燥得到磷酸二叔丁酯四甲基铵。然后使磷酸二叔丁酯四甲基铵(5.11g,18mmol)与碘氯甲烷(CH2ClI)(25g,142mmol,7.88当量)在约150ML DME中反应并回流约2小时，然后过滤以除去沉淀物，除去溶剂，然后溶解在EA/H中，接着通过硅胶垫过滤，除去溶剂并干燥产物得到二叔丁基(氯甲基)磷酸酯。所展示的TLC确认了产物。
在一个实施方案中，本发明提供制备6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮的前药(即，((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐)的方法，所述方法可包括如图3中所示的反应方案3。反应方案3使环吡酮与二叔丁基(氯甲基)磷酸酯反应形成包括二钠盐的环吡酮-POM。简言之，将环吡酮(0.257g,1.25mmol)和二叔丁基(氯甲基)磷酸酯(0.450g,1.74mmol)溶解在5mL中并在0℃与60％ NaH(0.62g,154.mmol)反应30分钟，然后在室温反应2小时，之后用水淬灭，然后除去溶剂并通过分离柱(EA/H(1:1))加工，得到二叔丁基(((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯，其通过TLC得到证实。然后将二叔丁基(((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯溶解在10mL THF/CH2Cl2(3:1)中。在室温孵育2小时，然后除去溶剂并通过RPHPLC纯化，接着加入等摩尔的Na2CO3于水/CAN中并冻干，得到((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基二氢磷酸酯(14mg,0.044mmol)和((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐(15.89mg)，其在本申请中被称作初级环吡酮-POM前药。
图3A显示被称作方案3A的子反应方法，其为方案3的子方法。方案3A显示将二叔丁基(((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯转化为叔丁基(((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)氢磷酸酯，其再转化为((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基二氢磷酸酯。图3B显示的质谱色谱表明存在这些化学实体。
环吡酮-POM前药的游离酸形式(即，((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基二氢磷酸酯)也通过RPHPLC纯化，如图3C中所示。经纯化的产物经证明具有如图3C中所示的质谱色谱。
另外，生成了环吡酮-POM前药的另一种二聚物型形式，如图3D中所示，其被称为环吡酮-POM二聚物前药。所述环吡酮-POM二聚物前药得到质谱色谱的证实，如图3E中所示。
图4说明的方案4为用钠离子使((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基二氢磷酸酯成盐的方法，从而得到((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐,这得到质谱色谱的证实，如图4A中所示。
在一个实施方案中，本发明可包括制备POM反应物二苄基(氯甲基)磷酸酯的方法，其如图5的反应方案5中所示。简言之，在约25mL甲苯中使CH2ClI(5mL；68.6mmol)与磷酸二苄基酯银(2g,52mmol)反应并回流约1小时，然后除去溶剂并通过分离柱(1/1EA/H)加工，从而产生二苄基(氯甲基)磷酸酯，其经由TLC得到证实。
在一个实施方案中，本发明提供制备前药二苄基(((6-环己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯的方法，其如图6的方案6所示。简言之，将环吡酮(0.431g,2.08mmol)与二苄基(氯甲基)磷酸酯(0.920g,2.81mmol)和60％ NaH(0.096g,2.38mmol)一起溶解在10mL DMF中，在0℃孵育30分钟，然后在室温孵育1小时，接着用水淬灭。然后除去溶剂并通过分离柱(EA/H 1:1)加工，从而得到二苄基(((6-环己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯，其经由所示的TLC得到证实。
在一个实施方案中，将二苄基(((6-环己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯转化成((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐，如图7中的方案7所示。简言之，在100mg Pd/C存在下，将二苄基(((6-环己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯溶解在25mL THF中，在氢气(H2)在室温保持3小时，然后除去溶剂并将产物溶解在ACN中。然后加入Na2CO3于水中并冻干。产物经确定为少量的((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基二氢磷酸酯(约0.273g,0.86mmol)，并且主要产物为((6-环己基-4-甲基吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基磷酸酯二钠盐(0.310g)，其经由所示的TLC得到证实。
在一个实施方案中，另一种制备POM反应物二苄基(氯甲基)磷酸酯的方法如图8的反应方案8中所示。简言之，在0℃至室温，将二苄基磷酸酯(10.6g；38.08mmol)和氯甲基氯磺酸酯(7.52g,456.6mmol/120mL CH2Cl2)与NaHCO3(12.80g,152.32mmol)和n-Bu4NHSO4(12.94g,38.08mmol)溶解在320mL水和200mL CH2Cl2中过夜，然后通过分离柱(1/2EA/H,EA)加工。该反应得到约48％的二苄基(氯甲基)磷酸酯(6g),其经由所示的TLC得到证实。
在一个实施方案中，本发明提供另一种制备前药二苄基(((6-环己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯的方法，其如图6的方案6所示。简言之，将环吡酮(1g,4.82mmol)与二苄基(氯甲基)磷酸酯(2g,6.12mmol)以及60％ NaH(0.375g)溶解在20mL DMF中，在0℃孵育30分钟，然后用水淬灭。接着除去溶剂，并将产物溶解在EtOAc中，用水洗涤，除去溶剂并通过分离柱(EA/H 1:2)和RPHPLC加工。从而得到67％二苄基(((6-环己基-4-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)氧基)甲基)磷酸酯(1.616g)。
实施方案
图和表中的数据表明本文所述的环吡酮-POM前药对于向受试者给药而言是一种改进。据发现，与向小鼠、大鼠和狗IV给予环吡酮胺相比，当以前药形式IV给予时，环吡酮容易生物利用，因此环吡酮-POM是化学制剂方面的改进。然而，口服给予小鼠后，生物利用度低，给予乙醇胺盐后为21％，口服给予环吡酮-POM前药后为12％。因此，当以前药形式IV给予时，环吡酮容易生物利用。由于IV、口服、皮下和腹膜内给药后不能检测到血浆和尿液中的前药，因此看上去当前药到达全身循环时，其被迅速而完全代谢为环吡酮。因此，从物理化学性质的观点来看，环吡酮-POM前药具有优于环吡酮胺的优点，并且可以配制成合适的可注射产品。根据所述数据，有理由相信环吡酮-POM前药被快速转化为环吡酮。
现已发现本发明的化合物可用于治疗膀胱癌。膀胱癌可以包括NMIBC(非肌层浸润性膀胱癌)和MIBC(肌层浸润性膀胱癌)，以及其他膀胱癌。参见图9-28。所述化合物(式10)已被证明具有抗膀胱癌活性。通过全身注射给予前药(例如，静脉内，肌内，皮下等)导致有活性的临床相关浓度(例如显著浓度)的活性剂环吡酮被选择性递送至整个泌尿道。这可治疗非肌层浸润性或浅表性膀胱癌。
所述前药转化为有效抑制膀胱癌中的干细胞的活性环吡酮化合物，并且具体靶向Notch-1信号传导途径。已经证明，在化合物存在下，信号传导被显著抑制，化合物通过这种机制影响膀胱癌。对于抑制其中Notch信号传导活跃的膀胱癌和其他癌症(例如结肠癌，骨肉瘤)的化合物而言，抑制Notch是重要活性。
NMIBC由泌尿道的外衬层(尿路上皮)(例如，与接触尿液的层相对的层)的癌症开始出现，外衬层的癌细胞开始向内侵入膀胱的肌肉中，随后癌症遍布全身。然而，环吡酮的活性和以前药形式递送允许药物抑制与这种特定癌症的侵袭性相关的途径。
在一个实施方案中，可以给予所述前药以提供环吡酮的抗癌活性，从而治疗白血病，淋巴瘤，结肠直肠癌，肝癌，横纹肌肉瘤和乳腺癌细胞系，以及其他癌症，例如但不限于胰腺癌，肾细胞癌，血液恶性肿瘤，子宫颈癌，骨髓瘤和其他可能的癌症。
基于环吡酮的活性的环吡酮-POM前药也可用于诱导自噬，抑制mTOR，下调细胞周期蛋白A，B1，D1和E以及CDK2和CDK4和其他活性。
使用所述前药治疗膀胱癌的方法可以包括全身给予环吡酮-POM前药(例如，前药)用于治疗膀胱癌，其提供如本文所述的令人惊奇和意料不到的结果。
已经发现，环吡酮-POM前药的全身给药导致向整个泌尿道选择性递送临床显著浓度的活性抗癌剂环吡酮(游离酸)。
目前对非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC,之前称作浅表性膀胱癌)的治疗是经由膀胱滴注。目前没有任何由膀胱滴注以外的任何途径给药的治疗NMIBC的药物疗法。膀胱滴注抗癌剂只能使膀胱癌暴露于抗癌剂的时间为患者能够将液体保留在其膀胱中的时间(例如，两小时)。其次，膀胱滴注不能将药物输送到解剖学上位于膀胱上方的整个泌尿道，即输尿管，收集系统和肾脏。高达10％的NMIBC患者患有上泌尿道疾病。相反，本发明包括向整个泌尿道提供活性药物的全身递送(例如，注射)。然而，治疗剂也可以通过膀胱滴注递送。
膀胱癌表现为两种疾病，NMIBC和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。新诊断的膀胱癌患者中有大约四分之三表现为NMIBC。当NMIBC入侵膀胱肌肉中时，其成为MIBC。MIBC经常转移，需要全身给药的化疗药物。现在已经令人惊讶且意料不到地证明，环吡酮在NMIBC和MIBC膀胱癌中具有抗癌活性，并且环吡酮-POM前药的全身递送向这些膀胱癌细胞提供环吡酮。在良好表征的NMIBC和MIBC细胞系中，来自环吡酮-POM前药递送的环吡酮抑制细胞增殖，集落形成和球状体形成。虽然环吡酮的杀真菌活性是通过其螯合铁的能力介导的，并且中断铁依赖性细胞内过程，但环吡酮的体外抗癌活性独立于市售的铁螯合剂。首次证实，环吡酮抑制Notch-1信号传导途径，这是最近被认为在侵袭性膀胱癌中过度表达的途径，也是在多种癌症的癌干细胞中过表达的途径。因此，环吡酮-POM前药可用于治疗所有形式的膀胱癌，以及用在其中Notch信号传导途径活跃的许多不同癌症的癌干细胞中。
环吡酮-POM前药选择性地向整个泌尿道递送临床显著浓度的环吡酮
我们对小鼠，大鼠和狗进行了一系列药代动力学研究，证明了以下几点。环吡酮-POM前药在全身给予后，从血浆迅速且完全消失。全身给予环吡酮-POM前药后的环吡酮的生物利用度优异，在小鼠，大鼠和狗中的范围为77-137％。在全身给药环吡酮-POM前药后，通过环吡酮和环吡酮的葡糖苷酸代谢物(CPX-G)的肾清除将该剂量从体内消除。药物消除与就环吡酮胺(CPX-O)所报道的一致。当环吡酮-POM前药的剂量远远低于最大耐受剂量时，观察到的环吡酮的尿浓度超过在NMIBC和MIBC细胞系中测定的体外IC50值。
在小鼠、大鼠和狗中进行药代动力学研究，证明环吡酮-POM前药迅速且完全代谢形成环吡酮。环吡酮-POM前药的快速代谢在体内发生，形成环吡酮。在小鼠，大鼠和狗中IV给药后未在血浆或尿液中检测到环吡酮-POM前药。在小鼠，大鼠和狗中，紧跟IV静脉推注给予后(5分钟内)，血浆环吡酮浓度最大，此后下降。众所周知，POM部分被在血液中循环的磷酸酶代谢。环吡酮-POM前药的完全代谢形成环吡酮。在向小鼠给予IV环吡酮-POM前药后，与IV推注给予环吡酮胺相比，环吡酮是完全生物可利用的。
环吡酮-POM前药在小鼠中的药代动力学
研究208-02.在小鼠中口服和静脉内给予环吡酮-POM前药后环吡酮的生物利用度。在小鼠中在给予环吡酮-POM前药和环吡酮胺后确定环吡酮-POM前药的药代动力学原理论证，其中向每处理组的每治疗时间点的六只小鼠分别口服和静脉内给予30mg/kg和10mg/kg的剂量。本研究的目的是表征CPX-POM代谢的速度和程度，并评估口服环吡酮-POM前药的可行性，以支持未来的癌症原理论证研究。
口服和静脉注射环吡酮-POM前药后，血浆中未检测到所述前药。此外，与IV给予环吡酮胺相比，IV给予环吡酮-POM前药后的环吡酮的AUC为137％，这证明所述前药不仅快速而且完全的代谢成环吡酮(推测是通过血浆磷酸酶)。给予环吡酮胺(21％)和环吡酮-POM前药(12％)后的环吡酮的口服生物利用度低，表明与该给药途径相关的显著的首过效应。
图12A显示给予10mg/kg IV环吡酮胺(CPX-O),10mg/kg IV环吡酮-POM前药(CPX-POM),30mg/kg PO CPX-O和30mg/kg PO CPX-POM后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布。表1A总结了所得的药代动力学数据。
表1A.单剂量IV和口服CPX-O和CPX-POM后，雄性C57/B16小鼠中的血浆CPX药代动力学参数
处理 CPX-O IV CPX-POM IV CPX-O口服 CPX-POM口服
平均体重(kg) 0.020 0.020 0.020 0.020
CPX剂量(mg/kg)b 10 10 30 30
C0(ng/mL) 11338
Cmax(ng/mL) 8005 548 520
Tmax(hr) 0.083 0.25 0.25
Kel(hr-1) 1.136 1.890 0.549 0.496
T1/2(hr) 0.610 0.367 1.26 1.40
AUC0∫n(ng*hr/mL) 1533 2183 821 476
AUC0∫∞(ng*hr/mL) 1544 2213 957 575
AUMC0∫n(ng*hr2/mL) 358
AUMC0∫∞(ng*hr2/mL) 401
MRT(hr) 0.259
Cl(mL/hr/kg) 6475
Vdz(mL/kg) 5700
Vss(mL/kg) 1680
F(％)d 137 20.6 12.4
a N＝每次处理每个时间点6只小鼠
b所给予的环吡酮游离酸的剂量,将CPX-O配制在25mM磷酸盐缓冲液pH7(含有50mM)中，强度为2.0mg/mL CPX；将CPX-POM二钠盐配制在25mM磷酸盐缓冲液pH7中,强度为2.69mg/mL
c C0对应于从非参数药代动力学数据分析得出的IV推注给药后的y截距值
d使用CPX-O IV作为参照处理确定的绝对生物利用度
研究11177.在小鼠中IP给予后环吡酮-POM前药的绝对生物利用度。
在小鼠中,在10mg/kg IV和50mg/kg IP给予环吡酮-POM前药(CPX-POM)后，表征环吡酮(CPX)的血浆和尿液药代动力学。本研究的目的是表征环吡酮-POM前药在IP给予后的绝对生物利用度，以支持在膀胱癌验证模型中进行的临床前原理论证研究中的IP给药。此外，我们将CPX和环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)的尿排泄进行表征以描述IP给予CPX-POM后泌尿道向CPX的暴露。将两个处理组每组30C57BL/6小鼠用CPX-POM处理。给药后6个小时之前和之后，在每个选定的血浆采集时间点处死3只动物。通过心脏穿刺收集血液(血浆)进行生物分析。在每个时间点将血浆汇集。另外，向两组六只小鼠分别给予10mg/kg IV和50mg/kgIPCPX-POM以表征尿液药代动力学。将小鼠置于代谢笼中，并在给药后24小时收集尿液(0-8小时和8-24小时尿液收集间隔)。与血浆一样，从六只动物收集的尿样被汇集用于生物分析。
所述10mg/kg IV和50mg/kg IP单剂量CPX-POM是良好耐受的。IP CPX-POM的绝对生物利用度为65％。与之前的药代动力学原理论证研究一致，在任一种处理后，CPX-POM在25ng/mL的BQL时在血浆中是检测不到的。如图12B中所示，在IV和IP给予CPX-POM后实现了CPX的广泛全身暴露。在IV推注给予10mg/kg的CPX-POM后，观察到血浆CPX峰浓度值8,098ng/mL(39μM)，超出体外IC50值数倍。在IP给予50mg/kg CPX-POM后，在给药后的0.25小时观察到4,127ng/mL(10.0μM)的Cmax值。鉴于在非肌层浸润性膀胱癌细胞系和肌层浸润性膀胱癌细胞系中体外IC50值为2μM(414ng/mL)，因此50mg/kg IP CPX-POM实现的CPX Cmax值是IC50的五倍。
所得的血浆药代动力学数据总结在表2A中。与以前的研究208-02一致，IP给药后CPX的表观消除速度迅速，平均血浆终末半衰期小于1小时(0.88小时)。本研究中IV给予CPX-POM后CPX的全身清除率在小鼠中为7,605mL/hr/kg。IV给予CPX-POM后CPX的分布体积在小鼠中为中度的，为约9.0L/kg，同样大于先前的小鼠研究。图12B显示了在向每个治疗组的每个时间点的三只小鼠给予10mg/kg IV和50mg/kg IP CPX-POM后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布。
表2A.单次IV和IP剂量的CPX-POM后C57/B16小鼠的血浆CPX药代动力学参数
a N＝每次治疗的每个时间点3只小鼠
b所给予的环吡酮游离酸剂量,将CPX-POM二钠盐配制在25mM磷酸盐缓冲液pH7中，强度为2.69mg/mL
c C0对应于从非参数药代动力学数据分析得出的IV推注给药后的y截距值
在10mg/kg IV和50mg/kg IP CPX-POM后，在小鼠中获得的尿CPX药代动力学参数总结在下表3A中。在单次IV和IP剂量的CPX-POM后，少于1％的剂量被作为CPX排泄。然而，尿CPX浓度超过体外IC50值(2μM)数倍。与IV给药途径相反，IP给予后，在给药后整个24小时内观察到显著的CPX尿浓度。CPX-POM剂量的23％至26％作为环吡酮的无活性葡萄糖醛酸苷代谢物被排泄。
表3A.单剂量IV和IP CPX-POM后，雄性C57/B16小鼠中的CPXc和CPX-Gc的药代动力学参数
a N＝每次处理6只小鼠
b所给予的环吡酮游离酸剂量，CPX-POM二钠可注射制剂，含有5mg/mL CPX的于具有50mM的25mM磷酸酯pH7中
c环吡酮(CPX)；环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)
研究11206.在小鼠中单次和重复IP给药后环吡酮-POM前药的尿液药代动力学
在小鼠中，在向三个独立组每组6只小鼠以单次(1天)和重复(10天)(每天一次连续10天)剂量给予50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg环吡酮-POM前药(CPX-POM)后表征尿环吡酮(CPX)的药代动力学，总结在下表3B中。进行本研究以支持在膀胱癌验证模型中进行的体内临床前原理论证研究，其通过证明在按照一定范围每天一次IP剂量给予CPX-POM前药后，环吡酮在尿液中的暴露。在单次和重复剂量的IP给予50mg/kg,100mg/kg和200mg/kg CPX-POM后，小于1％的剂量被作为CPV经24小时排泄。尽管作为环吡酮的剂量回收百分比低，但是，在整个剂量范围内，尿CPX浓度超过体外IC50值(2μM)数倍。在本研究中收集的任何尿样中未检测到CPX-POM，表明前药完全代谢。在整个剂量范围内，所给予的剂量的很大一部分被作为无活性环吡酮葡糖苷酸代谢产物消除了。根据这些数据，选择100mg/kg和200mg/kg环吡酮-POM前药的亚慢性IP剂量方案，用于随后在膀胱癌验证模型中进行原理论证研究。
表3B.在单次和每日一次重复IP剂量的CPX-POM后，雄性C57/B16小鼠中的尿CPXc和CPX-Gc的药代动力学参数
a N＝每处理组6只小鼠
b所给予的环吡酮游离酸剂量,CPX-POM二钠可注射制剂，含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的20mg/mL CPX，每天一次IP给予，连续10天
c环吡酮(CPX)；环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)
d作为CPX-G排泄的剂量部分，将其相对分子量进行校正
在大鼠中的环吡酮-POM前药的药代动力学
研究10954.静脉内给予环吡酮-POM前药后，环吡酮在大鼠中的生物利用度。
IV给予10mg/kg环吡酮胺(CPX-O)和环吡酮-POM前药(CPX-POM)后，在大鼠中表征环吡酮(CPX)的血浆和尿液药代动力学。在该物种中，在表征IV环吡酮-POM前药后的环吡酮的生物利用度中将静脉内环吡酮胺用作参照。鉴于给予CPX-O和CPX-POM后在小鼠中观察到低的CPX的口服生物利用度，因此本研究未对该给药途径进行研究。
IV给予CPX-POM和CPX-O后得到的平均血浆环吡酮浓度-时间分布如图13A所示。IV给予两种处理后，血浆环吡酮浓度迅速下降，表观消除半衰期小于1小时。所得的血浆环吡酮药代动力学参数总结在表4A中。
在IV给予CPX-POM后，与静脉内给予环吡酮胺相比，CPX的全身利用度为77％。在IV推注给药的几分钟内收集的少数血液样品中观察到前药的血浆浓度，但是在大多数收集的样品中，我们未能检测到CPX-POM。在收集的任何尿液样本中未检测到CPX-POM。在IV给予10mg/kg CPX-POM后，实现了广泛的全身暴露于CPX，其中紧跟IV推注给予后的平均初始血浆环吡酮浓度为9,310ng/mL。鉴于在非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌细胞系中2μM(414ng/mL)的体外IC50值，10mg/kg IV CPX-POM获得的Cmax值(Cmax＝45μM)为IC50的大约二十倍。图13A显示了每个治疗组的6只大鼠给予10mg/kg IV CPX-POM和CPX-O的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间半对数分布。
表4A.单次IV剂量的CPX-POM和CPX-O后，雄性Sprague-Dawley大鼠中的血浆CPX药代动力学参数
处理a CPX-POM CPX-O
平均体重(kg) 0.26±0.01 0.27±0.01
CPX剂量(mg/kg)b 9.12±0.05 10.00±0.06
C0(ng/mL) 9.310±5,251 25,883±13,321
Kel(hr-1) 1.580±0.286 1.453±0.634
T1/2(hr) 0.452±0.087 0.615±0.404
AUC0∫n(ng*hr/mL) 2,121±501 3,077±427
AUC0∫∞(ng*hr/mL) 2,161±477 3,141±349
AUMC0∫n(ng*hr2/mL) 827±275 947±608
AUMC0∫∞(ng*hr2/mL) 950±229 1,291±1,206
MRT(hr) 0.455±477 0.446±0.474
Cl(mL/hr/kg) 4,060±399 3,225±374
Vdz(mL/kg) 2,664±670 2,983±2,319
Vss(mL/kg) 1,853±899 1,563±1,853
F(％) 77.0
a N＝每次处理6只大鼠
b所给予的环吡酮游离酸剂量,CPX-POM二钠可注射制剂，其含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的5mg/mL CPX
c C0对应于从非参数药代动力学数据分析得出的y截距值
在10mg/kg IV CPX-O和CPX-POM后，在大鼠中获得的尿CPX药动学参数总结在下表5A中。在单次IV剂量的CPX-POM和CPX-O后，少于1％的剂量被作为CPX排泄。然而，尿CPX浓度超过体外IC50值(2μM)。
表5A.在单剂量IV CPX-POM和CPX-O后，在雄性Sprague-Dawley大鼠中的尿CPXc和CPX-Gc药代动力学参数
处理 CPX-POM CPX-O
平均体重(kg)a 0.252±0.006 0.238±0.006
CPX剂量(mg/kg)b 9.06±0.02 9.98±0.07
UCPX 0-8hr(ng/mL) 1,182±498 921±112
UCPX 8-24hr(ng/mL) 198±172 118±45
UCPX 0-8hr(μM) 4.45±0.54 8.79±2.41
UCPX 8-24hr(μM) 1.22±0.32 2.64±1.13
dXe/dtCPX 0-8hr(μg/hr) 0.23±0.09 0.76±0.26
dXe/dtCPX 8-24hr(μg/hr) 0.07±0.01 0.13±0.04
XeCPX(μg) 2.88±0.78 8.18±2.90
FeCPX(％) 0.13±0.03 0.34±0.12
Clr(mL/hr) 1.27 2.60
Clr(mL/hr/kg) 5.04 0.92
FeCPX-G(％) 27.75±10.02 17.58±2.46
a N＝4只大鼠，它们以完全、非随机、交叉方式接受全部三种处理
b所给予的环吡酮游离酸剂量,CPX-POM二钠可注射制剂，其含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的5mg/mL CPX
c环吡酮(CPX)；环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)
研究11428.皮下给予环吡酮-POM前药和口服环吡酮胺后在大鼠中环吡酮的生物利用度.
IV给予20mg/kg环吡酮-POM前药(CPX-POM)、皮下(SQ)给予30mg/kg CPX-POM和口服给予30mg/kg环吡酮胺(CPX-O)后，表征大鼠中环吡酮(CPX)的血浆和尿液药代动力学。在该物种中，在表征SQ环吡酮-POM前药后的环吡酮的生物利用度中将静脉内CPX-POM用作参照。测定了在给予乙醇胺盐后CPX的口服生物利用度，以建立可注射的CPX-POM与由HoechstAG产生的(通过为支持乙醇胺局部抗真菌产品进行的注册研究)临床前安全性数据之间的药代动力学“桥”。
给予IV和SQ CPX-POM以及口服给予环吡酮胺后，所得到的平均血浆环吡酮浓度-时间分布如图13B所示。与研究10954一致，IV给予CPX-POM后血浆环吡酮浓度迅速下降，其中表观消除半衰期小于1小时。由SQ CPX-POM产生的血浆环吡酮浓度-时间分布与IV CPX-POM明显不同。口服给予环吡酮的乙醇胺盐后的血浆环吡酮浓度相对较低。所得的血浆环吡酮药代动力学参数总结在表6A中。
SQ CPX-POM与IV CPX-POM相比表现出优异的生物利用度，为80％。IV和SQ给予的CPX-POM导致的血浆环吡酮浓度超过体外IC50值(2μM)数倍。口服给予乙醇胺盐后，环吡酮的血浆环吡酮浓度相当低。与IV CPX-POM相比，口服给药的该盐形式的绝对生物利用度为4.6％。在本研究中收集的任何血液或尿液样本中未检测到CPX-POM。图13B显示了在给予20mg/kg IV CPX-POM，30mg/kg SQ CPX-POM和30mg/kg CPX-O至每处理组的六只大鼠后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布。
表6A.单次剂量IV CPX-POM，SQ CPX-POM和口服CPX-O后，雄性Sprague-Dawley大鼠中的血浆CPX药代动力学参数
a N＝每次处理6只大鼠
b所给予的环吡酮游离酸剂量，CPX-POM二钠可注射制剂，其含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的5mg/mL CPX
c对应于从非参数药代动力学数据分析得出的y截距值
在20mg/kg IV CPX-POM，30mg/kg SQ CPX-POM和30mg/kg口服CPX-O后，在大鼠中获得的尿CPX药代动力学参数总结在下表7A中。与口服给予的CPX-O相比，IV和SQ给予CPX-POM导致较高的环吡酮尿浓度。IV和SQ CPX-POM剂量在这些动物中耐受性良好，并且导致尿的环吡酮浓度超过体外IC50值数倍。SQ CPX-POM导致环吡酮显著的全身和泌尿道暴露。
表7A.单剂量IV CPX-POM，SQ CPX-POM和口服CPX-O后，在雄性Sprague-Dawley大鼠中的尿CPXc和CPX-Gc药代动力学参数
a N＝4只大鼠，它们以完全、非随机、交叉方式接受全部三种处理
b所给予的环吡酮游离酸剂量,CPX-POM二钠可注射制剂，其含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的5mg/mL CPX
c环吡酮(CPX)；环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)
在狗中的环吡酮-POM前药药代动力学
研究10953.在狗中静脉内给予环吡酮-POM前药后的环吡酮的生物利用度。IV给予10mg/kg环吡酮胺(CPX-O)和环吡酮-POM前药(CPX-POM)后，对狗中环吡酮(CPX)的血浆和尿液药代动力学进行表征。在该物种中，在表征IV环吡酮-POM前药后的环吡酮的生物利用度中，将静脉内环吡酮胺用作参照。鉴于给予CPX-O和CPX-POM后在小鼠中观察到低的CPX的口服生物利用度，因此本研究未对该给药途径进行研究。
图14示出了向四只雄性比格犬给予3mg/kg IV CPX-POM和CPX-O后的平均血浆CPX浓度-时间分布。
在IV给予CPX-POM后，CPX的全身利用度为85％。在IV推注给药后几分钟内，在极少数血液样本中检测到血浆CPX-POM浓度，然而，在大多数所测定的血浆样品中未检测到所述前药。在任何尿液样本中都未检测到CPX-POM。IV CPX-POM后，活性剂环吡酮的绝对生物利用度优异，其值为85％，其中以IV CPX-O作为参照。3mg/kg的前药IV剂量实现的平均初始血浆环吡酮浓度为2,907ng/mL，其相当于14μM。鉴于在非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌细胞系中2μM的体外IC50值(414ng/mL)，观察到的平均Cmax值为所述IC50的大约七倍。图14显示了向4只雄性比格犬给予3mg/kg IV CPX-POM和CPX-O后的平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布。
表8A.单次IV剂量的CPX-POM和CPX-O后，雄性比格犬中的血浆CPX药代动力学参数
处理 CPX-POM CPX-O
平均体重(kg)a 9.65±0.38 9.64±0.34
IV CPX剂量(mg/kg)b 2.82±0.01 3.10±0.02
C0(ng/mL)c 2,970±969 5,996±1,387
Kel(hr-1) 0.242±0.030 0.185±0.019
T1/2(hr) 2.90±0.329 3.77±0.40
AUC0∫n(ng*hr/mL) 2,571±436 3,314±655
AUC0∫∞(ng*hr/mL) 3,075±591 4,008±802
AUMC0∫n(ng*hr2/mL) 5,485±1,293 7,293±1,520
AUMC0∫∞(ng*hr2/mL) 11,680±3,682 16,665±3,972
MRT(hr) 3.74±0.58 2.20±0.09
Cl(mL/hr/kg) 1,006±209 777.2±192.5
Vdz(mL/kg) 4,133±363 4,253±1,266
Vss(mL/kg) 3,686±431 3,218±810
F(％) 85.1±9.69
a N＝4只狗以完全、交叉的研究设计接受处理，在每次处理前对动物进行称重以确定所给予的剂量体积，并因此确定每次处理在体重上的轻微差异
b所给予的环吡酮游离酸剂量，CPX-POM二钠可注射制剂，其含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的5mg/mL CPX
c C0对应于从非参数药代动力学数据分析得出的y截距值
在3mg/kg IV CPX-O和CPX-POM后，在狗中获得的尿CPX药动学参数总结在下表9A中。在单次IV剂量的CPX-POM和CPX-O后，少于1％的剂量被作为CPX排泄。然而，在CPX-POM和CPX-O的3mg/kg IV剂量下，尿CPX浓度超过了体外IC50值(2μM)。无活性环吡酮葡糖苷酸代谢物代表了在尿中排泄的主要物质。
表9A.单次IV剂量的CPX-POM和CPX-O后，雄性比格犬中的尿CPX药代动力学参数
处理 CPX-POM CPX-O
平均体重(kg)a 9.65±0.38 9.64±0.34
CPX剂量(mg/kg)b 2.82±0.01 3.10±0.02
UCPX 0-8hr(ng/mL) 838±149 1,006±370
UCPX 8-24hr(ng/mL) 112.0±56.1 72.5±54.5
UCPX 0-8hr(μM) 4.04±0.72 4.86±1.79
UCPX 8-24hr(μM) 0.541±0.271 0.350±0.263
dXe/dtCPX 0-8hr(μg/hr) 9.88±0.3.89 12.58±5.61
dXe/dtCPX 8-24hr(μg/hr) 0.97±0.19 0.43±0.42
XeCPX(μg) 94.5±32.6 107.5±39.9
FeCPX(％) 0.345±0.111 0.358±0.123
Clr(mL/hr) 31.90±18.25 26.43±9.63
Clr(mL/hr/kg) 3.284±1.810 2.730±0.916
FeCPX-G(％) 51.11±5.31 62.67±12.15
a N＝4只狗，以完全、交叉的研究设计接受处理，在每次处理前对动物进行称重以确定所给予的剂量体积，并因此确定每次处理在体重上的轻微差异
b所给予的环吡酮游离酸剂量，CPX-POM二钠可注射制剂，含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的5mg/mL CPX
研究11429.在狗中皮下给予环吡酮-POM前药和口服环吡酮胺后环吡酮的生物利用度.IV给予3mg/kg环吡酮-POM前药(CPX-POM)，皮下(SQ)给予9mg/kg CPX-POM和口服给予9mg/kg环吡酮胺(CPX-O)后，对狗中的环吡酮(CPX)的血浆和尿液药代动力学进行表征。在该物种中，在表征SQ环吡酮-POM前药后的环吡酮的生物利用度中，将静脉内CPX-POM用作参照。测定了在给予乙醇胺盐后CPX的口服生物利用度，以建立可注射的CPX-POM与由HoechstAG产生的(通过为支持乙醇胺局部抗真菌产品进行的注册研究)临床前安全性数据之间的药代动力学“桥”。
向狗给予IV和SQ CPX-POM以及口服给予环吡酮胺后得到的平均血浆环吡酮浓度-时间分布如图15所示。与研究10953一致，IV给予CPX-POM后血浆环吡酮浓度迅速下降，其中表观消除半衰期小于1小时。由SQ CPX-POM产生的血浆环吡酮浓度-时间分布与IV CPX-POM显著不同。口服给予环吡酮的乙醇胺盐后的血浆环吡酮浓度相对较低。所得血浆环吡酮药代动力学参数总结在表10A中。
SQ CPX-POM与IV CPX-POM相比表现出优异的生物利用度，为106％。IV和SQ给予的CPX-POM导致血浆环吡酮浓度超过体外IC50值(2μM)数倍。口服给予乙醇胺盐后，环吡酮的血浆环酮浓度相当低。与IV CPX-POM相比，口服给予的该盐形式的绝对生物利用度为17.4％。在本研究中收集的任何血液或尿液样本中未检测到CPX-POM。图15显示了在给予3mg/kg IV CPX-POM、9mg/kg SQ CPX-POM和9mg/kg口服CPX-O至4只雄性比格犬后，平均血浆环吡酮(CPX)浓度-时间直线分布。
表10A.单剂量IV CPX-POM、SQ CPX-POM和口服CPX-O后，雄性比格犬中的血浆CPX药代动力学参数
处理a CPX-POM IV CPX-POM SQ CPX-O口服
平均体重(kg) 9.58±0.49 9.91±0.81 9.48±0.64
CPX剂量(mg/kg)b 3.10±0.02 9.28±0.09 9.39±0.04
C0(ng/mL) 3,770±1280c
Cmax(ng/mL) 1,988±374 1,017±271
Tmax(hr) 0.264±0.122 0.250±0.129
Kel(hr-1) 0.153±0.072 0.137±0.031 0.126±0.009
T1/2(hr) 5.54±2.92 5.27±1.18 5.52±0.39
AUC0∫n(ng*hr/mL) 3,622±255 11,518±2,632 1,901±650
AUC0∫∞(ng*hr/mL) 5,262±1243 19,614±6161 2,697±1013
AUMC0∫n(ng*hr2/mL) 8,836±1,186
AUMC0∫∞(ng*hr2/mL) 38,965±29,492
MRT(hr) 6.76±3.76
Cl(mL/hr/kg) 615±145
Vdz(mL/kg) 4,486±1366
Vss(mL/kg) 3,776±1,266
F(％) 106±22.3d 17.4±5.65d
a N＝4只狗，它们以非随机、完全、交叉的方式接受全部三种处理
b所给予的环吡酮游离酸剂量,CPX-POM二钠可注射制剂，其含有于25mM磷酸盐pH7(含有50mM)中的5mg/mL CPX
c C0对应于从非参数药代动力学数据分析得出的y截距值
d给定28％,39％和29％的AUC0∫∞，使用AUC0∫n确定绝对生物利用度，该绝对生物利用度由外推的AUC组成
在3mg/kg IV CPX-POM、9mg/kg SQ CPX-POM和9mg/kg口服CPX-O后，在狗中获得的尿CPX药代动力学参数总结在下表11A中。与口服给予的CPX-O相比，IV和SQ CPX-POM给药导致环吡酮的尿浓度相对较高(调整的剂量)。IV和SQ CPX-POM剂量在这些动物中耐受性良好，导致尿的环吡酮浓度超过体外IC50值数倍。SQ CPX-POM导致环吡酮的显著的全身和泌尿道暴露。
表11A.单剂量IV CPX-POM，SQ CPX-POM和口服CPX-O后，在雄性比格犬中尿CPX d和CPX-G d的药代动力学参数
处理a CPX-POM IV CPX-POM SQc CPX-O口服
平均体重(kg) 9.58±0.49 9.91±0.81 9.48±0.64
CPX剂量(mg/kg)b 3.10±0.02 9.28±0.09 9.39±0.04
UCPX(ng/mL)0-24hr 957±508 2,530±958 1,602±750
UCPX(μM)0-24hr 4.62±2.45 12.2±4.6 7.74±3.62
XeCPX(μg)0-24hr 208±117 339±206 299±208
FeCPX(％) 0.70±0.38 0.38±0.24 0.32±0.21
Xe/dtCPX(μg/hr)0-8hr 19.8±15.2 23.0±16.6 31.6±26.2
Xe/dtCPX(μg/hr)8-24hr 3.10±3.33 9.67±9.49 2.90±1.70
Clr(mL/hr) 43.2±33.6
Clr(mL/hr/kg) 4.51+3.51
FeCPX-G(％) 49.2±34.4 43.0±19.7 37.0±18.7
a N＝4只狗，它们以非随机、完全、交叉的方式接受全部三种处理
b所给予的环吡酮游离酸剂量,CPX-POM二钠可注射制剂，其含有于25mM磷酸盐pH7(含50mM)中的5mg/mL CPX
c N＝3
d环吡酮(CPX)；环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)
环吡酮葡糖苷酸在膀胱癌患者尿中的体外稳定性
环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)是在给予CPX-POM以及环吡酮的乙醇胺盐后，在小鼠、大鼠、狗和人中观察到的主要尿代谢物。作为抗-膀胱癌药物，CPX-G不是活性的。CPX-G被β-葡糖苷酸酶代谢形成活性环吡酮，实际上是使活性抗膀胱癌剂再活化。基于人排泄数据[Kellner等，Arzneimittel-Forschung.31(8A):1337-1353]以及膀胱癌患者在尿中具有增加的葡糖苷酸酶活性这样的证据[Paigen,K.,Peterson,J.,Paigen B.(1984)Role ofurinaryβ-glucuronidase activity in human bladder cancer.Cancer Res 44:3620-3623]，我们进行体外代谢研究以表征从膀胱癌患者获得的环吡酮葡糖苷酸在尿中的稳定性(浓度为150μM)，与从健康志愿者收集的对照尿液相比。
在将CPX-G于从六名NMIBC患者获得的汇集的患者尿液中孵育6小时后，膀胱癌患者尿液中的150μMCPX-G的水解，导致形成7.9μM环吡酮，形成率为5％。与使用健康志愿者标本的尿液孵育相比，膀胱癌患者尿中环吡酮形成的程度大约为11.4倍。在汇集的膀胱癌患者尿液中，β-葡糖苷酸酶介导的环吡酮葡糖苷酸水解速率为对照尿液的5.6-11.5倍。在NMIBC患者和健康志愿者获得的尿液中，尿β-葡糖苷酸酶的活性分别为69.5U/mL和1.39U/mL(膀胱癌患者尿液中高118倍的酶活性)。膀胱癌患者尿液中CPX-G的选择性水解导致活性抗癌剂环吡酮的再活化。
预测IV给予环吡酮-POM前药后人尿的环吡酮浓度
口服给予于人的环吡酮胺(CPX-O)在尿液中快速且完全消除，其中87％的剂量在6小时内排泄，和约95％的剂量在给药的12小时内排泄[Kellner等，Arzneimittel-Forschung.31(8A):1337-1353]。在尿中回收的95％的剂量中，83％被鉴定为环吡酮(4％)和环吡酮葡糖苷酸(79％)。CPX葡糖苷酸在体外不具有活性。
我们根据以下假设模拟尿环吡酮(CPX)浓度-时间数据:32mg/m2静脉内剂量的环吡酮-POM前药(CPX-POM)是良好耐受的(注意，80mg/m2的口服CPX-O当每天一次给予时是良好耐受的)；32mg/m2静脉内剂量的CPX-POM中的百分之四被作为环吡酮排泄，类似于给予单一口服剂量的10mg C14CPX-O后的CPX百分比；在膀胱癌患者中，百分之五的CPX-G被水解为CPX；并且新确诊的膀胱癌患者的常见尿液生成率为1mL/hr/kg。图18显示在本发明尿液中和对照尿中自前药形成环吡酮。另见图19-20。
全身给予环吡酮-POM前药选择性地将CPX递送至整个泌尿道
基于这些假设，我们预测，在非肌层浸润性膀胱癌细胞系中，IV和SQ给予环吡酮-POM前药(CPX-POM)所导致的尿CPX浓度超过体外IC50值的数倍。
CPX-POM的可注射给药途径优于口服给药，从而避免胃肠道毒性以及差的口服生物利用度。已经发现，每天四次给药的口服环吡酮胺(CPX-O)导致剂量限制性胃肠道毒性(Minden等，Am J Hematol 89(4):363-368,2014)。
已经进行了体外研究以了解环吡酮作为治疗NMIBC和MIBC的有效和新型治疗剂的作用。分别对人NMIBC和MIBC细胞系253JBV和T24进行了充分表征。由于细胞培养基缺乏将CPX-POM代谢为环吡酮(CPX)所必需的酶(磷酸酶)，因此通过向细胞培养基中加入CPX-O使膀胱癌细胞系暴露于CPX来进行作用机制的研究。
为了确定CPX对T24(MIBC)和253-JBV(NMIBC)细胞中膀胱癌细胞增殖的影响，将每孔5000个细胞接种到96孔板上并生长过夜。然后用增加剂量的CPX在含有10％FBS的RPMI培养基中处理细胞。处理期后细胞增殖的分析通过己糖胺酶测定法进行估计。简言之，除去培养基，加入于柠檬酸盐缓冲液pH 5(7.5mM)，对硝基苯酚-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(Sigma Aldrich)中的己糖胺酶底物溶液，每孔75μL。将板在37℃，100％湿度下孵育30分钟。用112.5μL含有5mM EDTA(pH10.4)的50mM甘氨酸终止反应。在405nm测量吸光度。以n＝6进行实验，然后重复至少三次。将数据作为对照的百分比进行分析，其中对照孔只用当量的DMSO处理。对于IC50计算，产生药物浓度和氨基己糖苷酶活性之间的曲线，数据线性或指数拟合。最佳拟合用于进一步处理数据。通过测定在处理48小时后导致50％细胞死亡的化合物的浓度来获得IC50。
环吡酮在NMIBC和MIBC中表现出抗癌活性:
已发现，环吡酮(CPX)抑制膀胱癌细胞增殖。图9,10和11显示，CPX抑制膀胱癌细胞系的增殖。将细胞与指定剂量的化合物孵育长达72小时。CPX处理导致T24和253JBV细胞中细胞增殖的剂量和时间依赖性降低。如图9和11所示，该实验结果表明，CPX以剂量和时间依赖的方式显著抑制细胞系的增殖。在24小时内观察到这种效果，其在接下来的48小时内仍然持续。对于253JBV和T24细胞，化合物的IC50值在48小时时分别为2和4μM。
环吡酮在2维和3维模型系统中抑制膀胱癌生长:
我们接下来使用集落生成测定法确定环吡酮(CPX)对膀胱癌细胞的长期作用。对于该测定，将6孔板用500个活细胞接种，并使其生长过夜。然后将细胞在存在或不存在各种浓度(1和5μM)的CPX下孵育48小时。然后除去含CPX的培养基，并将细胞在PBS中洗涤并在完全培养基中再培养10天。每次处理一式三份进行。所获得的菌落用PBS洗涤并在室温下在10％福尔马林中固定10分钟，然后用PBS洗涤，接着用结晶紫染色。将菌落与未处理的细胞进行比较。
如图19-20所示，与对照相比，CPX抑制菌落的数量和大小，表明将细胞用化合物短期孵育对细胞的活力具有长期的抑制作用。图19-20显示CPX抑制膀胱癌细胞生长。将T24和253-JBV膀胱癌细胞铺板并用IC50浓度的CPX(指示剂量)处理48小时。更换新鲜培养基并使其生长10天。将菌落用结晶紫染色，并与未处理的细胞进行比较。
环吡酮抑制膀胱癌球状体:
最近的研究已经证明了肿瘤中的异质性，并且在肿瘤内发生少量干细胞，其具有自我更新能力并具有产生分化后代的能力。球状体测定法有时也被称为3D测定法，作为在体外传播上皮干细胞的方法而开发，现在是干细胞活性的标准替代报告物。该测定(在这种情况下称为bladdosphere测定)是基于这样的假设，即在膀胱癌中存在的独特的未分化细胞将在悬浮培养中存活，而其他细胞将通过失巢凋亡而死亡。因此，我们在bladdosphere测定中表征环吡酮(CPX)的作用。这里，将癌细胞铺板在超低结合板中，所得的球状体被认为代表来自干细胞的生长。
为了形成球状体，将细胞在RPMI 1640(Mediatech)中培养，所述RPMI1640(Mediatech)补充有20ng/mL bFGF(Invitrogen)(10mL，每500mL 50X B27补充剂(Invitrogen)，EGF 20ng/mL(Invitrogen))和抗生素和抗真菌溶液。将细胞以低密度(5000细胞/mL)接种在6孔低粘附板中。用增加浓度的CPX(从细胞增殖测定计算的IC50的0.5x，1x，2x-对于253JBV为2μM，和对于T24为4μM)处理细胞。7天后，拍摄球状体(第一代)。收集对照球状体和用CPX处理的球状体(1X IC50)，胰蛋白酶消化和再次铺板进行次级球形体生长(II代)，然后进行第三级球状体发育(III代)。
图21显示CPX抑制膀胱癌球状体。将细胞接种在超低附着板中并用CPX处理并与指定剂量的化合物一起孵育。CPX处理导致T24和253-JBV膀胱癌细胞(I代)形成的球状体的大小和数量的显著减少。CPX处理也显著减少次级和第三级球状体的生长。该实验结果如图21所示，证明当用CPX处理细胞时，T24和253JBV膀胱癌细胞球状体的球状体大小和数量显著减少。次级和第三级球状体发育被CPX处理显著抑制。这些数据表明该化合物影响膀胱癌内的癌干细胞。也参见图10。
环吡酮阻滞处在细胞周期S期的细胞:
进行基于流式细胞术的细胞周期分析研究以确定环吡酮(CPX)对T24细胞中细胞周期进程的影响(数据未显示)。研究表明CPX诱导S-期细胞周期停滞(数据未显示)。在1XIC50和2X IC50浓度下，CPX在G0/G1期阻滞细胞。用CPX处理细胞，并进行基于流式细胞仪的分析。CPX处理显著增加在S期和G0/G1-期被阻滞的细胞的百分比。
经确定，CPX诱导细胞凋亡。我们接下来确定化合物是否可以通过凋亡途径诱导细胞死亡。为此，我们用CPX(4μM)处理T24膀胱癌细胞，并用FITC缀合的膜联蛋白V标记细胞以检测凋亡细胞。结果如图22所示，表明CPX处理具有高水平的FITC+细胞，这意味着CPX诱导细胞死亡。图22显示CPX在膀胱癌细胞系中诱导细胞死亡。将细胞与指定剂量的化合物一起孵育长达48小时。CPX处理导致T24细胞中细胞死亡的显著增加，从膜联蛋白V-FITC标记的细胞的增加可以看出这一点。
环吡酮影响癌干细胞信号传导途径:
我们进行了RT-PCR阵列分析，作为初步研究，以确定受环酮(CPX)影响的途径。使用RT2 ProfilerTM PCR阵列(SA Biosciences,Frederick,MD,USA)按制造商的说明进行表达分析。使用人类信号转导途径发现者聚合酶链反应(PCR)阵列(目录号PAHS-014ZA)。简言之，使用TRIZOL反应物从T24细胞分离的总RNA在随机六核苷酸引物(均来自Invitrogen，Carlsbad，CA)的存在下用Superscript II逆转录酶逆转录。将互补DNA(2μg)与1,275μLRT2SYBR Green qPCR Master Mix(PA-010；SA Biosciences)混合，构成总体积为2,550μL。每孔接受25μL所述混合物。根据SA Biosciences推荐的检测方案，在Bio-Rad CFX机上进行qPCR。mRNA表达的变化表示为相对于对照的倍数变化。
图23A-23C显示CPX抑制CSC信号传导途径。CPX处理显著降低Notch及其下游信号传导蛋白的mRNA表达。此外，CPX抑制T24细胞中参与Wnt和Hedgehog信号传导途径的基因的表达。如图23A-23C所示，CPX处理显著降低参与CSC信号传导途径如Notch，Wnt和Hedgehog的基因的表达(mRNA水平)。
环吡酮影响Notch信号传导途径:
我们进行了RT-PCR阵列分析，以确定受环吡酮(CPX)影响的途径。我们的初步研究发现，CPX处理影响了Notch信号传导途径。当配体与相邻细胞上的Notch跨膜受体相互作用时，引发Notch信号传导。这引发了Notch细胞内结构域(NICD)的γ-分泌酶介导的蛋白水解释放，NICD随即转移到细胞核中，与其转录辅因子CBF1/RBPJ相互作用，并反式激活靶基因，导致增殖和转移增加。Notch信号传导已被证明在癌症干细胞自我更新中发挥关键作用，并且早期研究表明，抑制Notich途径可能是基于干细胞的治疗的良好机制。
以前的研究表明，高水平的Notch1活性与膀胱癌肿瘤进展相关，Notch1可能是治疗膀胱癌的潜在治疗靶点。进行Western印迹研究以检测CPX对参与Notch信号传导途径的蛋白的表达的影响。将细胞裂解物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并印迹到Immobilon聚偏氟乙烯膜上(Millipore,Bedford,MA,USA)。抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly,MA,USA),Abcam Inc.(Cambridge,MA,USA)和Santa Cruz Biotechnology Inc.(SantaCruz,CA,USA)，并且通过增强的化学发光系统检测特异性蛋白质(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)。用CPX膀处理胱癌细胞系显著抑制早老素1，Nicastrin，APH-1和PEN-2等γ-分泌酶复合物蛋白的表达，从而导致经切割的活化Notch细胞内结构域(NICD1)的降低。CPX还减少了Jagged1，一种Notch受体的配体。此外，CPX处理后，包括Hes1和细胞周期蛋白-D1在内的途径的下游靶标的水平也显著降低。这些数据表明CPX显著抑制Notch细胞内信号传导途径蛋白，从而抑制CSC生长。见图16-17。
图16-17显示CPX抑制Notch1信号传导和γ-分泌酶复合物蛋白。CPX处理显著降低Notch1活化及其配体Jagged1。其也减少了下游靶蛋白Hes-1和细胞周期蛋白D1。此外，CPX在T24细胞中抑制γ-分泌酶复合物蛋白早老素1，Nicastrin，APH-1和PEN-2的表达。右侧显示Notch信号传导途径。
环吡酮通过使γ-分泌酶复合物失活来抑制细胞生长:
我们确定NICD的异位表达是否逆转环吡酮(CPX)介导的对细胞增殖的抑制。对于本研究，用编码Notch-1细胞内结构域(NICD)的质粒EF.hICN1.CMV.GFP或空载体EF.v-CMV.GFP(Addgene Inc.)转染T24细胞，随后用CPX(4μM)处理。使用己糖胺酶测定检测细胞增殖。Western印迹分析显示，在T24细胞系中NICD异位表达后Notch-1的表达增加。NICD的异位表达逆转CPX介导的对细胞增殖的抑制。这些数据表明CPX抑制γ-分泌酶复合物，从而影响Notch信号传导。
Notch-1表达与肿瘤进展相关，并且涉及侵袭性膀胱移行细胞癌的致癌作用和进展(J Clin Oncol 30，2012(suppl 5；摘要299))。有人提出，Notch-1代表治疗膀胱癌的治疗靶点(Oncogene(2008)27,5132-5137)。Notch-1信号传导也可能代表NMIBC进展成MIBC的潜在诊断标志(J Clin Oncol 30，2012(suppl 5；abstr 299))。我们实验室产生的数据表明CPX通过抑制Notch-1信号传导途径体外抑制膀胱癌生长。
图24显示CPX通过使γ-分泌酶复合物蛋白失活来抑制细胞生长。用CPX处理表达NICD的细胞，随后测定其增殖。NICD的异位表达挽救了CPX介导的对细胞增殖的抑制。
环吡酮-POM前药(CPX-POM)或环吡酮葡糖苷酸(CPX-G)在体外显示出非常小的抗癌活性:
我们通过进行增殖测定，确定并比较了CPX与CPX-POM和CPX-葡糖苷酸在体外的作用。为了确定CPX、CPX-POM和CPX-葡糖苷酸对T24(MIBC)和253-JBV(NMIBC)细胞中的膀胱癌细胞增殖的作用，将每孔5000个细胞接种到96孔板上并生长过夜。然后用增加剂量的CPX，CPX-POM和CPX-葡糖苷酸(于含有10％FBS的RPMI培养基中)处理细胞。通过己糖胺酶测定法评估治疗期后细胞增殖的分析。简言之，除去培养基，加入于柠檬酸盐缓冲液pH 5(7.5mM)，对硝基苯酚-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(Sigma Aldrich)中的己糖胺酶底物溶液，每孔75μL。将板在37℃在100％湿度下孵育30分钟。用112.5μL含有5mM EDTA的50mM甘氨酸(pH10.4)终止反应。在405nm测量吸光度。
在n＝6进行实验，然后重复至少三次。将数据作为对照的百分比进行分析，其中对照孔只用等量的DMSO处理。对于IC50计算，产生药物浓度和己糖胺酶活性之间的曲线，并且将数据线性拟合或指数拟合。通过测定在处理48小时后导致50％细胞死亡的化合物的浓度来获得IC50。
该实验结果表明，CPX以剂量和时间依赖性方式显著抑制两种细胞系(T24和253JBV)的增殖(在T24和253JBV细胞中，IC50分别为IC50＝>4μM和3μM)。而CPX-POM对增殖的影响非常小(在T24和253JBV细胞中，IC50分别为IC50＝>45μM和48μM)，并且CPX-葡糖苷酸在两种细胞中在长达72h的处理中均未显示任何显著的效果。在总结的时候，正在进行评估CPX-POM在细胞培养基中的化学稳定性的实验，从而评估CPX-POM是否在体外形成CPX。
人尿中预测的CPX浓度显示出足够的抗癌活性:
我们确定人尿中预测的CPX浓度是否足以产生抗癌活性。在正常尿液(从KUMC的生物标本储存库获得)存在下，用CPX处理细胞以模拟膀胱中的环境。同时，进行百分比剂量曲线以确定可用于进一步研究的对细胞无毒的尿百分比(图25A)。图25A显示正常尿液对细胞的影响。将253JBV细胞与指定百分比的正常尿液一起孵育长达72小时。发现尿液浓度小于20％对细胞无毒性。
将253JBV细胞与各种百分比的尿在完全RPMI培养基中孵育长达12小时。12小时后，用100％完整的RPMI培养基更换培养基。使细胞生长达72小时。进行己糖胺酶测定，以确定不同时间点(24h，48h和72h)尿的作用。经确定，20％正常尿液可用于进一步研究，因为在给定时间段(12h)未发现对细胞有毒性。
为了确定预测的人尿中的CPX浓度是否足以产生抗癌活性，将NMIBC细胞与CPX在正常尿液中(于完全RPMI培养基中的20％正常尿液)一起孵育，其中细胞暴露于50μMCPX两小时，然后暴露于25uM CPX两小时，然后暴露于12.5uM CPX两小时，然后暴露于6.25uM CPX两小时，接着暴露于3.125uM CPX两小时，最后，暴露于1.5625uM CPX两小时。通过己糖胺酶测定法测定不同CPX浓度在12小时以后(24h，48h和72h)CPX的作用。将CPX在正常尿液中的作用与CPX在完全培养基中的作用进行比较。
该实验结果如图25B所示，其表明CPX在人尿中的预测尿浓度足以抑制细胞增殖。发现CPX表现出12小时以上的抗增殖作用，效果持续至72h。
接下来，我们确定在每日处理至处理长达72小时(3天处理)的情况下，CPX在正常尿液中对T24和253JBV细胞的作用。该实验背后的想法是观察人尿液中预测浓度的CPX对膀胱癌细胞的影响，因为患者的膀胱每天暴露于预测浓度的CPX。使用三组板，每组一片用于CPX(50-1.5625uM)的一天处理、两天处理和三天处理。将T24和253JBV细胞与CPX在正常尿液中(于完全RPMI培养基中的20％正常尿液)孵育。在一天处理中，将细胞暴露于50μM CPX两小时，然后暴露于25μM CPX两小时，随后暴露于12.5μM CPX两小时，然后暴露于6.25μMCPX两小时，然后暴露于3.125uM CPX两小时，最后暴露于1.5625uM CPX两小时。通过己糖胺酶测定法测定不同CPX浓度在12小时以后(24h，48h和72h)CPX的作用。在两天的治疗中，将细胞暴露于50uM-1.5625uM两天，并通过己糖胺酶测定在48小时和72小时时间点的作用。在3天的治疗中，将细胞暴露于50uM-1.5625uM三天，并通过己糖胺酶测定在72小时时间点的作用。
图25C显示，每天用人尿中的预测浓度的CPX处理T24细胞显示出显著的抗癌活性。将T24细胞与CPX在正常尿液中(于完全RPMI培养基中的20％正常尿液)一起孵育。在一天处理中，将细胞暴露于不同CPX浓度(50uM-1.5625uM)12小时。通过己糖胺酶测定法测定不同CPX浓度在12小时以后(24h，48h和72h)的CPX的作用。在两天的处理中，将细胞暴露于50uM-1.5625uM两天，并通过己糖胺酶测定在48小时和72小时时间点测定作用。在3天的治疗中，将细胞暴露于50uM-1.5625uM三天，并通过己糖胺酶测定在72小时时间点测定其作用。与CPX孵育的T24细胞在增殖方面显示时间依赖性减少，其中处理了3天的细胞显示出对增殖的最大抑制(20％)。
图25D显示，每天用于人类尿液中的预测浓度的CPX处理253JBV细胞具有显著的抗癌活性。将253JBV细胞与CPX在正常尿液中(于完全RPMI培养基中的20％正常尿液)一起孵育。在一天处理中，将细胞暴露于不同CPX浓度(50uM-1.5625uM)12小时。通过己糖胺酶测定法测定不同CPX浓度下12小时以后(24h，48h和72h)CPX的作用。在两天的治疗中，将细胞暴露于50uM-1.5625uM两天，并通过己糖胺酶测定在48小时和72小时时间点测定其作用。在3天的治疗中，将细胞暴露于50uM-1.5625uM三天，并通过己糖胺酶测定在72小时时间点测定其作用。与CPX孵育的253JBV细胞在增殖方面显示时间依赖性降低，其中处理3天的细胞显示出对增殖的最大抑制(35％)。
该实验结果如图25C-25D所示，表明人尿中CPX的预测尿浓度显示出时间依赖性降低细胞增殖。在两种细胞系例如T24和253JBV中，CPX处理3天显示增殖的最大抑制，分别为20％和35％。
图26A-26B均包括显示CPX-POM降低BBN诱导的膀胱肿瘤的膀胱重量的图。在CPX-POM处理的动物中，与对照组相比，经过四周每日一次100mg/kg和200mg/kg的IP CPX-POM剂量，膀胱重量(作为肿瘤体积的量度)显著降低(p＝0.013)。两个CPX-POM处理组之间膀胱重量无显著差异。与对照的健康膀胱相比，只给予BBN的动物由于肿瘤的诱导和生长而显示膀胱重量增加。在100和200mg/kg处理剂量下，CPX-POM处理显著降低膀胱重量。
CPX-POM处理与肿瘤阶段之间有很强的相关性。从对照(仅BBN)动物获得的膀胱组织主要含有高等级(T3)肿瘤，而CPX-POM处理的动物显示出向低阶段肿瘤的明显迁移。仅BBN组的动物的苏木精和伊红染色的膀胱组织切片显示非常高频率的T3阶段肿瘤。CPX-POM处理的膀胱的组织切片显示T3阶段频率显著降低，表明CPX-POM在肿瘤的早期阶段遏制该肿瘤。
以前的研究表明，高水平的Notch1活性与膀胱癌肿瘤进展相关，Notch1可能是治疗膀胱癌的潜在治疗靶点。来自CPX-POM处理的膀胱组织的组织切片显著抑制诸如早老素1等γ-分泌酶复合物蛋白的表达，从而导致断裂的活化Notch细胞内结构域(NICD1)的降低。此外，CPX-POM处理后，包括Hey1在内的所述途径的下游靶点水平也得到显著抑制。这些数据表明CPX-POM显著抑制Notch细胞内信号传导途径蛋白，从而在体内抑制癌症干细胞(CSC)生长。
图27A包括的图像显示，在体内CPX-POM抑制Notch1信号传导和γ-分泌酶复合物蛋白。CPX-POM处理显著降低Notch1活化和γ-分泌酶复合物蛋白，即早老素1，并减少下游靶蛋白如Hey-1。两个CPX-POM处理组均观察到对Notch信号传导途径的抑制作用。
图27B包括的图像显示，在BBN诱导的膀胱肿瘤模型中，CPX-POM抑制Notch下游靶标蛋白，细胞周期蛋白D1和c-Myc。CPX-POM显著降低Notch下游靶标蛋白，如细胞周期蛋白D1和c-Myc，其在细胞生长中起重要作用。因此，CPX-POM处理也导致了在BBN诱导的膀胱肿瘤模型中对Notch下游靶标蛋白细胞周期蛋白D1和c-Myc的抑制。这些下游靶标蛋白通过细胞周期在细胞进展中起主要作用。总之，我们在膀胱癌小鼠验证模型中建立了体内临床前原理证据。我们证明，在注射给予CPX-POM后，在目标作用位点(即，泌尿道)可获得足够浓度的环吡酮，在稳态下持续足够长的时间(即超过24小时)。其次，我们已经确定环吡酮在所述作用位点与提出的靶标(例如Notch信号传导途径)结合，第三，我们已经确定在作用位点环吡酮靶向的结合作用导致与提出的作用机制(肿瘤大小减少，肿瘤阶段迁移)一致的药物活性。
CPX-POM在体外和体内都能抑制增殖的细胞核抗原(PCNA)。我们检测了非肌层浸润性膀胱癌细胞系和CPX-POM处理的膀胱肿瘤组织中的PCNA含量，Western印迹研究显示在CPX-POM处理的T24细胞中PCNA水平随时间依赖性降低。CPX-POM降低体内PCNA的水平。此外，研究显示Notch细胞内途径和PCNA之间呈正相关。我们实验室生成的数据表明，CPX-POM通过抑制Notch-1信号传导途径、Notch下游靶标蛋白和增殖细胞核抗原来体内抑制膀胱癌生长。
图28显示CPX-POM在体外和体内都抑制增殖细胞核抗原(PCNA)。卡通图解释了PCNA在将DNA聚合酶中与DNA维持在一起中所发挥的作用，其在DNA复制中起重要作用。Western印迹研究显示CPX处理的T24细胞中，PCNA水平随时间依赖性降低。CPX-POM也降低PCNA在体内的水平。
另外，临时申请(并入本文)的数据显示：CPX抑制T24细胞系中的Notch、Wnt和Hedgehog途径；CPX抑制T24细胞系中NOTCH途径相关基因；CPX抑制T24细胞系中Wnt信号传导途径相关基因；CPX抑制T24细胞系中的Hedgehog途径相关基因。
本文提供的数据提供以下信息。众所周知，POM部分被血液中循环的磷酸酶代谢。发生CPX-POM的完全代谢形成环吡酮。IV CPX-POM给予小鼠后，环吡酮与IV推注给予环吡酮胺相比是完全生物可利用的。在给予大鼠IV CPX-POM后，与IV推注给予环吡酮胺相比，环吡酮的生物利用度为77％。将IV CPX-POM给予狗后，与IV推注给予环吡酮胺相比，环吡酮的生物利用度为85％。在参与药代动力学研究的小鼠，大鼠和狗中，在IV，SQ和口服给予所述前药后，在血浆和尿液中很少检出CPX-POM。CPX-POM通过可注射的给药途径以良好耐受的剂量给予导致血浆和尿中环吡酮的浓度超过报道的体外IC50值。在通过皮下给药途径在大鼠和狗中给予CPX-POM后，环吡酮是生物可利用的。在给予良好耐受的IV剂量的CPX-POM后，血浆环吡酮浓度超过了所报道的体外IC50值。CPX-POM耐受性良好的IV和SQ剂量后的血浆环吡酮浓度超过了体外IC50值。对于在小鼠，大鼠和狗中的非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌，在IV，SQ和口服给予CPX-POM后，尿环吡酮浓度超过体外IC50值。向小鼠给予IPCPX-POM剂量的50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg导致尿环吡酮浓度超过报道的体外IC50值数倍。IV10mg/kg和IP 50mg/kg CPX-POM剂量导致环吡酮的单剂量尿浓度超过体外IC50值数倍。在给予大鼠IV和SQ剂量的CPX-POM后，环吡酮的尿浓度超过在良好耐受剂量下2-4μM范围内的体外IC50值。在给予狗IV和SQ剂量的CPX-POM后，环吡酮的尿浓度超过在良好耐受剂量下2-4μM范围的体外IC50值。
人尿中预测的CPX浓度足以产生抗癌活性(例如，抗膀胱癌或本文所述的其它癌症)。每天用于人尿中预测浓度的CPX进行的治疗方法显示出对细胞的最大抑制作用。此外，本发明的化合物可用于治疗上泌尿道疾病。
本文提供的数据清楚地表明，环吡酮，环吡酮胺或环吡酮-POM前药可用于本文所述的治疗。具体地，任何一种膀胱癌治疗都可以用环吡酮，环吡酮胺或环吡酮-POM前药进行。
总之，CPX-POM在给予后迅速并完全地体内转化为活性剂环吡酮。小鼠研究208-02表明，环吡酮暴露的程度基本相同(137％)，无论是IV给予CPX-POM还是环吡酮的乙醇胺盐。大鼠研究10954表明，环吡酮暴露的程度基本上相同(77％)，无论是IV给予CPX-POM还是环吡酮的乙醇胺盐。狗研究10953表明，环吡酮暴露的程度基本相同(85％)，无论是IV给予CPX-POM还是环吡酮的乙醇胺盐。同样，如所有研究所述，我们无法在任何研究中检测血浆中或尿液中的CPX-POM。这些研究表明，CPX-POM的IV给药途径是可行的途径。
CPX-POM的皮下给药途径是生物可利用的。大鼠研究11428证实，在SQ给予CPX-POM后，环吡酮的绝对生物利用度为80％，并且在SQ CPX-POM后，尿的环吡酮浓度超过体外IC50值。狗研究11429证明，在SQ给予CPX-POM后，环吡酮的绝对生物利用度为106％，并且在SQCPX-POM之后，环吡酮的尿浓度超过体外IC50值。这些研究以及小鼠研究208-02也证明环吡酮胺的口服生物利用度相当低。这种给药途径也与药物的较低尿液浓度有关，从而确定了皮下给药途径是有益的，特别是在需要重复给予CPX-POM的情况下(如I型糖尿病患者服用胰岛素那样)。
数据表明，CPX-POM可用于治疗膀胱癌，如验证的膀胱癌小鼠模型所示。小鼠研究11177确定腹膜内(IP)给药途径(用于小鼠膀胱癌研究)是生物可利用的。小鼠研究11206确定当使用经选择用于小鼠膀胱癌研究的剂量方案时，在作用位点(即，泌尿道)的环吡酮暴露(例如，尿液浓度)超过体外IC50值数倍。
研究证实，在可注射给予CPX-POM后，在作用部位(即血液，尿液)处获得足够浓度的活性药物(环吡酮)。小鼠BBN研究确定，100mg/kg和200mg/kg每日剂量的CPX-POM导致膀胱重量显著降低(肿瘤大小和体积的量度)以及向较低阶段肿瘤的迁移。研究还确定，在从CPX-POM处理的动物获得的膀胱组织中，Notch信号传导被抑制，并且下游Notch靶蛋白降低。分析CPX-POM处理的动物中的膀胱癌组织表明，环吡酮与作用位点(膀胱组织)处的靶标(例如Notch信号传导途径)结合。在膀胱癌组织中观察到的作用与在NMIBC和MIBC人细胞系体外产生的数据一致。研究还确定，每日注射给予CPX-POM产生的药理作用(例如肿瘤的大小和体积降低，较低的肿瘤阶段)与环吡酮是抗癌剂的假设一致，注射给予CPX-POM递送足够的活性药物至作用部位以产生抗癌应答。
本文所用的术语“烷基”或“脂肪族”是指通常但不必然含有1至约24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，辛基，癸基等，以及环烷基如环戊基，环己基等。通常但同样非必然地，本文的烷基含有1至约18个碳原子，或1至约12个碳原子。术语“低级烷基”意指具有1至6个碳原子的烷基。被称为“C1-C6烷基”或“低级烷基”的取代基含有1至3个碳原子，或这些取代基含有1或2个碳原子(即甲基和乙基)。“取代的烷基”是指取代有一个或多个取代基的烷基，术语“含杂原子的烷基”和“杂烷基”是指其中至少一个碳原子被杂原子替换的烷基，如下文进一步详细描述。如果没有另外说明，术语“烷基”和“低级烷基”分别包括直链，支链，环状，未取代的，取代的和/或含杂原子的烷基或低级烷基。
本文所用的术语“烯基”是指含有至少一个双键的2至约24个碳原子的直链，支链或环状烃基，例如乙烯基，正丙烯基，异丙烯基，正丁烯基，异丁烯基，辛烯基，癸烯基，十四碳烯基，十六碳烯基，二十碳烯基，二十四碳烯基等。通常但同样非必然地，烯基在本文中含有2至约18个碳原子，或2至12个碳原子。术语“低级烯基”表示2至6个碳原子的烯基，具体的术语“环烯基”表示环状烯基，或具有5至8个碳原子。术语“取代的烯基”是指取代有一个或多个取代基的烯基，术语“含杂原子的烯基”和“杂烯基”是指其中至少一个碳原子被杂原子替换的烯基。如果没有另外指出，术语“烯基”和“低级烯基”分别包括直链，支链，环状，未取代的，取代的和/或含杂原子的烯基和低级烯基。
本文所用的术语“炔基”是指含有至少一个叁键的2至24个碳原子的直链或支链烃基，例如乙炔基，正丙炔基等。通常但非必然地，炔基在本文中包含2至18个碳原子，或2至12个碳原子。术语“低级炔基”表示2至6个碳原子的炔基。术语“取代的炔基”是指取代有一个或多个取代基的炔基，术语“含杂原子的炔基”和“杂炔基”是指其中至少一个碳原子被杂原子替换的炔基。如果没有另外指出，术语“炔基”和“低级炔基”分别包括直链，支链，未取代的，取代的和/或含杂原子的炔基和低级炔基。
本文所用的术语“烷氧基”意指通过单个末端醚连接基结合的烷基；也就是说，“烷氧基”基团可以表示为-O-烷基，其中烷基如上所定义。“低级烷基氧基”表示含有1至6个碳原子的烷氧基，并且包括例如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，叔丁氧基等。被称为“C1-C6烷氧基”或“低级烷氧基”的取代基含有1至3个碳原子，或这些取代基含有1或2个碳原子(即甲氧基和乙氧基)。
本文所用的术语“芳基”，除非另有说明，是指芳族取代基，其含有单个芳族环或多个稠合在一起的直接连接或间接连接(使得不同的芳环与一个共同的基团如亚甲基或亚乙部分结合)的芳环。芳基的实例包含5至20个碳原子，或芳基包含5至14个碳原子。示例性芳基包含一个芳环或两个稠合或连接的芳环，例如苯基，萘基，联苯基，二苯基醚，二苯胺，二苯甲酮等。“取代的芳基”是指取代有一个或多个取代基的芳基部分，术语“含杂原子的芳基”和“杂芳基”是指其中至少一个碳原子被杂原子替代的芳基取代基，如下文将进一步详细描述。如果没有另外指出，术语“芳基”包括未取代的，取代的和/或含杂原子的芳族取代基。
本文所用的术语“芳基氧基”是指通过单个末端醚连接基结合的芳基，其中“芳基”如上所定义。芳基氧基可以表示为-O-芳基，其中芳基如上所定义。芳基氧基的实例含有5至20个碳原子，或芳基氧基含有5至14个碳原子。芳基氧基的实例包括但不限于苯氧基，邻-卤素-苯氧基，间-卤素-苯氧基，对-卤素-苯氧基，邻甲氧基-苯氧基，间甲氧基-苯氧基，对甲氧基-苯氧基，2,4-二甲氧基-苯氧基，3,4,5-三甲氧基-苯氧基等。
术语“烷芳基”是指具有烷基取代基的芳基，术语“芳烷基”是指具有芳基取代基的烷基，“芳基”和“烷基”如上所述。芳烷基的实例包含6至24个碳原子，或芳烷基含有6至16个碳原子。芳烷基的实例包括但不限于苄基，2-苯基-乙基，3-苯基-丙基，4-苯基-丁基，5-苯基-戊基，4-苯基环己基，4-苄基环己基，4-苯基环己基甲基，4-苄基环己基基甲基等。烷芳基基团包括例如对甲基苯基，2,4-二甲基苯基，对环己基苯基，2,7-二甲基萘基，7-环辛基萘基，3-乙基-环戊-1,4-二烯等。
术语“环状”是指可以是也可以不是取代的和/或含杂原子的脂环族或芳族取代基，并且可以是单环，双环或多环。
术语“卤素”和“卤代”在常规意义上用于指氯，溴和氟或碘取代基。
在“含杂原子的烷基”(也称为“杂烷基”)或“含杂原子的芳基”(也称为“杂芳基”)中的术语“含杂原子”是指其中一个或多个碳原子被除碳以外的原子(例如氮，氧，硫，磷或硅，通常为氮，氧或硫)替换的分子、连接基或取代基。类似地，术语“杂烷基”是指含杂原子的烷基取代基，术语“杂环”是指含杂原子的环状取代基，术语“杂芳基”和杂芳族基团“分别表示含有杂原子的“芳基”和“芳香族”取代基等。杂烷基的实例包括烷氧基芳基、烷基硫基取代的烷基，N-烷基化的氨基烷基等。杂芳基取代基的实例包括吡咯基，吡咯烷基，吡啶基，喹啉基，吲哚基，嘧啶基，咪唑基，1,2,4-三唑基，四唑基等，并且含杂原子的脂环族基团的实例是吡咯烷子基，吗啉代，哌嗪子基，哌啶子基等等。
术语“烃基”是指含有1至约30个碳原子，或1至约24个碳原子，或1至约18个碳原子，或约1至12个碳原子的单价烃基，包括直链，支链，环状，饱和和不饱和基团，例如烷基，烯基，芳基等。“取代的烃基”是指被一个或多个取代基取代的烃基，并且术语“含杂原子的烃基”是指至少一个碳原子被杂原子替换的烃基。除非另有说明，术语“烃基”应解释为包括取代的和/或含杂原子的烃基部分。
如在“取代的烷基”、“取代的芳基”等中的“取代的”如在上述一些定义中所提及的，是指在烷基、芳基或其它部分中，与碳(或其它)原子结合的至少一个氢原子被一个或多个非氢取代基替换。
另外，如果特定的基团允许的话，上述官能团可以进一步取代有一个或多个另外的官能团或取代有一个或多个烃基部分，例如上面具体列举的那些。类似地，上述烃基部分可以进一步取代有一个或多个官能团或另外的烃基部分，例如具体列举的那些。
当术语“取代的”出现在所列举的可能取代基组之前时，该术语适用于该组的每个成员。例如，“取代的烷基，烯基和芳基”这个短语被解释为“取代的烷基，取代的烯基和取代的芳基”。类似地，当术语“含杂原子”出现在所列举的可能含杂原子的基团组之前时，该术语适用于该组的每个成员。例如，短语“含杂原子的烷基，烯基和芳基”被解释为“含杂原子的烷基，含杂原子的烯基和含杂原子的芳基”。
本领域技术人员将理解，对于本文公开的这个和其它过程和方法，可以以不同的顺序来实现在过程和方法中执行的功能。此外，概述的步骤和操作仅作为示例提供，并且一些步骤和操作可以是任选的，组合成更少的步骤和操作，或扩展到额外的步骤和操作，而不会降低所公开的实施方案的本质。
本公开不限于在本申请中描述的具体实施方案，其旨在对各方面进行说明。在不背离其精神和范围的情况下，可以进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员是显而易见的。通过之前的描述，除了本文列举的那些之外，本公开范围内的功能上等同的方法和设备对于本领域技术人员是显而易见的。这样的修改和变化旨在落在所附权利要求的范围内。本申请仅由所附权利要求以及这种权利要求所赋予的等同形式的全部范围来限制。应当理解，本公开不限于特定方法，反应物，化合物组合物或生物系统，它们当然可以发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不意在进行限制。
关于在本文中使用的基本上任何复数和/或单数术语，本技术领域的技术人员可以根据上下文和/或应用的需要，从复数转换为单数形式和/或从单数转换为复数形式。为了清楚起见，可以在本文中明确阐述各种单数/复数排列。
本领域技术人员将会理解，一般来说，本文使用的术语，特别是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应当被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果一个权利要求意图保护具体数值，则这样的意图应明确写在权利要求中，如果不写则没有该意图。例如，为了帮助理解，所附权利要求可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来描述权利要求。然而，这些短语的使用不应被解释为意味着在权利要求中引入不定冠词“一个”或“一种”就将含有该引入内容的任何具体权利要求限制为仅含有一个这样描述的实施方案，即使当同一权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词如“一个”或“一种”(例如，“一个”和/或“一种”应该解释为“至少一个”或“一个或多个”)；对于使用用于引入声明陈述的定冠词也是如此。此外，即使权利要求明确地叙述了具体数值，本领域技术人员将认识到，这种叙述应该被解释为是指至少一个所述数值(例如，“两个…”的简单描述，没有其他修饰语，指至少两个…，或两个或更多个…)。此外，在使用类似于“A，B和C等中的至少一个”的惯用语的情况下，通常这种语法结构意思是本领域技术人员会理解所述惯用语(例如，“具有A，B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起的系统，和/或A，B和C一起等)。在使用类似于“A，B和C等中的至少一个”的惯用语的情况下，通常这种语法结构意思是本领域技术人员会理解所述惯用语(例如，“具有A，B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起的系统，和/或A，B和C一起等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求还是附图中，呈现两个或多个可供选择术语的任何连词和/或短语应被理解为考虑了以下可能性：包括一个所述术语，任何一个所述术语，或两个术语。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，在本公开的特征或方面根据马库什基团描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此根据马库什基团成员的任何单独成员或亚组来描述。
如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，例如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被认为是充分的描述，并使相同的范围被分解成至少相等的一半，三份、四份、五份、十份等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地分解成下三分之一，中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“高达”，“至少”等包括所述的数字，并且指的是可以随后分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的基团是指具有1，2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1，2，3，4或5个细胞的组等等。
本申请涉及如下方面：
1.治疗膀胱癌的方法，所述方法包括
提供药物组合物，其包含环吡酮或环吡酮胺或具有式1的结构的环吡酮-POM前药或其立体异构体或其药学上可接受的盐；和
将所述药物组合物给予患有膀胱癌的受试者,
其中:
R1-R12各自独立地包括以下中的一个或多个：氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
R13-R14各自独立地包括以下中的一个或多个：阳离子、钠离子、氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
n为0-20取代的或未取代的；和
m为0、1或2。
2.如1的方法，所述化合物由式2的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
3.如1的方法，所述化合物由式3的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
4.如1的方法，所述化合物由式4的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
5.如1的方法，所述化合物由式5的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
6.如1的方法，所述化合物由式6的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
7.如1的方法，所述化合物由式7的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
8.如1的方法，所述化合物由式8的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
9.如1的方法，所述化合物由式9的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
10.如1的方法，所述化合物由式10、11、12或13的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
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11.如1的方法，其中所述药物组合物包含环吡酮。
12.如1的方法，其中所述药物组合物包含环吡酮胺。
13.如1的方法，其中所述药物组合物包含治疗有效量的所述化合物和药学上可接受的载体。
14.如1的方法，其中所述组合物以有效量给予，从而提供治疗有效量的6-环己基-1-羟基-4-甲基吡啶-2(1H)-酮。
15.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制NOTCH途径。
16.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制TGF-β途径。
17.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制STAT3途径。
18.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制膀胱癌细胞的生长。
19.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制DNA修复。
20.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制核糖核苷酸还原酶。
21.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制膀胱癌干细胞的生长。
22.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制S-期膀胱癌细胞的生长。
23.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制膀胱癌球状体的形成。
24.如1的方法，其中所述治疗有效量足以抑制膀胱癌细胞增殖。
25.如14的方法，其中
所述化合物由式10、11、12或13的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
26.如1的方法，其中所述膀胱癌为NMIBC(非肌层浸润性膀胱癌)。
27.如1的方法，其中所述膀胱癌为MIBC(肌层浸润性膀胱癌)。
28.治疗上泌尿道中的膀胱癌的方法，所述方法包括:
提供药物组合物，其包含环吡酮,环吡酮胺或由式1的结构表示的环吡酮前药或其立体异构体或其药学上可接受的盐；和
将所述药物组合物给予患有在上泌尿道中的膀胱癌的受试者,
其中:
R1-R12各自独立地包括以下中的一个或多个：氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
R13-R14各自独立地包括以下中的一个或多个：阳离子、钠离子、氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
n为0-20取代的或未取代的；和
m为0、1或2。
29.化合物制备用于治疗膀胱癌中的药物的用途，所述化合物包括环吡酮,环吡酮胺或环吡酮前药，所述环吡酮前药具有式1的结构或其立体异构体或其药学上可接受的盐；
其中:
R1-R12各自独立地包括以下中的一个或多个：氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
R13-R14各自独立地包括以下中的一个或多个：阳离子、钠离子、氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
n为0-20取代的或未取代的；和
m为0、1或2。
30.如29的用途，其中所述膀胱癌为NMIBC(非肌层浸润性膀胱癌)。
31.如29的用途，其中所述膀胱癌为MIBC(肌层浸润性膀胱癌)。
32.用于治疗膀胱癌的组合物，所述组合物包含:
治疗有效量的用于治疗膀胱癌的环吡酮,环吡酮胺或由式1的结构表示的环吡酮前药或其立体异构体或其药学上可接受的盐；
其中:
R1-R12各自独立地包括以下中的一个或多个：氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
R13-R14各自独立地包括以下中的一个或多个：阳离子、钠离子、氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
n为0-20取代的或未取代的；和
m为0、1或2。
33.如32的组合物，其中所述膀胱癌为NMIBC(非肌层浸润性膀胱癌)。
34.如32的组合物，其中所述膀胱癌为MIBC(肌层浸润性膀胱癌)。
35.如32的组合物，其中n为1-4和m为1。
36.如32的组合物，其中n为1和m为1。
37.如32的组合物，其中所述环吡酮前药由式10、11、12或13的结构表示或为其立体异构体或药学上可接受的盐
从上述可以理解，为了说明的目的，本文中已经描述了本公开的各种实施例，并且在不脱离本公开的范围和精神的情况下可以进行各种修改。因此，本文所公开的各种实施例并不旨在是限制性的，其真实范围和精神由所附权利要求书表示。所引用的所有参考文献或并入本文的参考文献通过具体参考文献的全部内容并入本文。
本专利申请通过参考并入:2013年10月21日提交的美国专利申请14/059,287，其是2011年12月2日提交的美国专利申请13/310,087的分案，其要求2010年12月2日提交的美国临时申请61/419,218的权益。

Claims (10)

1.治疗膀胱癌的方法，所述方法包括
提供药物组合物，其包含环吡酮或环吡酮胺或具有式1的结构的环吡酮-POM前药或其立体异构体或其药学上可接受的盐；和
将所述药物组合物给予患有膀胱癌的受试者,
其中:
R1-R12各自独立地包括以下中的一个或多个：氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
R13-R14各自独立地包括以下中的一个或多个：阳离子、钠离子、氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂肪族基团、支链脂肪族基团、环状脂肪族基团、取代的脂肪族基团、未取代的脂肪族基团、饱和的脂肪族基团、不饱和的脂肪族基团、芳族基团、多芳族基团、取代的芳族基团、杂芳族基团、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂肪族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、取代的或未取代的或它们的组合；
n为0-20取代的或未取代的；和
m为0、1或2。
2.权利要求1的方法，所述化合物由式2的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
3.权利要求1的方法，所述化合物由式3的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
4.权利要求1的方法，所述化合物由式4的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
5.权利要求1的方法，所述化合物由式5的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
6.权利要求1的方法，所述化合物由式6的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
7.权利要求1的方法，所述化合物由式7的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
8.权利要求1的方法，所述化合物由式8的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
9.权利要求1的方法，所述化合物由式9的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
10.权利要求1的方法，所述化合物由式10、11、12或13的结构表示或为其立体异构体或其药学上可接受的盐
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