CN1166783C - 快速检测海藻施万氏菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速检测海藻施万氏菌的试剂盒，试剂包括：(a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，(b)PCR反应试剂：包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，试剂C含有10倍PCR反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，试剂D：包括特异引物VP₀₃，特指5‘-agccgcaagagcctatcaagga；VP₀₄特指5‘-atccttattcaccggagtcttg、dNTP及MgCl₂，(c)电泳和显色试剂。本发明还提供一种使用这种试剂盒快速测检海藻施万氏菌的方法，其优点是快速、准确。

Description

快速检测海藻施万氏菌的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测海藻施万氏菌的试剂盒，进一步涉及使用快速检测海藻施万氏菌的试剂盒快速测检海藻施万氏菌的方法。

背景技术

近年来，我国海水养殖业迅猛发展，在过去10年间海水养殖产量增加了5-6倍。但是，前阶段海水养殖的大发展带有很大的盲目性、甚至破坏性，导致这两年海水养殖产量增长开始放缓，尤其是病害的问题变的愈来愈严重。其中弧菌病是危害养殖鱼虾贝藻类等多种海水养殖生物的重要病原之一。弧菌是海洋起源的土著细菌，在海水和海洋生物中广为分布；病原性弧菌能引起养殖生物爆发性死亡，而且可以与病毒，其它细菌或寄生虫等一起造成共同感染。海藻施万氏菌是最近新发现的一种细菌性病原，与溶藻弧菌同属一科，但不同“属”，能够引起养殖鱼类的溃疡和死亡，危害巨大；而作为新发现的病原，常规方法很难快速正确地检测它。当前的病原细菌检测技术主要有以下二种：1，常规生化检测技术，它是将纯化后的细菌接种到含不同生化物质的培养基中，由于不同种的细菌代谢的物质不完全相同，与培养基中显色剂反应的结果也不同，将这些结果与标准菌株和文献记录结果对照，就可以得出结论。(参考文献：娄永新 王金良主编《实用临床细菌学检验与进展》1992 天津科技翻译出版公司)，这种方法结果比较准确但十分耗时，而且对新的种类的检测结果并不十分可靠；2，API-20E等快速细菌鉴定方法，它采用检测少数几个生化指标后统计分析得出鉴定结论，相对比较节约时间，但结果不太可靠。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测海藻施万氏菌的试剂盒，特别是提供一对海藻施万氏菌特异性引物VP₀₃和VP₀₄，并提供一种使用快速检测海藻施万氏菌的试剂盒快速测检和监测多种样品中海藻施万氏菌的方法，从而为健康养殖提供科学的依据。

本发明的主要原理为：试剂A和B将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，试剂C和D为多聚酶链式反应技术试剂，通过试剂D中所含的海藻施万氏菌特异DNA片段引物和试剂C中的热聚合酶等成分，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，由于我们设计的引物为海藻施万氏菌所特有，因此，如果样品中含有海藻施万氏菌，那么它的DNA的特异片段在经过扩增后，浓度将达到10⁸mol(克分子)以上，这样，在电泳和溴乙锭染色后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有海藻施万氏菌，则不能扩增到同样分子量的目的条带。

本发明的一种快速检测海藻施万氏菌的试剂盒，其特征是试剂包括：

(a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，

试剂A含有NaCl、Tris(三羟基甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)和TritonX-100(曲拉通X-100)，它们的浓度分别为：0.1-0.3M NaCl、1-100mM Tris(pH8.0)、0.1-10mM pH8.0 EDTA、0-20％Triton X-100；

试剂B含有溶菌酶和Tris(三羟基甲基氨基甲烷)，浓度分别为：1-10mg/ml溶菌酶和1-100mM pH8.0 Tris；

(b)PCR反应试剂：包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，

试剂C含有10倍PCR反应缓冲液、Taq酶(热聚合酶)和ddH₂O(灭菌双蒸水)，含量分别为2.5-5.0μl 10倍PCR反应缓冲液、0.1-0.5μl Taq酶(5个单位/μl)、18-35.5μl ddH₂O；

试剂D：包括特异引物对VP₀₃：特指5‘- agccgcaagagcctatcaagga

                   和VP₀₄：特指5‘- atccttattcaccggagtcttg

       dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)及MgCl₂，

含量分别为0.2-3μM VP₀₃和0.2-3M VP₀₄、20-200μM dNTP及0.5-10mM MgCl₂：

(c)电泳和显色试剂，包括试剂E和试剂F，

试剂E：为50倍TAE(电泳缓冲液)，含Tris-乙酸和EDTA，浓度分别为：0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA；

试剂F：0.8-2％琼脂糖+0.5-20μg/ml溴乙锭。

每管50μl反应试剂的优选组成为：试剂C：5.0μl 10×PCR Buffer，0.5μlTaq(5U/μl)，35.5μl ddH₂O，试剂D：4.0μl dNTP(2.5mM each)，3.0μl MgCl₂(25mM)，10pm VP₀₃，10pm VP₀₄。

试剂A为DNA提取缓冲液，为DNA的提取提供适宜的缓冲环境并抑制DNA的降解；试剂B为细胞裂解试剂，使细菌裂解并释放出DNA；试剂C为PCR反应预混试剂，为PCR反应试剂的主要成分之一，试剂D中的特异引物对VP₀₃和VP₀₄为进行PCR反应的特异引物和必须成分，也是PCR反应的主要成分，包含有本试剂盒最为关键的特异引物VP₀₃和VP₀₄；试剂E为50倍TAE(电泳缓冲液)，为样品电泳提供合适的pH值、离子强度等的缓冲体系；试剂F为电泳介质琼脂糖+显色剂溴乙锭。

使用快速检测海藻施万氏菌的试剂盒快速测检海藻施万氏菌的方法依次包括下列步骤：

(a).样品处理：取0.1-0.5克样品，用100-400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；

(b).DNA提取：用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-100μl试剂B混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破裂，释放出DNA；10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2倍(400-800μl)的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5-10分钟，10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中；即为DNA提取液；

(c).PCR扩增：以0.5-1μl提取的DNA作为PCR扩增的模板；取21-42μl试剂C与4-8μl试剂D混合；在热循环仪上对提取的DNA模板进行扩增，通过94℃-98℃解链2-5分钟；然后在93-95℃变性30秒-1分钟，56-60℃复性30秒-1分钟，72℃延伸30秒-1.5分钟，如此循环25-35次，最后在72℃保温8-12分钟，将海藻施万氏菌的特异片段增加到10⁸mol以上；

(d).电泳和显色检测：取5-10μl扩增后的样品，与2-6μl 0.25％溴酚蓝混合，0.8-1.2％琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条273核苷酸对的条带，如果有一条273bp的条带，说明样品有海藻施万氏菌感染或污染，反之则没有。

本发明的优点和积极效果：

本发明基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术(聚合酶链式反应技术)，相对其它的弧菌病原检测技术和其它的病原检测技术而言，本发明有几个显著的优点：首先，该方法检测十分快速，3-4小时即可得知检测结果，而其它方法则至少需要3天或一个星期以上；其次，该方法检测灵敏度极高，检测下限低至10个左右的细菌，其它方法必须要有一定时间的纯培养增殖达到10⁵后才能进行检测。本发明可以应用于多种样品的检测；可以检测养殖动物受海藻施万氏菌感染的情况，也可以监测养殖水体环境中海藻施万氏菌，还可以检测养殖饲料和鲜活饵料是否受海藻施万氏菌污染。

具体实施方式

下列实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。

实施例1：

按以下配方制作快速检测海藻施万氏菌的试剂盒：

试剂 A：0.1M NaCl，10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，5％Triton X-100

试剂B：10mg/ml溶菌酶，10mM Tris.Cl(pH8.0)

试剂C：5.0μl 10×PCR Buffer，0.5μl Taq(5U/μl)，35.5μl ddH₂O

试剂D：4.0μl dNTP(2.5mM each)，3.0μl MgCl₂(25mM)，

       20pm VP₀₃，20pm VP₀₄

试剂E：50×TAE

试剂F：琼脂糖(1％)+溴乙锭(0.5μg/ml)

按照以下程序进行检测：

1.样品处理和DNA的提取：取鱼组织约0.1-0.5克，在样品中加入400μl试剂A，灭菌牙签捣碎，12000g离心2分钟，弃上清，用350μl试剂A和50μl试剂B重新悬浮沉淀，混匀。室温放置5分钟，100℃水浴5分钟。冷却至室温，12000g离心10分钟。取上清。加入800μl无水乙醇，室温放置5分钟，12000g离心5分钟，彻底去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇挥发，将沉淀溶于30μl灭菌双蒸水，即为DNA提取液。

2.海藻施万氏菌的特异片段扩增

在一管试剂C中加入1μl DNA提取液，再加入8μl试剂D，10000g离心30秒。在PCR热循环反应仪上进行如下反应：

94℃加热变性4分钟；然后在95℃解链1分钟，58℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共循环35次；在72℃保温10分钟后停止反应。

3.电泳和显色检测：反应结束后，取5-10μl反应液，与4μl 0.25％溴酚蓝混合，用1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下检测，如果有一条273bp的条带，说明样品有海藻施万氏菌感染或污染；反之则没有。

实施例2：

按以下配方配制各种溶液：

试剂 A：0.3M NaCl，10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)，

试剂B：5mg/ml溶菌酶，10mM Tris.Cl(pH8.0)

试剂C：2.5μl 10×PCR Buffer，0.25μl Taq(5U/μl)，35.5μl ddH₂O

试剂D：2.0μl dNTP(2.5mM each)，1.5μl MgCl₂(25mM)，

10pm VP₀₃(0.5μl)，10pm VP₀₄(0.5μl)

试剂E：：50×TAE

试剂F：琼脂糖(1.2％)+溴乙锭(0.8μg/ml)

按照以下程序进行操作：

1.样品处理和DNA的提取

取鱼组织约0.1-0.5克，在样品中加入200μl试剂A，灭菌牙签捣碎，12000g离心2分钟，弃上清，用150μl试剂A和50μl试剂B重新悬浮沉淀，混匀。室温放置5分钟，100℃水浴1分钟。冷却至室温，12000g离心10分钟。取上清，加入400μl无水乙醇，室温放置5分钟，12000g离心5分钟，彻底去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇挥发，将沉淀溶于30μl灭菌双蒸水，即为DNA提取液。

2.海藻施万氏菌的特异片段扩增

在一管试剂C中加入1μl DNA提取液，再加入8μl试剂D，10000g离心30秒。在PCR热循环反应仪上进行如下反应：

94℃加热变性3分钟；然后在95℃解链45秒钟，60℃复性30秒钟，72℃延伸30秒钟，共循环30次；在72℃保温10分钟后停止反应。

3.电泳和显色检测：反应结束后，取5-10μl反应液，与4μl 0.25％溴酚蓝混合，用1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下检测，如果有一条273bp的条带，说明样品有海藻施万氏菌感染或污染；反之则没有。

Claims (3)

1.一种快速检测海藻施万氏菌的试剂盒，其特征是试剂包括：

(a)DNA提取试剂：含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B，

试剂A含有NaCl、三羟基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和曲拉通X-100，它们的浓度分别为：0.1-0.3M、1-100mM pH8.0、0.1-10mM pH8.0和0-20％；

试剂B含有溶菌酶和三羟基甲基氨基甲烷，浓度分别为1-10mg/ml和1-100mMpH8.0；

(b)PCR反应试剂：包括反应预混试剂C和反应引物试剂D，

试剂C含有10倍PCR反应缓冲液、热聚合酶和灭菌双蒸水，含量分别为2.5-5.0μl、0.5-2.5个单位和18-35.5μl；

试剂D：包括特异引物对VP₀₃和VP₀₄、dNTP及MgCl₂，含量分别为0.2-3μM和0.2-3μM、20-200μM及0.5-10mM；

特异引物VP₀₃特指5‘-agccgcaagagcctatcaagga；VP₀₄特指5‘-atccttattcaccggagtcttg；

(c)电泳和显色试剂，包括试剂E和试剂F，

试剂E：为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；

试剂F：0.8-2％琼脂糖和0.5-20μg/ml溴乙锭。

2.根据权利要求1中所述的一种快速检测海藻施万氏菌的试剂盒，其特征是每管50μl反应试剂的配方为5.0μl 10倍PCR反应缓冲液，2.5单位热聚合酶，35.5μl灭菌双蒸水，4.0μl 2.5mM dNTP，3.0μl 25mM MgCl₂，10pm VP₀₃，10pm VP₀₄。

3.一种使用根据权利要求1或2中所述的快速检测海藻施万氏菌的试剂盒快速检测海藻施万氏菌的方法，依次包括下列步骤：

(a).样品处理：取0.1-0.5克样品，用100-400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000-12000g离心2-5分钟，弃上清；

(b).DNA提取：用100-300μl试剂A再次悬浮沉淀，并加入20-100μl试剂B混匀，室温放置2分钟以上，再在沸水浴中保温1-10分钟，使细胞完全破裂，释放出DNA；10000-12000g离心8-10分钟，取上清并加入上清体积2倍即400-800μl的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5-10分钟，10000-12000g离心3-8分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10-50μl灭菌双蒸水中；即为DNA提取液；

(c).PCR扩增：以0.5-1μl提取的DNA作为PCR扩增的模板；取21-42μl试剂C与4-8μl试剂D混合；在热循环仪上对提取的DNA模板进行扩增，通过94℃-98℃解链2-5分钟；然后用93-95℃变性30秒-1分钟，56-60℃复性30秒-1分钟，72℃延伸30秒-1.5分钟，如此循环25-35次，最后在72℃保温8-12分钟，将海藻施万氏菌的特异片段增加到108mol以上；

(d).电泳和显色检测：取5-10μl扩增后的样品，与2-6μl 0.25％溴酚蓝混合，0.8-1.2％琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条273核苷酸对的条带，如果有一条273bp的条带，说明样品有海藻施万氏菌感染或污染，反之则没有。