CN116687852A - 常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法及其在痤疮炎症治疗中的应用 - Google Patents
常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法及其在痤疮炎症治疗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于精油的制备和用途领域，特别涉及常山胡柚果皮精油纳米乳的制备及其在痤疮炎症治疗方面的应用。本发明公开了一种常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，包括以下步骤：由Span‑80和Tween‑80组成复合表面活性剂；以CHEO为油相，蒸馏水为水相，先将油相与表面活性剂混合，而后在磁力搅拌条件下加入水相形成体系；将所述体系磁力搅拌混合1.5～2.5h，得乳剂；将所得的乳剂进行均质，得CHEO纳米乳。本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的常山胡柚果皮精油纳米乳在制备治疗痤疮炎症药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于精油的制备和用途领域，特别涉及常山胡柚果皮精油纳米乳的制备及其在痤疮炎症治疗方面的应用。
背景技术
常山胡柚(Citrus changshan-huyou Y.B.Chang)是芸香科柑橘属的一个种，为酸橙与柚杂交的地方柑橘品种，浙江省常山县特产，中国国家地理标志产品。常山胡柚香味独特浓郁，味酸甜爽口，具有较高的营养价值与药用价值，是浙江省重要经济树种。常山胡柚产业初具规模，然而常山胡柚产业起步较晚，胡柚加工品基本以胡柚汁、胡柚囊瓣、果脯蜜饯为主，产品科技含量较低，产品附加值不高。另一方面，常山胡柚加工产生大量果皮、橘络等加工废弃物，这部分加工废弃物富含纤维素、精油、胡柚黄酮、柠檬苦素等物质并未获得有效利用，目前仅有少量单位利用常山胡柚废弃物提取胡柚黄酮、柠檬苦素等物质，年产量低且未形成特色化产品。胡柚中的其他功能性物质,如果胶、胡柚精油、类胡萝卜素类等没有开展有效地精深加工，大多果皮被直接遗弃，常山胡柚产业想要成功完成现代化转型，实现农民增收，企业增效，环境友好，提高常山胡柚产品加工效益，加工副产物的综合利用势在必行。
痤疮，俗称粉刺、青春痘，是一种发生于毛囊皮脂腺的常见慢性炎症性疾病，多发生于面部、颈部等皮脂腺丰富的部位。所有年龄段都有可能发生痤疮炎症，但在青少年中发病率极高，在13岁～17岁的青年群体中发病率高达80％，且其中有10％的患者发展为重度痤疮。痤疮病症有多种表现，包括开放性和闭合性粉刺、丘疹、脓疱、结节和囊肿等病变，甚至形成疤痕，这些症状可能持续多年且很难修复。根据病症表现不同对痤疮分为轻、中、中重与重度四个等级，中度以上患者通常都有炎症丘疹与炎症皮损的困扰。2019年一项对全国29个省大学生的流行病学调查表明，全国有45.22％的大学生患有程度不同的痤疮，其中近40％的患者达到中度痤疮以上水准，系一种普遍的疾病。
痤疮发病诱因非常复杂，至今尚未查明明确的诱发因素。从流行病学角度的分析调查来看，饮食与肥胖、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)等微生物感染、吸烟、心理压力与焦虑、荷尔蒙变化、化妆品与药物以及遗传因素都有可能与痤疮的发病有关，尤其是微生物感染因素，曾被认为是引起痤疮的主要元凶。就痤疮的发病机制而言，角质化过程异常导致粉刺、雄激素作用下皮脂分泌增多、P.acnes的定植与炎症介质释放到皮肤中四个过程在痤疮病变的发生中起到关键作用，虽然尚不明确四个过程的确切顺序与相互作用，但P.acnes在四个过程中都有其身影。
痤疮丙酸杆菌(P.acnes)是一种革兰氏阳性菌、非孢子形成人类皮肤共生体，喜欢厌氧的生长条件，也是正常的皮肤微生物群组成部分，它主要定植于毛囊皮脂腺中，甚至在皮脂腺中占主导地位(约占87％)。P.acnes对于调节皮肤稳态，维护健康皮肤而言至关重要，但P.acnes定植于毛囊会诱发毛囊炎症反应，是诱发痤疮的核心因素之一。P.acnes定植于皮脂腺，皮脂腺卵泡给P.acnes提供了厌氧且富含脂质的生长环境，如果人角质形成细胞过度角化或雄激素影响下导致皮脂分泌增多，会导致P.acnes大量增多。一方面，P.acnes能分泌多种胞外酶，如酯酶、透明质酸酶等，分解皮脂腺分泌的游离脂肪酸的同时分解真皮与表皮细胞外基质成分，可能刺激毛囊、诱导并扩散皮肤炎症；另一方面，大量的P.acnes会定植与毛囊导管，堵塞毛孔，引发细胞炎症，而不管是炎症的发生还是毛囊刺激导致角化加剧，又会促进P.acnes增植，形成正反馈循环。与此同时，P.acnes还会在皮脂腺毛囊中形成大量生物膜，这种生物膜的生成不止加重了异物感染引发的炎症，也使P.acnes对抗生素与抗菌剂的耐药性增加。在此以外，P.acnes还能通过激活Toll样受体2(Toll-likereceptor2,TLR2)触发巨噬细胞中的炎性细胞因子反应。TLR2在毛囊的周围的巨噬细胞与角质形成细胞的细胞表面表达，在痤疮炎症的发生过程中，角质形成细胞分化会导致TLR2表达增加，P.acnes衍生的热休克蛋白GroEL、DnaK或脂聚糖可以作为TLR2的配体激活TLR2，而后TLR2通过激活髓样分化因子(myeloid differentiation factor88,MyD88)通路活化下游核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)与丝列原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路，激活角质形成细胞与单核细胞释放促炎细胞因子(白细胞介素IL-1β、IL-8和IL-12)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导炎症反应，这也使得TLR2这一受体受到关注，与P.acnes共同成为治疗痤疮的药物靶点。
目前痤疮治疗一般选择外用抗生素(克林霉素与红霉素)、过氧化苯甲酰、外用维甲酸类药物(维甲酸、阿达帕林和异维A酸)或者复方手段；在这些药物当中外用维A酸是最好用且常用的药物，尤其是全反式维A酸(All-trans Retinoic Acid,ATRA)。外用类维生素A能有效影响角质形成细胞的成熟过程，阻断异常角质化，并且具有抗炎作用，还能有效下调TLR2的表达，因此它们对粉刺和炎症性痤疮都有效。但是这些常用的治疗手段或多或少的存在副作用，抗生素类药物的使用会导致P.acnes产生耐药性，目前已经发现耐克林霉素、红霉素和四环素的P.acnes。而对于另一常用药ATRA的使用，其本身就存在着一些副作用，如干燥、脱皮、红斑和刺激。基于这些药物的副作用，天然产物成分对于痤疮的治疗作用开始受到关注，例如柑橘属植物精油，有一些研究证实柑橘属植物精油具有广谱杀菌性，且具有一定的体外抗炎、抗氧化作用，这表明柑橘属精油或许可以以P.acnes为靶点应用于痤疮炎症的治疗与预防上。而常山胡柚精油，在柑橘属精油中具有最强的抑菌活性，且其抗氧化活性在不同种柑橘精油中亦名列前茅，或可作为现有药物的替代，用于痤疮炎症的治疗。
常山胡柚精油(Citrus changshan-huyou Y.B.Chang Essensial Oil，CHEO)具有极强的抑菌活性与抗氧化活性，有很高的利用价值，但由于其水溶性差、光照稳定性差、生物利用度低等问题使得其在食品、医药、化妆品等的应用与发展受到极大的阻碍。因此，需对其进行改性利用，扩展其应用范围。
现有相转变法利用Tween、Span等表面活性剂，结合高压均质手段制备精油纳米乳的方法在多种植物精油上有应用实例，Tween、Span均为单一择用的方式。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种常山胡柚精油纳米乳的制备方法及其在治疗痤疮炎症中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，包括以下步骤：
1)、配制复合表面活性剂
由质量含量为18～20％的Span-80和80～82％的Tween-80组成复合表面活性剂；
2)、以CHEO为油相，蒸馏水为水相，先将油相与表面活性剂混合，而后在磁力搅拌条件下加入水相(缓慢加入，时间约为5～20min，例如为缓慢注射)形成体系；
所述体系中，油相的质量含量为2～5.5％(优选2.38～5.26％)，表面活性剂的质量含量为7～22％(优选7.14～21.43％，更优选21.05～21.43％)，水相的质量含量为73～89％(优选73.68～88.10％，更优选73.68～76.19％)；
将所述体系磁力搅拌混合1.5～2.5h，得乳剂；
CHEO为常山胡柚精油；
3)、将步骤2)所得的乳剂进行均质，得CHEO纳米乳。
作为本发明的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法的改进：所述步骤3)中，均质压力20±2MPa、均质温度45±5℃，均质时间为5±1分钟。
作为本发明的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法的进一步改进：搅拌(磁力搅拌)的转速为200rpm～400rpm。
作为本发明的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法的进一步改进：
油相与表面活性剂的质量比为1～2:9～8。
作为本发明的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法的进一步改进：
由质量含量为19％的Span-80和81％的Tween-80复合表面活性剂；
油相：表面活性剂：水相＝1：4：14的质量比。
作为本发明的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法的进一步改进：
CHEO为采用无溶剂微波萃取方法制备而得的常山胡柚精油。
本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的常山胡柚果皮精油纳米乳在制备治疗痤疮炎症药物中的应用。
本发明优选方法制备的CHEO纳米乳中精油负载量可达52.6mg/g，粒径集中在30nm以下，PDI为0.189±0.016，电位为-15.75±1.08mV，体系稳定。在30d常温储藏期内粒径与PDI无明显变化，且CHEO保留率高于50％，储藏稳定性佳；且CHEO纳米乳抑菌活性与抗氧化活性均高于CHEO溶液，表明其包埋不影响精油生物活性。
本发明以上述CHEO纳米乳于大鼠痤疮耳廓模型上验证其对痤疮炎症的治疗效果，并以现有药物全反式维A酸(ATRA)乳膏为阳性对照：在表观上，CHEO纳米乳治疗能显著消除因炎症引起的皮肤红斑和肿胀，有助于修复皮肤组织；在病理上，CHEO纳米乳显著降低了IL-1α、IL-6、IL-8与TNF-α等炎症因子的分泌。此外，中、高浓度的CHEO纳米乳能够显著抑制痤疮炎症TLR2-MAPK-NFκB信号通路中的TLR2、JNK、MAPK p38与NF-κB p65蛋白表达，抑制炎症因子分泌，达到治疗痤疮炎症的效果，且其抑制效果优于ATRA药物。表明CHEO纳米乳有治疗痤疮炎症，替代现有痤疮药物的潜力。
常山胡柚精油纳米乳的用法和用量为：涂于痤疮处，约0.5mL/d。
综上，本发明制备了常山胡柚精油纳米乳，扩大了其应用范围，提高其稳定性，并在动物痤疮模型上验证了其对痤疮的治疗效果，从而开阔了常山胡柚精油的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为CHEO/表面活性剂/水体系拟三元相图；
图2为CHEO纳米乳室温贮藏30d粒径与PDI的变化；
图3为CHEO纳米乳室温贮藏30d保留率的变化；
图4为治疗后大鼠耳廓痤疮表观；
注：A：健康对照，B：模型组，C：ATRA，D：0.5×MIC CHEO纳米乳，E：1×MIC CHEO纳米乳，F：1.5×MIC CHEO纳米乳。
图5为治疗14天后大鼠耳廓痤疮评价；
图6为CHEO纳米乳治疗大鼠耳廓对耳廓厚度与重量的影响；
注：与模型组比较，***p<0.001。
图7为CHEO纳米乳对大鼠耳廓痤疮的病理影响(HE，100×)；
注：A：健康对照，B：模型组，C：ATRA，D：0.5×MIC CHEO纳米乳，E：1×MIC CHEO纳米乳，F：1.5×MIC CHEO纳米乳。
图8为对痤疮炎症因子的分泌影响；
注：与对照组比较，++++p<0.0001；与模型组比较，***p<0.001，****p<0.0001；与阳性药物组比较，nsp>0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明的常山胡柚精油(CHEO)可参考已公开发表的《无溶剂微波萃取法提取花椒精油》的无溶剂微波萃取方法进行制备。具体如下：
一、CHEO提取的前处理
鲜常山胡柚果皮→自然干燥(避光、室温，至含水率≤5％)→切粒/粉碎(过10目筛)→称量→保存备用
二、CHEO提取
无溶剂微波萃取法，是利用微波辐射加热新鲜的或干燥但经浸润处理的植物组织，通过快速汽化的水分将组织内部的精油带出的方法，由于使用溶剂少或几乎不使用溶剂，精油成分溶解损失少且加热效率高，有得率高、环保、高效等优点。
称取50g常山胡柚皮粉末置于烧杯，取0.15M离子液体溶液(浓度为0.15M的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐水溶液)没过胡柚皮粉末，密闭条件下静置24h浸湿物料；而后将浸湿后的物料转移至圆底烧瓶，将烧瓶置入微波仪内腔中，微波提取精油。
微波提取CHEO的最佳条件为：微波时间为12min，微波功率300W，ILs浓度为0.15M，经验证此时得率达1.33±0.02％。
实施例1：胡柚精油纳米乳的制备，包括以下步骤：
1)、取Tween 80与Span 80，以Span-80(19％)+Tween-80(81％)配制成复合表面活性剂SF；
上述％为质量％。
2)、以CHEO为油相，蒸馏水为水相，将CHEO与复合表面活性剂SF按照质量比4:6、3:7、2:8、1:9的比例混合均匀，每组5g置于烧杯中，放入磁力搅拌转子，边搅拌边以注射器缓慢向油相中滴加蒸馏水(每分钟滴加2ml蒸馏水)，观察到相转变时(体系突然由浑浊变澄清)，记录此时加入的水相质量。以油相、表面活性剂与水相质量分数为轴，绘制三元相图(图1)，曲线内区域为CHEO纳米乳的成乳区域，乳液成形后继续磁力搅拌2h(即，水相注射完毕后，磁力搅拌混合2h，搅拌转速为200rpm～400rpm)，得乳剂；成乳时配比见表1；
3)、以表1中的配方(优选负载精油含量高)制备纳米乳，取搅拌完成后的乳剂进行均质，均质压力20MPa、均质温度45℃，均质时间为5min；得CHEO纳米乳备用。
表1CHEO纳米乳形成时各项配比
说明：本发明还将CHEO与复合表面活性剂SF按照质量比9:1、8:2、7:3、6:4、5：5进行复配，发现上述比例下难以形成稳定乳液体系，故不作考虑。
实验1：CHEO纳米乳的粒径、多分散系数与电位的测定
测定纳米粒子粒径、多分散系数(PDI)：取样品1mL～1.5mL放入样品池中，设定测定温度25℃，平衡时间2min，每次循环扫描10次～100次，重复测定3次。
测定Zeta电位方法：取0.75mL～1mL放入样品池中，插入电极，设定测定温度25℃，每次循环扫描10次～100次，重复测定3次。
pH及透光率：分别以pH计和分光光度计检测。
表2CHEO纳米乳的粒径、多分散系数与电位
由表2可知：由于油相与表面活性剂比为“3：7”或“4：6”时，PDI超过了0.250，这表明粒径分布不够均匀。因此，此2个方案后续不予考虑。
油相与表面活性剂比为“1：9”或“2：8”这2个方案相对而言，CHEO纳米乳以油相：表面活性剂：水相＝1：4：14的质量比制备时，不止具有最高载药量，其纳米乳粒径均维持在30nm以下，具有良好的纳米颗粒形态，且PDI均不大于0.250，这表明粒径分布较均匀，且Zeta电位<-15mV，电位绝对值小于15mV的纳米粒子体系比较稳定，且粒子之间不易团聚。因此通过该方法制备的纳米粒子粒径较小且分布均匀。
实施例2、胡柚精油纳米乳的制备，包括以下步骤：
1)、取Tween 80与Span 80，以Span-80(19％)+Tween-80(81％)配制成复合表面活性剂SF；
上述％为质量％。
2)、设定油相：表面活性剂：水相＝1：4：14的质量比；
以CHEO为油相，蒸馏水为水相，先将CHEO与复合表面活性剂SF混合均匀，在磁力搅拌下(搅拌转速为300±50rpm)，滴加入蒸馏水(滴加时间约为7分钟)，蒸馏水加入完毕后，继续磁力搅拌混合2h，搅拌转速为300±50rpm，得乳剂；
3)、将步骤2)所得的乳剂进行均质，均质压力20MPa、均质温度45℃，均质时间为5min；得CHEO纳米乳。
此CHEO纳米乳按照上述实验1进行检测，所得结果等同于表2中的油相与表面活性剂比例“2：8”对应的结果。
后续实验以此实施例2所得的CHEO纳米乳进行，即维持油相与表面活性剂比例“2：8”比例制备CHEO纳米乳，并加水稀释至CHEO含量符合实验条件。
实验2、CHEO纳米乳稳定性测定
室温避光情况下贮藏30d，间隔一段时间(5天)取出CHEO纳米乳(实施例2)测粒径、PDI变化与保留率。保留率测定方法：以CHEO的主要成分d-柠檬烯含量为内标，测定CHEO的含量变化，取上述CHEO纳米乳，使用HPLC法，根据标准曲线测定柠檬烯含量，计算CHEO含量，按下式计算保留率。采用同浓度同储藏时间的CHEO无水乙醇溶液作为对照。作为对照的CHEO无水乙醇溶液的制备方法为：取CHEO溶于无水乙醇中，使得对照与CHEO纳米乳中含有的CHEO浓度保持相同。
式中：保留的CHEO质量为储藏期测定出纳米乳中d-柠檬烯的含量，mg/mL；CHEO初始质量为储藏期0d时纳米乳中d-柠檬烯的含量,mg/mL。
实验结果见图2与图3，可以看出纳米乳体系形成的微粒可以有效保护CHEO，减少精油损失，使CHEO成分在储藏期内稳定保存。
实验3：CHEO纳米乳对痤疮炎症的治疗作用
实验动物：SPF级SD健康大鼠60只，体重150g～200g，雌雄1：1，浙江中医药大学实验动物中心提供；
造模方法：选择上述SD大鼠，采用随机抽样法分6组：空白组、模型组、阳性对照组(ATRA)以及药物处理低浓度组、中浓度组、高浓度组，每组10只，除空白组外，其余组建立大鼠耳廓复合痤疮模型。在大鼠右耳内侧面耳导管开口处每日涂50％油酸溶液1次，每次0.5mL～1mL，隔日于大鼠耳廓皮内注射P.acne菌液50μL(1×106CFU)，连续3周。待第22天时观察大鼠耳廓皮损形态，右耳造模部位出现红肿，肉眼可见扩张的毛细血管、毛孔增大、脱屑及丘疹样隆起或囊肿，触之皮损处粗糙干燥，即痤疮炎症造模成功，大鼠左耳不做处理以作对照。
分组与给药方式：大鼠耳廓痤疮造模成功后，空白与模型组不做处理，阳性药物组每日以市售处方药全反式维A酸涂敷右耳一次，用药剂量为：药物含量为0.025％的维A酸乳膏1g·(kg·d)-1，实验组分别以低浓度(精油含量为1.5mg/mL，即0.5×MIC)、中浓度(3.0mg/mL，即1×MIC)与高浓度(4.5mg/mL，即1.5×MIC)的CHEO纳米乳涂敷右耳一次，用药剂量为1g纳米乳·(kg·d)-1，持续治疗2周。
说明：将CHEO纳米乳加水进行稀释，从而相应获得上述低浓度(精油含量为1.5mg/mL，即0.5×MIC)、中浓度(3.0mg/mL，即1×MIC)与高浓度(4.5mg/mL，即1.5×MIC)的CHEO纳米乳。
治疗周期结束后，以游标卡尺测量大鼠耳廓组织厚度，以左耳作为对照对比痤疮造模前后与治疗前后厚度差异，计算耳廓肿胀率。
耳廓肿胀率＝(造模/治疗后耳廓厚度-对照耳廓厚度)/对照耳廓厚度×100％。
耳廓增重率＝(造模/治疗后耳廓重量-对照耳廓重量)/对照耳廓重量×100％。
而后对大鼠耳廓进行拍照观察与评价，评价标准参考痤疮模型分级标准，见表3。
表3痤疮模型判定分级标准
CHEO对痤疮炎症的治疗效果见图4、图5与图6。
由表观结果与耳廓肿胀率可知，经CHEO纳米乳治疗后，耳廓炎症显著减少：与模型组对比，经药物治疗后的各组皮损与红斑减少，原本遍布耳廓的红斑仅在ATRA与低浓度CHEO-N组中部分大鼠耳廓上少量存在，在中浓度与高浓度药物组中则全部消失愈合；耳廓皮肤外观上看，除低浓度CHEO-N组外皮肤依旧发红外，其余三组皮肤转为粉色，部分老鼠表观上完全恢复为健康耳廓模样，而三组中尚为轻度痤疮的大鼠中，中、高浓度CHEO-N组中的大鼠耳廓与健康对照的皮肤状态最为接近，皮肤变粉变白，耳廓外围毛细血管收缩，表明炎症受到明显抑制。从耳廓厚度等变化来看，经过药物治疗后，耳廓厚度与重量均呈现下降趋势，表明药物治疗可以消除耳廓肿胀，改善皮肤角质增生。表面CHEO纳米乳对痤疮炎症的治疗作用显著。
根据图4～图6，可得知：低浓度(0.5×MIC)、中浓度(1×MIC)与高浓度(1.5×MIC)的CHEO纳米乳，优选中浓度(1×MIC)的CHEO纳米乳作为痤疮的治疗药物，可以兼顾治疗疗效与制作成本。
实验4、CHEO纳米乳治疗对痤疮炎症大鼠病理的影响
实验3的治疗结束后取耳廓组织，置于4％多聚甲醛溶液固定24h后进行脱水处理，以石蜡包埋、切片、染色，置于显微镜观察(图7)。
结果显示，正常组耳廓毛囊口分布细密表皮平整，且皮脂腺与真皮毛囊清晰可见，而模型组毛囊口增大，皮肤粗糙隆起，皮肤角质化过度，且真皮毛囊增生变大以致界线不清晰；ATRA药物处理的阳性对照组和CHEO纳米乳处理组不同程度地缓解了症状：与模型组相比，阳性对照组没能收缩毛囊，但显著改善皮肤过度角质化，表皮各组织界线清晰且真皮毛囊增生受到抑制，低浓度CHEO纳米乳则与模型组最接近，角质化过度皮肤表面粗糙，毛囊增生且毛囊口扩大，而中、高浓度则使耳廓状态恢复到接近健康对照组，毛囊口收缩，真皮毛囊无过度分化，皮脂腺等结构清晰，显著改善痤疮病灶。
实验5、CHEO纳米乳治疗对痤疮炎症大鼠炎症因子的影响
实验3的末次给药后24h禁食不禁水，剃除大鼠耳背皮肤周围的毛，腹腔注射戊巴比妥(45mg/kg)麻醉。麻醉后开腹，分离腹主动脉，进行腹主动脉采血，于真空促凝采血管静置待凝后，4℃、3000r/min离心15min，留取上清液采用ELISA试剂盒测定细胞上清液内IL-8、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。
TNF-α是一种多变性促炎细胞因子，介导对细菌感染的免疫反应。在皮肤受到刺激后，细胞会合成TNF-α，而后TNF-α与相应的受体结合，激活下游信号传导，调节趋化因子、粘附分子、次级细胞因子等产生炎症反应。从图8可以看出，痤疮造模后导致TNF-α水平极显著(p<0.0001)提高，表明P.acne定植后引发角质形成细胞与单核细胞释放大量炎症因子，引发了较强的炎症反应。从CHEO纳米乳处理对TNF-α水平的影响可以看出，0.5×MIC的CHEO纳米乳处理其TNF-α水平与模型组无显著差异(p>0.05)，这就可以解释其治疗痤疮炎症的表观效果也不理想的现象，表明在低浓度下的CHEO对痤疮炎症的治疗效果有限，但中浓度(1×MIC)与高浓度(1.5×MIC)的CHEO纳米乳则极显著(p<0.0001)降低了TNF-α水平，且与阳性药物ATRA对比发现，1×MIC浓度的CHEO纳米乳治疗效果与ATRA治疗效果相差无几，而1.5×MIC的CHEO纳米乳在降低TNF-α分泌水平方面的效果极显著(p<0.001)超过了ATRA，表明CHEO纳米乳相较ATRA有更好的抗炎效果，且CHEO纳米乳的抗炎效果与其浓度呈正相关性。
由图8可以看出CHEO纳米乳对其他三个炎症因子的影响与对TNF-α的影响趋势相似，各浓度CHEO纳米乳均有效降低了大鼠的痤疮炎症水平，且对炎症因子的降低效用与CHEO浓度呈正相关。此前研究表明，在痤疮炎症中，TNF-α可通过NLRP3/IL-1β信号通路上调IL-1β水平，而后IL-1β进一步导致皮肤组织炎症的发展，促使IL-6、IL-8水平上调，加重炎症，所以CHEO纳米乳干预下各炎症因子呈现出相似的水平。但0.5×MIC浓度的CHEO纳米乳处理使得IL-6等炎症因子的水平也极显著(p<0.0001)降低，或许除了通过抑制TNF-α以外，还有其他抗炎机制的存在。
此外，虽然CHEO纳米乳与ATRA都显示出了对痤疮炎症的治疗效用，但在14d的治疗后，两种药物治疗并未使耳廓恢复到健康对照同等的情况，大鼠耳廓组织依然有水肿与少量炎症，或许为治疗时长不足所致，但14d的治疗时长已超过外用ATRA药物的建议治疗疗程(7d～10d)，表明对于中重度痤疮的治疗，可能需要多周期用药才能完全治愈。
对比例1、将实施例2中的复合表面活性剂SF由“Span-80(19％)+Tween-80(81％)”改成“Span-80(50％)+Tween-80(50％)”，命名为复合表面活性剂A；以此复合表面活性剂A配制“油相：表面活性剂：水相＝1：4：14的质量比”的胡柚精油纳米乳，其余参照实施例2。
对比例2、将实施例1中的复合表面活性剂SF由“Span-80(19％)+Tween-80(81％)”改成“Span-80(81％)+Tween-80(19％)”，命名为复合表面活性剂B；以此复合表面活性剂B配制“油相：表面活性剂：水相＝1：4：14的质量比”的胡柚精油纳米乳，其余参照实施例2。
对比例3、将实施例1中的复合表面活性剂SF由“Span-80(19％)+Tween-80(81％)”改成全部为Tween-80；以Tween-80配制“油相：表面活性剂：水相＝1：4：14的质量比”的胡柚精油纳米乳，其余参照实施例2。
上述对比例1～对比例3所得的胡柚精油纳米乳，按照实验1进行检测，所得结果为：
表4不同样品的粒径、多分散系数、Zeta电位的比较
由结果可以看出，换成不同配方后其体系粒径变大，PDI及电位改变，其体系已不成稳定纳米乳体系，说明复合表面活性剂SF“Span-80(19％)+Tween-80(81％)”的配方制备纳米乳性能最佳。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，其特征在于包括以下步骤：
1)、配制复合表面活性剂
由质量含量为18～20％的Span-80和80～82％的Tween-80组成复合表面活性剂；
2)、以CHEO为油相，蒸馏水为水相，先将油相与表面活性剂混合，而后在磁力搅拌条件下加入水相形成体系；
所述体系中，油相的质量含量为2～5.5％，表面活性剂的质量含量为7～22％，水相的质量含量为73～89％；
将所得的体系磁力搅拌混合1.5～2.5h，得乳剂；
CHEO为常山胡柚精油；
3)、将步骤2)所得的乳剂进行均质，得CHEO纳米乳。
2.根据权利要求1所述的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，其特征在于：所述步骤3)中，均质压力20±2MPa、均质温度45±5℃，均质时间为5±1分钟。
3.根据权利要求1或2所述的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，其特征在于：
搅拌的转速为200rpm～400rpm。
4.根据权利要求3所述的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，其特征在于：
油相与表面活性剂的质量比为1～2:9～8。
5.根据权利要求4所述的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，其特征在于：
由质量含量为19％的Span-80和81％的Tween-80复合表面活性剂；
油相：表面活性剂：水相＝1：4：14的质量比。
6.根据权利要求1～5任一所述的常山胡柚果皮精油纳米乳的制备法，其特征在于：
CHEO为采用无溶剂微波萃取方法制备而得的常山胡柚精油。
7.如权利要求1～6任一方法制备而得的常山胡柚果皮精油纳米乳在制备治疗痤疮炎症药物中的应用。
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