CN116687905A - 一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法与应用 - Google Patents

一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法与应用 Download PDF

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陈冬梅
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Abstract

本发明公开了一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法与应用,属于兽药制剂技术领域。本发明公开的天然活性成分复方纳米凝胶剂由天然活性成分、凝胶基质和附加剂组成,配方合理,工艺简单,性质稳定,使用方便,安全长效。该天然活性成分复方纳米凝胶剂包含两种协同增效的天然活性成分,可抑制金黄色葡萄球菌、链球菌等子宫内膜炎致病菌增殖,降低炎症部位促炎细胞因子表达;同时,其具有一定缓释能力,缓慢释放易被细胞摄取的天然活性成分纳米粒,可实现药物在给药部位的长时间停留和高效吸收,从而增强作用时间,降低给药频率,提高疗效。

Description

一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法与应用
技术领域
本发明属于兽药制剂技术领域,尤其涉及一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法与应用。
背景技术
繁殖是动物的基本特征,对物种生存至关重要。子宫细菌感染性疾病可导致动物繁殖性能下降、不孕不育和遗传丧失等诸多问题,严重降低动物生殖性能并增加养殖成本,造成养殖业巨大经济损失。如何实现子宫细菌感染性疾病的高效防控,成为提高养殖业经济效益的重要手段。
研究表明,病原体微生物会诱导子宫内膜细胞异常表达多种趋化因子及黏附因子,从而降低子宫内膜容受性,导致不孕及流产。同时,免疫系统被病原体激活,多种炎性因子的产生可抑制促性腺激素合成、分泌。炎症反应中吞噬细胞内线粒体所产生的大量活性氧(ROS),能直接或间接激活多条炎症信号通路,加剧炎症反应,影响卵细胞成熟、胚胎着床、胎儿发育和子宫收缩等过程。此外,持续炎症还将导致黏膜溃疡和糜烂,甚至造成宫腔粘连或子宫息肉,严重损伤机体繁殖性能。因此,有效的抗菌与消炎是治疗子宫细菌感染性疾病的重要策略。目前,具有抗炎能力的激素同抗生素联用成为子宫细菌感染性疾病的主流治疗方式。但这种方式可诱导细菌产生耐药性,造成抗生素残留,影响动物产品质量。同时,传统激素类药物还易引起代谢紊乱、并发症、免疫抑制和食品安全等问题。鉴于此,寻找细菌耐药性低且安全高效的新型替代药物显得尤为重要和迫切。
为促进子宫细菌感染性疾病的防治发展,研究者拟通过将具有协同抗菌抗炎能力的天然活性成分结合,并基于自组装纳米和凝胶制剂技术研制出使用方便、安全高效、药效持久的天然活性成分纳米凝胶剂。不过,多数天然活性成分水溶性极差,很大程度上限制了其在给药部位的吸收,生物利用度并不理想。自组装纳米是促进药物跨膜转运的潜在递送系统。
在治疗子宫细菌感染性疾病的常见剂型中,口服剂生物利用度差,注射剂靶向性差且给药不便,栓剂载药量低,灌注剂则易沿阴道流出。同上述制剂类型相比,凝胶剂具有较好的组织黏附性及缓释性能,可实现药物在给药部位的高浓度、长时间停留。例如,壳聚糖类凝胶结构中的邻苯二酚基团或氨基可与组织发生相互作用,使得凝胶黏附于组织表面。直炜炜等人将负载盐酸小檗碱的温敏凝胶置于37℃环境下,12h时其释放度在60%左右,而游离盐酸小檗碱释放度在2h时便已接近100%。此外,良好的生物相容性、生物可降解性以及适于阴道给药等优点也为凝胶剂的安全应用提供保障。因此,作为一种高效递送策略,凝胶剂具有较好的子宫递药前景。
尽管天然活性成分在各领域内的研究正飞速发展,但在子宫细菌感染性疾病治疗领域内其相关研究并未大规模展开,这表明适用于子宫给药的天然活性成分凝胶剂有待进一步研发及使用。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题,本发明提出了一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法与应用。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,所述兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂由天然活性成分、凝胶基质和附加剂组成;所述天然活性成分由第一天然活性成分和第二天然活性成分经超声处理制成。
作为进一步优选方案,所述天然活性成分的浓度为3-4wt%,所述凝胶基质的浓度为0.6-7.0wt%所述附加剂的浓度为0.03-15wt%。
作为进一步优选方案,所述第一天然活性成分和第二天然活性成分的质量比为(1-2)∶1。
作为进一步优选方案,所述第一天然活性成分为大黄酸、月桂酸甘油酯或紫檀芪,更优选为月桂酸甘油酯;所述第二天然活性成分为厚朴酚或和厚朴酚,更优选为和厚朴酚。
作为进一步优选方案,所述凝胶基质为卡波姆940、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和壳聚糖中的至少一种,更优选为卡波姆940。
作为进一步优选方案,所述附加剂为丙二醇和尼泊金乙酯中的至少一种,附加剂还包括三乙醇胺,用来调整pH。
本发明还提供一种所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法,包括以下步骤:
将天然活性成分加入无水乙醇中,经过水热法制成天然活性成分纳米混悬液,然后将凝胶基质充分溶胀后与附加剂加入纳米混悬液中,搅拌,调节pH至6.0-7.5,即得到兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂。
本发明还提供一种所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂在制备治疗子宫细菌感染药物中的应用。
本发明还提供一种所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂在制备缓解子宫细菌感染性炎症药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和技术效果:
本发明制备的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,创新性地将具有联合抑菌和抗炎效果的天然活性成分结合,形成了利于机体吸收的小粒径纳米粒。其中,月桂酸甘油酯能破坏细菌细胞膜和细胞壁结构,抑制MAPK和NF-κB信号通路活化;而和厚朴酚则可使活性氧累积于细菌细胞线粒体中以杀伤细菌,同时抑制Klf4、p38和ERK1/2等炎症信号通路。二者共同作用导致细菌胞内稳态失衡,并减少了促炎细胞因子表达,最终实现高效抑菌抗炎功效,对子宫细菌感染性疾病展现出良好治疗能力。其一方面规避了目前抗生素结合激素疗法导致的耐药性频发、抗生素残留、代谢紊乱、并发症、免疫抑制和食品安全等问题;另一方面通过形成小粒径纳米粒,提高了天然活性成分跨子宫内膜黏附转运的能力,并借助凝胶剂的缓释性能延长了天然活性成分在子宫内的停留时间,最终提高天然活性成分的利用率。同时,该凝胶剂也展示出了较好的子宫内细菌清除效果以及炎症抑制能力,能高效缓解由感染性炎症带来的组织损伤。此外,该凝胶剂制备工艺简单,辅料廉价易得,性质稳定,使用便捷,可为子宫细菌感染性疾病的治疗提供安全有效的新选择,具有较好的开发前景。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1为实施例1天然活性成分的协同抗炎活性检测结果;
图2为实施例2天然活性成分的扫描电镜图和透射电镜图,其中A为扫描电镜图,B为透射电镜图;
图3为试验例2兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的实物图;
图4为试验例3兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂与天然活性成分的体外释放曲线,其中A为月桂酸甘油酯体外释放曲线,B为和厚朴酚体外释放曲线;
图5为治疗第4天和第8天时各组大鼠子宫剖检形态;
图6为治疗后各组大鼠子宫组织载菌量,其中A为治疗第4天,B为治疗第8天;
图7为治疗后各组大鼠子宫组织炎性因子表达量,其中A、B、C和D为治疗第4天,E、F、G和H为治疗第8天;
图8为治疗第8天时各组大鼠子宫组织的组织病理学观察结果,其中A为空白对照组,B为感染对照组,C为原料药物理混合组,D为兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。本发明以下实施例所用原料均为市售所得。其中,和厚朴酚、羟丙基甲基纤维素、卡波姆940和三乙醇胺购买于麦克林试剂公司;厚朴酚、大黄酸、月桂酸甘油酯、紫檀芪购买于上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇、丙二醇、羧甲基纤维素钠、壳聚糖购买于国药集团化学试剂有限公司;尼泊金乙酯购买于阿拉丁试剂有限公司。
以下实施例作为本发明技术方案的进一步说明。
为促进子宫细菌感染性疾病的防治发展,本发明通过将具有协同抗菌抗炎能力的天然活性成分结合,并基于自组装纳米和凝胶制剂技术研制出使用方便、安全高效、药效持久的天然活性成分纳米凝胶剂。天然活性成分不易引起并发症,无刺激性,无交叉耐药性,几乎无残留。它们可通过破坏细菌细胞膜和细胞壁结构、抑制耐药基因表达、提高胞内活性氧浓度和抑制细菌生物被膜等方式杀灭细菌。同时,还能阻止NLRP3、NLRC4和AIM2炎症小体活化以规避细胞焦亡,抑制MAPK、NF-κB、Klf4、p38、ERK1/2、JNK和PI3K/Akt等多条信号通路活化,避免IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子大量释放。以天然活性成分代替抗生素和激素治疗子宫细菌感染性疾病,可在有效发挥协同抗菌消炎作用的同时,减缓细菌耐药性的产生,降低代谢紊乱及并发症等风险。对于多数天然活性成分水溶性极差导致很大程度上限制了其在给药部位的跨膜转运和吸收的问题,本发明通过将其“改造”成自组装纳米粒来提高有效利用率。研究表明,药物在纳米级别时,粒径越小,溶出速率越高,也更易被细胞摄取。例如,100nm左右的脂质纳米粒体外细胞吸收率便低于400nm左右的脂质纳米粒。克拉霉素纳米晶体通过减小粒径,有效促进了其在单层Caco-2细胞内的渗透及摄取。
具体技术方案如下:
本发明提供一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,所述兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂由天然活性成分、凝胶基质和附加剂组成。
所述天然活性成分由第一天然活性成分和第二天然活性成分经超声处理制成。具体制备方法为:(1)向无水乙醇中加入第一天然活性成分和第二天然活性成分,超声10-15min促溶,即得到天然活性成分。
在本发明一些优选实施例中,所述天然活性成分的浓度为3-4wt%,所述凝胶基质的浓度为0.6-7.0wt%,所述附加剂的浓度为0.03-15wt%。
在本发明一些优选实施例中,所述第一天然活性成分和第二天然活性成分的质量比为(1-2)∶1。所述第一天然活性成分为大黄酸、月桂酸甘油酯或紫檀芪,更优选为月桂酸甘油酯;所述第二天然活性成分为厚朴酚或和厚朴酚,更优选为和厚朴酚。
在本发明一些优选实施例中,所述凝胶基质为卡波姆940、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和壳聚糖中的至少一种,更优选为卡波姆940,卡波姆940的质量浓度为0.8wt%。所述所述附加剂为丙二醇和尼泊金乙酯中的至少一种,附加剂还包括三乙醇胺,用来调整pH。丙二醇使用时作为保湿剂,尼泊金乙酯使用作为防腐剂,二者可分别与凝胶基质和天然活性成分混合,也可同时与凝胶基质和天然活性成分混合。丙二醇的添加量为兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的15%;尼泊金乙酯的添加量为兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的0.03%。
本发明还提供一种所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法,包括以下步骤:
将天然活性成分加入无水乙醇中,经过水热法制成天然活性成分纳米混悬液,然后将凝胶基质充分溶胀后与附加剂加入纳米混悬液中,搅拌,调节pH至6.0-7.5,即得到兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂。
具体制备方法如下:
1)将第一天然活性成分和第二天然活性成分混合于无水乙醇中,在温度80℃、转速2400r/min的水热条件下反应80-100min,得到纳米混悬液;
2)将尼泊金乙酯加入丙二醇,超声溶解,得溶液A;
3)将凝胶基质溶于水中,充分溶胀后加入丙二醇,然后与溶液A加入纳米混悬液中,在转速800-1200r/min下搅拌3-5h,得到凝胶A;
4)在凝胶A中加入三乙醇胺,直至pH调节至6.0-7.5之间,即得到兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂。
本发明还提供一种所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂在制备治疗子宫细菌感染药物中的应用。
本发明还提供一种所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂在制备缓解子宫细菌感染性炎症药物中的应用。
本发明利用具有联合抑菌消炎功能天然活性成分制备出对子宫细菌感染性疾病治疗效果良好的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂。利用凝胶制剂技术构建高效的纳米药物缓释系统,促进天然活性成分凝胶制剂的开发,推动天然活性成分的临床应用。
以下实施例对本发明技术方案进行具体说明。
实施例1天然活性成分的体外联合抑菌及协同抗炎作用
1.1天然活性成分的体外联合抑菌试验
各天然活性成分见表1,采用分级抑菌浓度(FIC)判定两种天然活性成分间关系,FIC≤0.5、0.5<FIC≤1、1<FIC≤2、FIC>2时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用。
表1天然活性成分
具体步骤如下:
(1)将每种天然活性成分用LB肉汤培养基倍比稀释,取7个稀释浓度,分别为1024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL和16μg/mL;
(2)两种对应的天然活性成分各取50μL分别排列在96孔板的行与列上,在各孔中加入100μL稀释菌液,使细菌最终接种量为5×105CFU/mL,过夜培养。
(3)计算天然活性成分的FIC,FIC=A(联合使用时第一天然活性成分的最低有效浓度)/B(第一天然活性成分单独使用时的MIC)+C(联合使用时第二天然活性成分的最低有效浓度)/D(第二天然活性成分单独使用时的MIC),(MIC在医学上是指抑制细菌可见生长的最低药物浓度)。
1.2各天然活性成分FIC检测结果
表2实施例1中各天然活性成分对金黄色葡萄球菌的FIC
表3实施例1中各天然活性成分对链球菌的FIC
从表2、表3可看出,月桂酸甘油酯与厚朴酚、月桂酸甘油酯与和厚朴酚联用时对金黄色葡萄球菌和链球菌的FIC最低,即月桂酸甘油酯与和厚朴酚联合抑制效力相加作用最强。
1.3天然活性成分的协同抗炎试验
以月桂酸甘油酯与厚朴酚、月桂酸甘油酯与和厚朴酚作为天然活性成分,通过体外抗炎试验考察二者体外抗炎能力。
具体步骤如下:
(1)RAW264.7细胞孵育24h,弃上清,加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,吹扫并混合均匀,按2mL/孔接种至6孔板,培养24h。
(2)设正常组、LPS(脂多糖)组、单天然活性成分组、联合组。其中,正常组用2mL的PBS培养24h;LPS组用2mL的LPS溶液(0.1μg/mL)培养2h,后用2mL PBS代替,孵育22h;单天然活性成分组和联合组中预先加入2mL LPS溶液(0.1μg/mL),孵育2h,后用2mL含不同浓度天然活性成分的PBS代替,孵育22h。
(3)分裂细胞,离心取上清液,按照操作说明使用相应的ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的浓度。
1.4天然活性成分的协同抗炎能力检测结果
图1为天然活性成分的协同抗炎能力检测结果。可以看出,同脂多糖组相比,所有试验组4种促炎细胞因子表达量均有所下降。同时,月桂酸甘油酯、厚朴酚、和厚朴酚自身均具有一定的抗炎作用,当它们彼此组合后抗炎能力进一步加强。两个联合组相比,月桂酸甘油酯与和厚朴酚复方对4种促炎细胞因子表达量的抑制能力更强,即协同抗炎能力更好。
根据联合抑菌以及协同抗炎结果,最终确认天然活性成分选择月桂酸甘油酯与和厚朴酚联合。
实施例2天然活性成分纳米混悬液的制备及PDI、粒径检测
天然活性成分纳米混悬液的制备条件见表4。
表4天然活性成分纳米混悬液的制备条件
具体制备步骤如下:
(1)向10mL无水乙醇中加入330.0mg和厚朴酚和660.0mg月桂酸甘油酯,超声10min促溶,得溶液A。
(2)将溶液A在表4所示条件下搅拌90min,期间陆续加入15mL蒸馏水,最后30min时,打开瓶塞以挥发乙醇,得到不同条件下制备的天然活性成分纳米混悬液。
将制备的天然活性成分纳米混悬液依次编号1-6,每组取1mL样品,使用蒸馏水稀释10倍,保存于10mL离心管备用。在25℃条件下,应用马尔文纳米激光粒度仪ZS90进行多分散系数(PDI)和粒径检测。
2.2天然活性成分纳米混悬液的PDI、粒径检测结果
实施例2所制备的天然活性成分纳米混悬液PDI、粒径检测结果见表5。
表5实施例2中天然活性成分纳米混悬液的PDI及粒径
由表5中第1、2、3组检测结果可知,转速固定为2400r/min时,温度越高,纳米粒粒径越小。而由表5中第4、5、6组检测结果可知,当温度固定为80℃时,随着转速增加,纳米粒的PDI降低。该结果表明转速越大,所形成的纳米粒大小更均匀。此外,尽管1600r/min组纳米粒PDI低于2400r/min组,但二者相差不大,且1600r/min组纳米粒粒径要大于2400r/min组纳米粒(组别2和组别6是两批试验,数据的差异是由于试验中客观因素所导致的数据波动,该波动属于合理范围,后续试验也存在相同问题,不再赘述)。
因此,选择以80℃、2400r/min作为天然活性成分纳米混悬液的制备的最优条件。
实施例3凝胶基质的筛选及粘度测定
3.1不同空白凝胶剂的制备
预筛凝胶基质种类及浓度见表6,以此制备不同种类及浓度的空白凝胶剂。
表6预筛凝胶基质种类及浓度
具体制备步骤如下:每个浓度的相关试验分别如(1)-(12)
A、(1)称取125.0mg羧甲基纤维素钠,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶A;
(2)称取250.0mg羧甲基纤维素钠,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶B;
(3)称取375.0mg羧甲基纤维素钠,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶C;
(4)称取625.0mg羟丙基甲基纤维素,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶D;
(5)称取750.0mg羟丙基甲基纤维素,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶E;
(6)称取875.0mg羟丙基甲基纤维素,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶F;
(7)称取125.0mg壳聚糖,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶G;
(8)称取250.0mg壳聚糖,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶H;
(9)称取375.0mg壳聚糖,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶I;
(10)称取75.0mg卡波姆940,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶J;
(11)称取100.0mg卡波姆940,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶K;
(12)称取125.0mg卡波姆940,加入10mL蒸馏水和2.5mL丙二醇,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶L;
B、向步骤A得到的凝胶A-L中加入一定量三乙醇胺,调节凝胶pH至6.0-7.5之间。
3.2不同空白凝胶剂的粘度测定结果
由不同凝胶基质制备的空白凝胶剂的粘度测定结果见表7。
表7实施例3中不同空白凝胶剂的粘度
从表7可看出,相比其它凝胶基质,卡波姆940所制备的凝胶剂在低浓度下便具有较高黏度。其余3组凝胶基质虽浓度均高于卡波姆940组,但所制备的凝胶剂最大黏度远低于0.6wt%卡波姆940所制备的凝胶剂。卡波姆类凝胶剂在pH=5.0-11.0范围内稳定性好,对皮肤及黏膜无刺激,在高温条件下不分解,可经受高压蒸汽灭菌,符合凝胶剂实际生产需求。
实施例4凝胶基质与保湿剂比例的筛选及粘度测定
4.1不同比例天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备
以卡波姆940为凝胶基质,以丙二醇为保湿剂,二者预筛比例见表8,以此制备不同比例天然活性成分纳米凝胶剂。
表8卡波姆940和丙二醇预筛比例
具体制备步骤如下:
S1、向10mL无水乙醇中加入330.0mg和厚朴酚和660.0mg月桂酸甘油酯,超声10min促溶。
S2、在温度80℃,转速2400r/min的条件下搅拌90min,期间陆续加入15mL蒸馏水,在最后30min时,打开瓶塞以挥发乙醇,最终得天然活性成分纳米混悬液A。
S3、(1)称取180.0mg卡波姆940,加入1.5mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶A;
(2)称取180.0mg卡波姆940,加入3mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶B;
(3)称取180.0mg卡波姆940,加入4.5mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶C;
(4)称取240.0mg卡波姆940,加入1.5mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶D;
(5)称取240.0mg卡波姆940,加入3mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶E;
(6)取240.0mg卡波姆940,加入4.5mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶F;
(7)称取300.0mg卡波姆940,加入1.5mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶G;
(8)称取300.0mg卡波姆940,加入3mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶H;
(9)取300.0mg卡波姆940,加入4.5mL丙二醇,用蒸馏水补充体积至15mL,1000r/min搅拌过夜以充分溶胀,得凝胶I;
S3、向S2中充分溶胀后的凝胶A-I中加入天然活性成分纳米混悬液A,以1000r/min转速充分搅拌5h,而后缓慢滴加三乙醇胺,调节凝胶pH至6.0-7.5之间。
粘度测定步骤:
(1)夹具选择40.0mm铝平板,夹具间隙设定为1000μm。模式选择“峰值保持”,温度设置为25℃,过程持续时间为300sec,剪切速率为0.63rad/s,采集频率为1sec采集一个点。
(2)取一定量凝胶剂,置于流变仪下夹具中心,夹具间隙调整至1050μm,开始测定。
4.2不同比例天然活性成分复方纳米凝胶剂的粘度测定及结果
不同卡波姆940和丙二醇比例制备的天然活性成分复方纳米凝胶剂的粘度测定结果见表9。
表9实施例4中天然活性成分复方纳米凝胶剂的粘度
由表9可知,随着卡波姆940浓度加大,天然活性成分复方纳米凝胶剂黏度提升。当卡波姆940浓度为0.6wt%时,天然活性成分复方纳米凝胶剂黏度受丙二醇浓度影响较大;而当卡波姆940浓度为0.8wt%或1.0wt%时,天然活性成分纳米凝胶剂黏度受丙二醇浓度影响较小。此外,在凝胶剂制备过程中,卡波姆940浓度为1.0wt%时凝胶基质搅拌较为困难,天然活性成分纳米混悬液加入后难以混匀。
因此,选择0.8wt%卡波姆940作为天然活性成分复方纳米凝胶剂的凝胶用量,15%丙二醇作为天然活性成分复方纳米凝胶剂的保湿剂用量。
实施例5防腐剂用量筛选
5.1含不同浓度防腐剂的天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备
以尼泊金乙酯为防腐剂,制备含防腐剂浓度分别为0wt%、0.003wt%、0.03wt%、0.3wt%的天然活性成分复方纳米凝胶剂,并进行抑菌效力检查。不同防腐剂浓度对应天然活性成分复方纳米凝胶剂中尼泊金乙酯加入量见表10。
表10不同防腐剂浓度对应月桂酸甘油酯/和厚朴酚凝胶剂中尼泊金乙酯加入量
制备步骤:
(1)向10mL无水乙醇中加入330.0mg和厚朴酚和660.0mg月桂酸甘油酯,超声10min促溶。
(2)在温度80℃,转速2400r/min的条件下搅拌90min,期间陆续加入15mL蒸馏水,在最后30min时,打开瓶塞以挥发乙醇,最终得天然活性成分纳米混悬液。
(3)按上述表10的用量将尼泊金乙酯加入0.5mL丙二醇,超声溶解,分别得溶液A、溶液B、溶液C、溶液D。
(4)将0.24g卡波姆940溶于水溶液中,充分溶胀后加入天然活性成分纳米混悬液中,并分别加入溶液A-D,1000r/min充分搅拌5h。而后缓慢滴加三乙醇胺,调节凝胶pH至6.0-7.5之间。
5.2抑菌效力检测结果
对含防腐剂浓度分别为0wt%、0.003wt%、0.03wt%、0.3wt%的月桂酸甘油酯/和厚朴酚凝胶剂进行抑菌效力检查,结果见表11。
表11实施例5中月桂酸甘油酯/和厚朴酚凝胶剂的抑菌效力
从表11可知,当尼泊金乙酯浓度为0.03%时,月桂酸甘油酯/和厚朴酚凝胶剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等检测菌的抑制效果已达到子宫制剂抑菌效力判断标准中的“A”级别。即同加入量相比,细菌lg(即括号里的值)值6h下降2以上,24h下降3以上,真菌lg值7d下降2以上。
最终,选择0.03%尼泊金乙酯作为天然活性成分复方纳米凝胶剂的防腐剂用量。
试验例1天然活性成分纳米混悬液的制备及表征
1.1天然活性成分纳米混悬液的制备
(1)向10mL无水乙醇中加入330.0mg和厚朴酚和660.0mg月桂酸甘油酯,超声10min促溶。
(2)80℃、2400r/min条件下搅拌90min,期间陆续加入15mL蒸馏水,在最后30min时,打开瓶塞以挥发乙醇。
1.2天然活性成分纳米混悬液的表征
1.2.1材料与方法
(1)药物:天然活性成分纳米混悬液
(2)仪器:扫描电子显微镜(SEM),透射电子显微镜(TEM)。
(4)试验方法:
SEM观察:将天然活性成分纳米混悬液稀释10倍后,滴1滴于平滑、干净的锡箔纸上,晾干。将晾干的锡箔纸剪成小块,贴于载物台上,进行喷金处理。喷金结束后,将载物台置于SEM内进行观察。
TEM观察:将天然活性成分纳米混悬液稀释10倍后,用铜网捞取少量样品,晾干。将晾干铜网置于TEM内进行观察。
1.2.2结果
天然活性成分纳米混悬液中纳米粒的形状、大小和表面形态等形态特征如图2所示,PDI及粒径检测结果如表12所示。
表12试验例1中月天然活性成分纳米粒的PDI及粒径
从图2可以看到,本发明制备的月桂酸甘油酯/和厚朴酚纳米粒在电镜下呈不规则球状,表面粗糙不平,粒径大小在150-250nm之间。
从表12可以看到,天然活性成分纳米粒的平均粒径为187.269±11.439nm,PDI为0.449±0.093。该结果表明,本发明制备的天然活性成分纳米粒粒径偏小,大小较为均一。
试验例2兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备及表征
2.1兽用天然活性成分纳米凝胶剂的制备
(1)向10mL无水乙醇中加入330.0mg和厚朴酚和660.0mg月桂酸甘油酯,超声10min促溶。
(2)80℃、2400r/min条件下搅拌90min,期间陆续加入15mL蒸馏水,在最后30min时,打开瓶塞以挥发乙醇,得天然活性成分纳米混悬液。
(3)称取9.0mg尼泊金乙酯,加入0.5mL丙二醇,超声溶解,得溶液A。
(4)将0.24g卡波姆940溶于10.5mL蒸馏水和4mL丙二醇的混合溶液中,以1000r/min转速搅拌过夜以充分溶胀。充分溶胀后加入天然活性成分纳米混悬液和溶液A,以1000r/min转速充分搅拌5h,得凝胶A。
(5)向凝胶A缓慢滴加三乙醇胺并搅拌均匀,直至凝胶pH调节至6.0-7.5之间。
2.2表征结果
兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的外观性状见图3,pH、粘度、粒径检测结果见表13。
表13试验例2中兽用天然活性成分纳米凝胶剂的pH、粘度、粒径
本发明制备的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂呈乳白色不透明的黏稠半固体,质地均一、细腻,无相分离,黏稠度适宜,延展性好。其pH为6.60±0.15,黏度为32.123±0.907Pa·s,所含天然活性成分纳米粒粒径为193.263±30.631nm。
试验例3兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的体外累积释放
3.1材料与方法
(1)药物:试验例2制备的天然活性成分纳米混悬液和兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂。
(2)仪器:溶出仪、气相色谱仪。
(3)试验方法:
将4.0g纳米凝胶剂(或2mL天然活性成分纳米混悬液)置于透析袋内,密封后放入装有250mL释放介质(pH=6.0)的溶出杯中,在温度为37±0.5℃、转速为50r/min的条件下进行体外释放试验。分别于0.5h、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、60h、72h取1mL透析液,同时补加1mL缓冲溶液。所取透析液氮吹后用1mL乙腈复溶,过0.22μm针式滤膜,转入进样瓶,进行气相色谱分析,根据结果计算不同时间点纳米凝胶剂和天然活性成分纳米混悬液的释放量。
3.2结果
兽用天然活性成分纳米凝胶剂与天然活性成分复方纳米混悬液在模拟子宫环境中(pH=6.0)的体外累积释放试验结果见表14和图4。
表14不同制剂在模拟子宫环境下的体外释放
注:表中空白处表示已经达到平衡点,后续释放量几乎不变。
从表14和图4可以看出,在模拟子宫环境中(pH=6.0),天然活性成分纳米混悬液的累积释放较快,在24h时释放超过90%,表明在模拟子宫环境中单纯纳米颗粒不具备明显缓释性能。而本发明制备的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂在模拟子宫环境中缓释时间超过40h,并且24h仅释放了65%,表明兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂具有较好缓释能力。这种释药特点无疑将有利于更多天然活性成分纳米颗粒在子宫病灶处被吸收,进而发挥最大药效。
试验例4兽用天然活性成分纳米凝胶剂的感染模型治疗实验
4.1材料与方法
(1)试验动物:大鼠,35只,600g-750g,分笼饲养于华中农业大学实验动物中心。
(2)试验方法
在严格遵守动物福利原则的前提下进行试验,期间保证温度适宜,饲料充足,饮水自由。选取6只大鼠作为正常对照组,其余大鼠均作感染模型组。每只大鼠腿部肌肉注射苯甲酸雌二醇0.15mg/(kg.d),连续处理3d,诱导大鼠发情。3d后,灌注0.3mL的3%冰醋酸以刺激大鼠子宫内膜。正常对照组在刺激后第3d用子宫灌注针经子宫颈向子宫内注射0.3mL生理盐水,每天灌注1次,连续5d。感染模型组在刺激后第3d用子宫灌注针经子宫颈向子宫内注射0.3mL混合菌液,给菌后大鼠倒立2min,保证菌液完全进入子宫,每天灌注1次,连续5d。
将已建立子宫内膜炎模型的大鼠重新分组,包括正常对照组在内共分为4组,即正常对照组、感染对照组、原料药物理混合组、天然活性成分复方纳米凝胶剂组。其中,正常对照组:不给予任何处理;感染对照组:在模型建立后不给予任何处理;原料药物理混合组:在模型建立后每2d向子宫内给予1次0.3mL物理混合原料药溶液(将66mg月桂酸甘油酯和33mg和厚朴酚加至3mL蒸馏水中,混合均匀),共给4次;天然活性成分复方纳米凝胶剂组:在模型建立后每2d向子宫内给予1次0.3g(约0.3mL)兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂(月桂酸甘油酯含量约6.6mg,和厚朴酚含量约3.3mg),共计4次。
4.2结果
治疗试验期间各组大鼠体温变化见表15。治疗第4天和第8天,大鼠子宫组织剖检结果见图5,子宫组织载菌量见表16,子宫组织促炎细胞因子水平见表17。治疗后各组大鼠子宫组织载菌量如图6所示,治疗后各组大鼠子宫组织炎性因子表达量如图7所示,治疗第8天子宫组织病理切片观察结果见图8。
表15体温变化
由表15可知,开始给药后,原料药物理混合组和天然活性成分复方纳米凝胶剂组大鼠体温均有下降,即两组药物皆可降低子宫内膜炎所诱发的高温。其中天然活性成分纳米凝胶剂组大鼠体温下降速度较快,原料药物理混合组大鼠体温下降速度次之,表明原料药物理混合液效果不如天然活性成分复方纳米凝胶剂。
表16第4天和第8天大鼠子宫组织载菌情况
由表16可知,正常对照组大鼠子宫内几乎没有细菌,感染对照组大鼠子宫内细菌量超过1.5×104cfu/mL。治疗组大鼠子宫内细菌含量明显下降,天然活性成分纳米凝胶剂组大鼠子宫内细菌含量要低于原料药物理混合组。该结果表明,兽用天然活性成分纳米凝胶剂抑制子宫内细菌繁殖能力较强。
表17第4天和第8天大鼠子宫组织促炎细胞因子水平
由表17可知,在治疗第4d时原料药物理混合组所有促炎细胞因子水平均要高于天然活性成分纳米凝胶剂组。在治疗第8d时,原料药物理混合组所有促炎细胞因子水平仍然偏高,天然活性成分纳米凝胶剂组IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8表达量接近正常对照组水平。该结果表明,兽用天然活性成分纳米凝胶剂可有效抑制组织促炎细胞因子表达。
由图5可知,与正常对照组相比,感染对照组大鼠子宫明显肿大,内有积液,严重者甚至与周围组织发生黏连。治疗第4d时,治疗组大鼠子宫内积液减少,肿胀程度均有减弱。治疗第8d时,原料药物理混合组大鼠子宫有轻微肿胀,而天然活性成分纳米凝胶剂组大鼠子宫肿胀情况基本消失,即天然活性成分纳米凝胶剂可有效缓解子宫内膜炎引起的肿胀。
由图6可知,正常对照组大鼠子宫内几乎没有细菌,感染对照组大鼠子宫内细菌量超过1.5×104cfu/mL。治疗组大鼠子宫内细菌含量明显下降,天然活性成分纳米凝胶剂组大鼠子宫内细菌含量要低于原料药物理混合组。上述结果表明,天然活性成分纳米凝胶剂抑制子宫内细菌繁殖能力较强。
由图7可知,在治疗第4d和第8d,原料药物理混合组所有促炎细胞因子水平均要高于天然活性成分纳米凝胶剂组。在治疗第8d,天然活性成分纳米凝胶剂组IL-6、TNF-α、IL-8表达量接近正常对照组水平。上述结果表明,天然活性成分纳米凝胶剂对炎症介质IL-6、TNF-α、IL-8具有较强的表达抑制能力。
由图8可知,空白对照组大鼠子宫内膜结构完整,未见炎性细胞浸润。感染对照组大鼠子宫内膜结构破坏明显,部分单层柱状上皮细胞脱落,深层细胞呈现肿胀拉伸状态,可观察到多量嗜中性粒细胞。原料药物理混合组、天然活性成分纳米凝胶剂组中炎性粒细胞数量减少,子宫内膜结构状态改善。
综上所述,本发明成功制备出一种具有高效抗菌消炎能力的兽用天然活性成分纳米凝胶剂,其较强的缓释能力有利于天然活性成分最大药效的发挥,也有利于天然活性成分在兽医临床上应用于子宫内膜炎防控。
本发明公开的天然活性成分复方纳米凝胶剂由天然活性成分、凝胶基质和附加剂组成,配方合理,工艺简单,性质稳定,使用方便,安全长效。该天然活性成分复方纳米凝胶剂包含两种协同增效的天然活性成分,可抑制金黄色葡萄球菌、链球菌等子宫内膜炎致病菌增殖,降低炎症部位促炎细胞因子表达,颇具临床使用前景;同时,其具有一定缓释能力,缓慢释放天然活性成分纳米粒因粒径小更易被细胞摄取,可实现药物在给药部位的长时间停留及吸收,从而增强作用时间,降低给药频率,提高疗效。
以上,仅为本申请较佳的具体实施方式,但本申请的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此,本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,其特征在于,所述兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂由天然活性成分、凝胶基质和附加剂组成;
所述天然活性成分由第一天然活性成分和第二天然活性成分经超声处理制成。
2.根据权利要求1所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,其特征在于,所述天然活性成分的浓度为3-4wt%,所述凝胶基质的浓度为0.6-7.0wt%,所述附加剂的浓度为0.03-15wt%。
3.根据权利要求1所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,其特征在于,所述第一天然活性成分和第二天然活性成分的质量比为(1-2)∶1。
4.根据权利要求3所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,其特征在于,所述第一天然活性成分为大黄酸、月桂酸甘油酯或紫檀芪;所述第二天然活性成分为厚朴酚或和厚朴酚。
5.根据权利要求1所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,其特征在于,所述凝胶基质为卡波姆940、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和壳聚糖中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂,其特征在于,所述附加剂为丙二醇和尼泊金乙酯中的至少一种。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将天然活性成分加入无水乙醇中,经过水热法制成天然活性成分纳米混悬液,然后将凝胶基质充分溶胀后与附加剂加入纳米混悬液中,搅拌,调节pH至6.0-7.5,即得到兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂。
8.一种如权利要求1-6任一项所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂在制备治疗子宫细菌感染药物中的应用。
9.一种如权利要求1-6任一项所述的兽用天然活性成分复方纳米凝胶剂在制备缓解子宫细菌感染性炎症药物中的应用。
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