CN116686714A - 一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，通过培育病菌携带量较少的健康薯苗、培养基制备、外植体制备、外植体消毒、外植体接种、种质资源试管苗获取、种质资源试管苗扩繁、种质资源试管苗保存8个步骤实现了种质资源的长期保存。甘薯种质资源试保存材料的制备是利用甘薯的无性繁殖特点，以长度约0.5cm、含1个侧芽的幼嫩茎段做外植体，直接接种至不含激素的MS培养基培育成苗，成苗时间由2～3个月缩短至1～2个月，简化了试管苗制备步骤，加快了试管苗成苗进程。
Description
技术领域
本发明涉及甘薯种质资源保存技术领域，具体为一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法。
背景技术
甘薯种质资源多样性是甘薯育种取得突破的关键，但在甘薯品种的推广应用过程中，长期以优质高产为生产目标，导致甘薯品种逐渐向一致化，简单化发展，甘薯优质基因日趋狭窄，因此，妥善保存优良甘薯种质资源，丰富甘薯种质资源多样性，是甘薯育种工作的关键环节。
目前甘薯种质资源保存以大田保存和试管苗保存为主，但大田保存费时费力，用地面积大，成本高，田间环境复杂，病菌种类繁多，且甘薯品种易出现退化现象，试管苗保存因用地面积小，经济实用，不易受自然因素影响而更受推崇。目前，常用的试管苗制备方法是茎尖分生组织培养，该方法制备的试管苗不含或少含病毒，但现在使用的试管苗保存方法，在试管苗制备过程中需要借助体视显微镜剥出甘薯顶芽，随后接种至添加激素的培养基中诱导培养，操作流程繁琐，技术要求较高，茎尖苗成苗周期较长。在试管苗保存过程中，常规组织培养由于试管苗不断增殖生长，培养基中的养分和水分不断消耗，培养基中的水分不断蒸发而逐渐干涸，这时不更换新的培养基进行继代转接，试管苗则无法继续存活，目前常规组织培养继代保存时间一般维持在6～8个月，而不能进一步延长，因此，急需一种甘薯种质资源试管苗的快速制备和长期保存方法。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供了一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，包括如下步骤：
(1)培育病菌携带量较少的健康薯苗；
(2)培养基制备按4.74g/L MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖配制后备用；
(3)外植体制备剪取(1)中所述薯苗新长出的幼嫩茎段，每茎段带有1个顶芽和3～5个侧芽，随后去除顶芽和叶片，剩余茎段作外植体；
(4)外植体消毒将上一步获得的外植体用清水冲洗干净，先用0.1％的洗衣粉清洗，清水冲洗干净后，再用0.5％高锰酸钾溶液浸泡5min，转移到无菌操作台，然后用70％酒精浸泡30s，再用2％次氯酸钠溶液浸泡7～10min，最后用无菌水冲洗3～5次待用；
(5)外植体接种将上一步中所述无菌水冲洗过的外植体放入无菌培养皿内，用无菌手术刀将接触药剂的茎段切口两端切除，再分割成长度约0.5cm、只带1个侧芽的茎段，直接接种到无菌培养基；
(6)种质资源试管苗获取所述外植体接种后，培养1～2个月茎段苗成株；
(7)种质资源试管苗扩繁：将(6)中所述种质资源试管苗切成长度约1.0cm、含1个侧芽的茎段，接种在加入生长延缓剂的MS培养基上；
(8)种质资源试管苗保存：将(7)中所述扩繁的所有种质资源试管苗放入温度28℃，光照强度2000lx培养，光照时长12h的培养箱，培养至三叶一心，随后转移到温度(25±3)℃，光照强度2000lx，光照时长8h的组培室进行长期保存。
进一步的，种质资源薯苗培养：将所有需要保存的种质资源，通过大田薯苗茎段室内基质栽插培养或薯块室内基质育苗的方法，
进一步的，外植体接种时，所述外植体接种到无菌培养基时，侧芽距培养基的距离为0.1～0.2cm。
进一步的，所述生长延缓剂为甘露醇、脱落酸、矮壮素。
进一步的，扩繁时，侧芽距培养基的距离为0.3～0.5cm。
进一步的，扩繁时，接种后在培养基表面加入无菌水3～5mL。
进一步的，所述生长延缓剂的加入量为甘露醇为10g/L，脱落酸为1mg/L，矮壮素为100mg/L。
进一步的，保存过程中，每2～3个月添加一次无菌水，每次每组培瓶3～5mL。
本发明的有益效果是：
甘薯种质资源试保存材料的制备是利用甘薯的无性繁殖特点，以长度约0.5cm、含1个侧芽的幼嫩茎段做外植体，直接接种至不含激素的MS培养基培育成苗，成苗时间由2～3个月缩短至1～2个月，简化了试管苗制备步骤，加快了试管苗成苗进程。
在继代培养基中加入生长延缓剂，抑制培养物不断增殖生长，延缓试管苗生长速度，减少植株养分和水分消耗；加入无菌水，有效控制了培养基水分蒸发，有效补偿了培养基蒸发和增殖生长过程中消耗的水分，防止培养基干涸造成的试管苗死亡。从而将继代间隔时间由6～8个月延长至10～12个月，降低转接工作量，提高成活率，延长种质资源保存时间。
用于取外植体的材料经过室内培养减少病菌携带量，在有薯块的季节选用室内基质育苗获得低病菌薯苗；在没有薯块的季节，先剪取大田秧头苗，再进行室内基质栽插，利用新长出的茎段制备外植体，外植体病菌携带量较低。
外植体选择相对幼嫩茎段，病毒等携带量较低，易消毒，成活率高。
切割的外植体茎段较小，病菌携带量较少，降低了污染率，成活率较高。
附图说明
图1所示是泰薯15短茎段做外植体试管苗成苗进程；
图2所示是泰薯15不同转接培养基试管苗对比；
图3所示是泰紫薯1号短茎段做外植体试管苗成苗进程；
图4所示是泰紫薯1号不同转接培养基试管苗对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述：
实施例一：(1)种质资源薯苗培养：选取淀粉型甘薯品种泰薯15健康薯块3块，在室内进行基质育苗，培育条件为(28±1)℃，每日光照13小时，光照强度2000～3000lx，培养箱培养35天后得到健康薯苗；
(2)培养基制备：4.74g/L MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖；
(3)外植体制备：剪取(1)所述薯苗幼嫩茎段10个，每茎段带有1个顶芽和3～5个侧芽，随后去除顶芽和叶片，剩余茎段作外植体；
(4)外植体消毒：将(3)中所述外植体先用清水冲洗干净，先用0.1％的洗衣粉清洗，清水冲洗干净后，再用0.5％高锰酸钾溶液浸泡5min，转移到无菌操作台，先用70％酒精浸泡30s，再用2％次氯酸钠溶液浸泡7～10min，无菌水冲洗3～5次待用；
(5)外植体接种：将(4)中所述无菌水冲洗过的外植体放入无菌培养皿内，用无菌手术刀将接触药剂的茎段切口两端切除，再分割成长度约0.5cm、只带1个侧芽的茎段，直接接种到无菌培养基，侧芽距培养基的距离约0.1cm，每个组培瓶接种2～3个短茎段，接种10个组培瓶；
(6)种质资源试管苗获取：(5)中所述外植体接种后，培养47天后茎段苗成株，得到优质健康试管苗9瓶。以短茎段做外植体，相对茎尖分生组织和试管苗成苗时间短及成苗率高，具体对比数据如表1，短茎段做外植体试管苗成苗进程如图1所示；
(7)种质资源试管苗扩繁：将(6)中所述种质资源试管苗切成长度约1.0cm、含1个侧芽的茎段，接种在加入10g/L甘露醇的MS培养基上，侧芽距培养基的距离约0.5cm，接种后在培养基表面加入无菌水约5mL，每个组培瓶接种3个短茎段，得到扩繁种质资源试管苗20瓶；与MS培养基相比，加入甘露醇和无菌水试管苗成苗进程显著延长，相关对比数据如表2，图2所示；
(8)种质资源试管苗保存：将(7)中所述扩繁的所有种质资源试管苗放入温度28℃，光照强度2000lx培养，光照时长12h的培养箱，培养至三叶一心，随后转移到温度(25±3)℃，光照强度2000lx，光照时长8h的组培室培养12个月，保存过程中，每3个月添加一次无菌水，每次每组培瓶5ml，试管苗存活率仍达到80％以上，试管苗生长健壮，绿片较多，继代成活率高，与MS培养基相比，加入甘露醇和无菌水试管苗保存时间明显延长，相关对比数据如表3。
表1泰薯15不同外植体试管苗成苗时间及成苗率对比
| 外植体 | 萌芽率(％) | 生根率(％) | 成苗率(％) | 成苗时间(d) |
| 茎尖分生组织 | 87.5b | 90.0b | 82.5b | 80 |
| 短茎段 | 95.0a | 95.0a | 95.0a | 47 |
注：表中同列数值后标记不同字母表示差异达0.05显著水平，相同字母表示差异不显著，下同。
表2泰薯15不同继代培养基试管苗成苗进程对比
注：CK表示转接培养基为MS培养基，DH表示转接培养基为MS培养基+10g/L甘露醇+5ml无菌水，下同。
表3泰薯15不同继代培养基试管苗保存时间对比
实施案例二
(1)种质资源薯苗培养：选取鲜食型紫心甘薯品种泰紫薯1号健康薯块3块，在室内进行基质育苗，培育条件为(28±1)℃，每日光照13小时，光照强度2000～3000lx，培养箱培养40天后得到健康薯苗；
(2)培养基制备：4.74g/L MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖；
(3)外植体制备：剪取(1)所述薯苗幼嫩茎段10个，每茎段带有1个顶芽和3～5个侧芽，随后去除顶芽和叶片，剩余茎段作外植体；
(4)外植体消毒：将(3)中所述外植体先用清水冲洗干净，先用0.1％的洗衣粉清洗，清水冲洗干净后，再用0.5％高锰酸钾溶液浸泡5min，转移到无菌操作台，先用70％酒精浸泡30s，再用2％次氯酸钠溶液浸泡7～10min，无菌水冲洗3～5次待用；
(5)外植体接种：将(4)中所述无菌水冲洗过的外植体放入无菌培养皿内，用无菌手术刀将接触药剂的茎段切口两端切除，再分割成长度约0.5cm、只带1个侧芽的茎段，直接接种到无菌培养基，侧芽距培养基的距离约0.1cm，每个组培瓶接种2～3个短茎段，接种10个组培瓶；
(6)种质资源试管苗获取：(5)中所述外植体接种后，培养38天后茎段苗成株，得到优质健康试管苗9瓶。以短茎段做外植体，相对茎尖分生组织和试管苗成苗时间短及成苗率高，具体对比数据如表4，短茎段做外植体试管苗成苗进程如图3所示；
(7)种质资源试管苗扩繁：将(6)中所述种质资源试管苗切成长度约1.0cm、含1个侧芽的茎段，接种在加入10g/L甘露醇的MS培养基上，侧芽距培养基的距离约0.5cm，接种后在培养基表面加入无菌水约5mL，每个组培瓶接种3个短茎段，得到扩繁种质资源试管苗20瓶；与MS培养基相比，加入甘露醇和无菌水试管苗成苗进程显著延长，相关对比数据如表5，图4所示；
(8)种质资源试管苗保存：将(7)中所述扩繁的所有种质资源试管苗放入温度28℃，光照强度2000lx培养，光照时长12h的培养箱，培养至三叶一心，随后转移到温度(25±3)℃，光照强度2000lx，光照时长8h的组培室培养10个月，保存过程中，每2个月添加一次无菌水，每次每组培瓶5ml，试管苗存活率仍达到80％以上，试管苗生长健壮，绿片较多，继代成活率高，与MS培养基相比，加入甘露醇和无菌水试管苗保存时间明显延长，相关对比数据如表6。
表4泰紫薯1号不同外植体试管苗成苗时间及成苗率对比
| 外植体 | 萌芽率(％) | 生根率(％) | 成苗率(％) | 成苗时间(d) |
| 茎尖分生组织 | 95.0a | 92.5b | 87.5b | 70 |
| 短茎段 | 95.0a | 95.0a | 97.5a | 38 |
表5泰紫薯1号不同继代培养基试管苗成苗进程对比
表6泰紫薯1号不同继代培养基试管苗保存时间对比
实施案例三
(1)种质资源薯苗培养：选取鲜食型甘薯品种泰中6号大田健康秧头苗约15段，剪成长度25～30cm的带顶芽茎段，在室内进行基质栽插培养，培育条件为(30±1)℃，每日光照12小时，光照强度2000～3000lx，培养箱培养25天后得到健康低毒薯苗；
(2)培养基制备：4.74g/L MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖；
(3)外植体制备：剪取(1)所述薯苗幼嫩茎段10个，每茎段带有1个顶芽和3～5个侧芽，随后去除顶芽和叶片，剩余茎段作外植体；
(4)外植体消毒：将(3)中所述外植体先用清水冲洗干净，先用0.1％的洗衣粉清洗，清水冲洗干净后，再用0.5％高锰酸钾溶液浸泡5min，转移到无菌操作台，先用70％酒精浸泡30s，再用2％次氯酸钠溶液浸泡7～10min，无菌水冲洗3～5次待用；
(5)外植体接种：将(4)中所述无菌水冲洗过的外植体放入无菌培养皿内，用无菌手术刀将接触药剂的茎段切口两端切除，再分割成长度约0.5cm、只带1个侧芽的茎段，直接接种到无菌培养基，侧芽距培养基的距离约0.1cm，每个组培瓶接种2～3个短茎段，接种10个组培瓶；
(6)种质资源试管苗获取：(5)中所述外植体接种后，培养37天后茎段苗成株，得到优质健康试管苗10瓶。以短茎段做外植体，相对茎尖分生组织和试管苗成苗时间短及成苗率高，具体对比数据如表7；
(7)种质资源试管苗扩繁：将(6)中所述种质资源试管苗切成长度约1.0cm、含1个侧芽的茎段，接种在加入1mg/L脱落酸的MS培养基上，侧芽距培养基的距离约0.5cm，接种后在培养基表面加入无菌水约5mL，每个组培瓶接种3个短茎段，得到扩繁种质资源试管苗20瓶；
(8)种质资源试管苗保存：将(7)中所述扩繁的所有种质资源试管苗放入温度28℃，光照强度2000lx培养，光照时长12h的培养箱，培养至三叶一心，随后转移到温度(25±3)℃，光照强度2000lx，光照时长8h的组培室培养12个月，保存过程中，每3个月添加一次无菌水，每次每组培瓶5ml，试管苗存活率仍达到80％以上，试管苗生长健壮，绿片较多，继代成活率高，与MS培养基相比，加入脱落酸和无菌水试管苗保存时间明显延长，相关对比数据如表8。
表7泰中6号不同外植体试管苗成苗时间及成苗率对比
表8泰中6号不同继代培养基试管苗保存时间对比
实施案例四
(1)种质资源薯苗培养：选取鲜食型甘薯品种泰薯14大田健康秧头苗约15段，剪成长度25～30cm的带顶芽茎段，在室内进行基质栽插，培育条件为(30±1)℃，每日光照12小时，光照强度2000～3000lx，培养箱培养20天后得到健康低毒薯苗；
(2)培养基制备：4.74g/L MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖；
(3)外植体制备：剪取(1)所述薯苗幼嫩茎段10个，每茎段带有1个顶芽和3～5个侧芽，随后去除顶芽和叶片，剩余茎段作外植体；
(4)外植体消毒：将(3)中所述外植体先用清水冲洗干净，先用0.1％的洗衣粉清洗，清水冲洗干净后，再用0.5％高锰酸钾溶液浸泡5min，转移到无菌操作台，先用70％酒精浸泡30s，再用2％次氯酸钠溶液浸泡7～10min，无菌水冲洗3～5次待用；
(5)外植体接种：将(4)中所述无菌水冲洗过的外植体放入无菌培养皿内，用无菌手术刀将接触药剂的茎段切口两端切除，再分割成长度约0.5cm、只带1个侧芽的茎段，直接接种到无菌培养基，侧芽距培养基的距离约0.2cm，每个组培瓶接种2～3个短茎段，接种10个组培瓶；
(6)种质资源试管苗获取：(5)中所述外植体接种后，培养42天后茎段苗成株，得到优质健康试管苗9瓶。以短茎段做外植体，相对茎尖分生组织和试管苗成苗时间短及成苗率高，具体对比数据如表9；
(7)种质资源试管苗扩繁：将(6)中所述种质资源试管苗切成长度约1.0cm、含1个侧芽的茎段，接种在加入100mg/L矮壮素的MS培养基上，侧芽距培养基的距离约0.3cm，接种后在培养基表面加入无菌水约5mL，每个组培瓶接种3个短茎段，得到扩繁种质资源试管苗20瓶；
(8)种质资源试管苗保存：将(7)中所述扩繁的所有种质资源试管苗放入温度28℃，光照强度2000lx培养，光照时长12h的培养箱，培养至三叶一心，随后转移到温度(25±3)℃，光照强度2000lx，光照时长8h的组培室培养12个月，保存过程中，每2个月添加一次无菌水，每次每组培瓶3ml，试管苗存活率仍达到80％以上，试管苗生长健壮，绿片较多，继代成活率高，与MS培养基相比，加入矮壮素和无菌水试管苗保存时间明显延长，相关对比数据如表10。
表9泰薯14不同外植体试管苗成苗时间及成苗率对比
| 外植体 | 萌芽率(％) | 生根率(％) | 成苗率(％) | 成苗时间(d) |
| 茎尖分生组织 | 93.3a | 93.3b | 90.0b | 70 |
| 短茎段 | 95.0a | 95.0a | 97.5a | 42 |
表10泰薯14不同继代培养基试管苗保存时间对比
Claims (8)
1.一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培育病菌携带量较少的健康薯苗；
(2)培养基制备按4.74g/L MS+8.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖配制后备用；
(3)外植体制备剪取(1)中所述薯苗新长出的幼嫩茎段，每茎段带有1个顶芽和3～5个侧芽，随后去除顶芽和叶片，剩余茎段作外植体；
(4)外植体消毒将上一步获得的外植体用清水冲洗干净，先用0.1％的洗衣粉清洗，清水冲洗干净后，再用0.5％高锰酸钾溶液浸泡5min，转移到无菌操作台，然后用70％酒精浸泡30s，再用2％次氯酸钠溶液浸泡7～10min，最后用无菌水冲洗3～5次待用；
(5)外植体接种将上一步中所述无菌水冲洗过的外植体放入无菌培养皿内，用无菌手术刀将接触药剂的茎段切口两端切除，再分割成长度约0.5cm、只带1个侧芽的茎段，直接接种到无菌培养基；
(6)种质资源试管苗获取所述外植体接种后，培养1～2个月茎段苗成株；
(7)种质资源试管苗扩繁：将(6)中所述种质资源试管苗切成长度约1.0cm、含1个侧芽的茎段，接种在加入生长延缓剂的MS培养基上；
(8)种质资源试管苗保存：将(7)中所述扩繁的所有种质资源试管苗放入温度28℃，光照强度2000lx培养，光照时长12h的培养箱，培养至三叶一心，随后转移到温度(25±3)℃，光照强度2000lx，光照时长8h的组培室进行长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于，种质资源薯苗培养：将所有需要保存的种质资源，通过大田薯苗茎段室内基质栽插培养或薯块室内基质育苗的方法，培育病菌携带量较少的健康薯苗。
3.根据权利要求1所述的一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于：外植体接种时，所述外植体接种到无菌培养基时，侧芽距培养基的距离为0.1～0.2cm。
4.根据权利要求1所述的一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于：所述生长延缓剂为甘露醇、脱落酸、矮壮素。
5.根据权利要求1所述的一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于：扩繁时，侧芽距培养基的距离为0.3～0.5cm。
6.根据权利要求1所述的一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于：扩繁时，接种后在培养基表面加入无菌水3～5mL。
7.根据权利要求1或4所述的一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于：所述生长延缓剂的加入量为甘露醇10g/L或脱落酸1mg/L或矮壮素100mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种甘薯种质资源试管苗的快速制备与长期保存方法，其特征在于：保存过程中，每2～3个月添加一次无菌水，每次每组培瓶3～5mL。
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