CN100487134C - 快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测鲨鱼弧菌的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括增菌培养基即试剂A；聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂B和试剂C；电泳和显色试剂，包括试剂D、试剂E和试剂F。本发明还提供使用这种试剂盒快速检测鲨鱼弧菌的方法，其优点是快速，准确，灵敏度高；本发明提供的引物对于不含鲨鱼弧菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。本发明可以应用于多种样品的检测，可以检测养殖动物受鲨鱼弧菌感染的情况，也可以监测养殖水体环境中病原鲨鱼弧菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒，以及使用该试剂盒快速检测鲨鱼弧菌的方法。
背景技术
弧菌是海水养殖动物的主要病原，现已查明鲨鱼弧菌是引起近江牡蛎大量死亡的病原之一，也能引起海水养殖鱼类疾病，该菌亦存在于天然海水中。监测养殖动物和海水中的鲨鱼弧菌是防治其引起疾病的重要措施。目前鉴定弧菌的技术有：1、经典的生理生化鉴定方法，该法繁琐、耗时、且要求操作人员有良好的专业素养；2、细菌快速自动鉴定系统，该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；3、基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术(聚合酶链式反应技术)，相对上述检测技术而言，具有快速、简捷、灵敏等特点，但目前还未见检测鲨鱼弧菌的PCR技术及检测试剂盒专利。
发明内容
为了解决现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒，特别是提供一对鲨鱼弧菌特异性引物VcS和VcA，使用该试剂盒可快速检测多种样品中是否存在鲨鱼弧菌，从而为健康养殖提供科学依据。本发明建立了快速灵敏准确检测鲨鱼弧菌的PCR检测技术并研制了检测试剂盒，以满足生产中简便、快捷和准确的需要。
本发明的另一目的在于提供上述检测试剂盒检测鲨鱼弧菌的方法。
本发明的目的是由下述技术方案实现的：一种快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒，包括增菌培养基、聚合酶链式反应试剂、电泳和显色试剂：
(a)试剂A即增菌培养基：含胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和琼脂粉，其重量比为5:3:1:18。
(b)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂B和试剂C。
试剂B含有10倍聚合酶链式反应缓冲液(含MgCl2 15mM)、特异引物对VcS和VcA、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和灭菌双蒸水，含量分别为2.5～5.0μl、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μMeach)、0.5～1.0μl(5mg/ml)和19.375～38.75μl。
试剂C：Taq酶，0.125～0.25μl(5个单位/μl)。
(c)电泳和显色试剂，包括试剂D、试剂E和试剂F。
试剂D：为50倍TAE(电泳缓冲液)，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；
试剂E：为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝和二甲苯青FF；
试剂F：0.8～2％(W/V)琼脂糖+0.5～1μg/ml溴化乙锭。
为了更好地实现本发明，所述特异引物对VcS和VcA如下：
特异引物VcS指5′ATCCGGCAATGCAGTGTTC3′；
特异引物VcA指5′ACCTACCCGCCTCCTTACGC3′。
所述聚合酶链式反应试剂的优选组成为：试剂B：5.0μl 10×PCR Buffer，1.0μl VcS，1.0μl VcA，1.0μl dNTP(10mM each)，1.0μl BSA，38.75μl ddH2O；试剂C：0.25μl Taq酶。
使用快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒检测鲨鱼弧菌的方法，包括如下步骤：
(a)增菌：取2.7g试剂A加过滤海水至100ml，调PH值为7.2～7.4，121℃灭菌15～20min后按常规方法制作细菌培养平板。
无菌操作取0.1～0.5克样品(待检水产动物组织或水样等，要避免污染)，匀浆(需要时)后涂布于用试剂A即增菌培养基所制平板，30℃培养12～18小时。
(b)PCR扩增：挑取平板上各种菌苔于100μl灭菌蒸馏水中重悬混匀后取1～2μl作为PCR扩增的模板；取23.875～47.75μl试剂B与0.125～0.25μl试剂C混合；在热循环仪上通过95℃裂解细菌并解链5分钟；然后用94℃变性30～60秒，55～58℃复性30～60秒钟，72℃延伸30～90秒钟，如此循环25～35次，最后在72℃保温8～12分钟，将鲨鱼弧菌的特异片段增加到108mol以上。
(c)电泳和显色检测：取5～10μl扩增后的样品，与1～2μl试剂E(凝胶加样缓冲液)混合，W/V为0.8～1.2％的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条470核苷酸对的条带，如果有一条470bp的条带，说明样品中含有鲨鱼弧菌，反之则没有鲨鱼弧菌。
本发明的主要原理为：试剂B和C为多聚酶链式反应试剂，通过试剂B中所含鲨鱼弧菌DNA片段特异引物和试剂C中的热聚合酶等成分，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增，由于本发明所设计引物为鲨鱼弧菌特异性引物，因此，如果样品中含有鲨鱼弧菌，那么它的DNA特异片段在经过扩增后，浓度将达到108mol(克分子)以上，这样，在电泳和溴化乙锭染色后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有鲨鱼弧菌存在，则不能扩增到同样分子量的目的条带。
本发明与其它弧菌病原检测技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明方法检测方便，省去了通常方法中要提取细菌DNA的步骤；
(2)本发明方法检测灵敏度极高，检测下限低至10～102个细菌；
(3)本发明提供的引物对于不含鲨鱼弧菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性；
(4)本发明可以应用于多种样品的检测，可以检测养殖动物受鲨鱼弧菌感染情况，也可以监测养殖水体环境中鲨鱼弧菌。
附图说明
图1为鲨鱼弧菌快速检测试剂盒特征引物特异性检验实验结果图。
图2为鲨鱼弧菌快速检测试剂盒灵敏度实验结果图。
具体实施方式
下面实施例对进一步对本发明的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1按以下配方制作快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒：
(a)试剂A(增菌培养基)：含有胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和琼脂粉，其重量比为5:3:1:18。
(b)聚合酶链式反应(25μl体系)试剂：包括反应预混试剂B和试剂C，
试剂B含有10倍聚合酶链式反应缓冲液(含MgCl2 15mM)、特异引物对VcS和VcA、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和灭菌双蒸水，含量分别为2.5μl、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μMeach)、0.5μl(5mg/ml)和19.375μl。
试剂C：Taq酶，0.125μl(5个单位/μl)。
(c)电泳和显色试剂，包括试剂D、试剂E和试剂F。
试剂D：为50倍TAE(电泳缓冲液)，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；
试剂E：为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝及二甲苯青FF；
试剂F：1％(W/V)琼脂糖+0.5μg/ml溴化乙锭。
按照以下程序快速检测鲨鱼弧菌的方法：
(a)样品增菌处理：取2.7g试剂A加过滤海水至100ml，调PH值为7.2～7.4，121℃灭菌20min后按常规方法制作细菌培养平板。
无菌操作取近江牡蛎消化盲囊组织约0.1克，匀浆后涂布于所制平板，30℃培养16小时；
(b)PCR扩增：取23.875μl试剂B与0.125μl试剂C混合；用灭菌牙签挑取平板上各种菌苔于100μl灭菌蒸馏水中重悬混匀，取1μl作为PCR模板加入上述混合液中；在热循环仪上对进行扩增，通过95℃裂解细菌并解链5分钟，然后用94℃变性20秒，57℃复性40秒，72℃延伸45秒钟，如此循环30次，最后在72℃保温10分钟。
(c)电泳和显色检测：取5μl扩增后的样品，与1μl试剂E(凝胶加样缓冲液)混合，1％琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条470核苷酸对的条带，如果有一条470bp的条带，说明样品中含有鲨鱼弧菌，反之则没有。
实施例2按以下配方制作快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒：
(a)试剂A(增菌培养基)：含有胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和琼脂粉，其重量比为5:3:1:18。
(b)聚合酶链式反应(50μl体系)试剂：包括反应预混试剂B和试剂C。
试剂B含有10倍聚合酶链式反应缓冲液(含MgCl2 15mM)、特异引物对VcS和VcA、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和灭菌双蒸水，含量分别为5.0μl、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μMeach)、1.0μl(5mg/ml)和38.75μl。
试剂C：Taq酶，0.25μl(5个单位/μl)。
(c)电泳和显色试剂，包括试剂D、试剂E和试剂F。
试剂D：为50倍TAE(电泳缓冲液)，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；
试剂E：为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝及二甲苯青FF；
试剂F：1％(W/V)琼脂糖+0.5μg/ml溴化乙锭。
按照以下程序快速检测鲨鱼弧菌的方法：
(a)样品增菌处理：取2.7g试剂A加过滤海水至1L，调PH值为7.2～7.4，121℃灭菌20min后按常规方法制作细菌培养平板。
无菌操作取牡蛎血液约0.1克，涂布于所制平板，30℃培养16小时。
(b)PCR扩增：取47.75μl试剂B与0.25μl试剂C混合；用灭菌牙签挑取平板上各种菌苔于100μl灭菌蒸馏水中重悬混匀，取2μl作为PCR模板加入上述混合液中；在热循环仪上通过95℃裂解细菌并解链5分钟；然后用94℃变性30秒，57℃复性45秒，72℃延伸60秒钟，如此循环30次，最后在72℃保温10分钟。
(c)电泳和显色检测：取8μl扩增后的样品，与2μl试剂E(凝胶加样缓冲液)，1％琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条470核苷酸对的条带，如果有一条470bp的条带，说明样品中含有鲨鱼弧菌，反之则没有。
如图1所示，为鲨鱼弧菌快速检测试剂盒特征引物特异性检验实验结果，其中M：DNAmarker，1：副溶血弧菌，2：哈维氏弧菌，3、4、5：三株不同来源的溶藻弧菌，6：鲨鱼弧菌，7：解蛋白弧菌，8：需钠弧菌，9：坎氏弧菌，10：灿烂弧菌，11：河流弧菌，12：创伤弧菌，图1显示鲨鱼弧菌快速检测试剂盒特征引物只能对鲨鱼弧菌PCR扩增出目的片段，其特异性是非常高的。
如图2所示，为鲨鱼弧菌快速检测试剂盒灵敏度实验结果，其中M：DNAmarker，1～8：25μl体系PCR结果，每管加入模板量(鲨鱼弧菌数/管，平板计数法)；1：5×107，2：5×106，3：5×105，4：5×104，5：5×103，6：5×102，7：5×101，8：5×100，图2显示鲨鱼弧菌快速检测试剂盒在101级时就可以检测出结果，结合增菌步骤一般在所取检测样品中只要含有数个鲨鱼弧菌就可检出。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒及其检测方法
<130>20
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>鲨鱼弧菌特异引物VcS
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>鲨鱼弧菌特异引物VcA
<400>2
Claims (3)
1、一种快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒，其特征在于包括增菌培养基、聚合酶链式反应试剂、电泳和显色试剂：
(a)增菌培养基即试剂A：含胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和琼脂粉，其重量比为5：3：1：18；
(b)聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂B和试剂C；
试剂B含有10倍聚合酶链式反应缓冲液、特异引物对VcS和VcA、dNTP、小牛血清蛋白和灭菌双蒸水，含量分别为2.5～5.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl和19.375～38.75μl；
试剂C：Taq酶，0.125～0.25μl；
(c)电泳和显色试剂，包括试剂D、试剂E和试剂F；
试剂D：为50倍TAE，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；
试剂E：为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝和二甲苯青FF；
试剂F：0.8～2％琼脂糖+0.5～1μg/m1溴化乙锭；
所述特异引物对VcS和VcA如下：
特异引物VcS指5′ATCCGGCAATGCAGTGTTC3′；
特异引物VcA指5′ACCTACCCGCCTCCTTACGC3′。
2、根据权利要求1所述的一种快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒，其特征在于：所述聚合酶链式反应试剂的组成为：试剂B：5.0μl10×聚合酶链式反应缓冲液，1.0μl VcS，1.0μl VcA，1.0μl dNTP，1.0μl小牛血清蛋白，38.75μl灭菌双蒸水；试剂C：0.25μl Taq酶。
3、一种使用根据权利要求1所述的快速检测鲨鱼弧菌的试剂盒检测鲨鱼弧菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(a)增菌：取2.7g试剂A加过滤海水至100ml，调PH值为7.2～7.4，121℃灭菌15～20min后按常规方法制作细菌培养平板；无菌操作取0.1～0.5克样品，匀浆后涂布于用试剂A即增菌培养基所制平板，30℃培养12～18小时；
(b)PCR扩增：挑取平板上各种菌苔于100μl灭菌蒸馏水中重悬混匀后取1～2μl作为PCR扩增的模板；取23.875～47.75μl试剂B与0.125～0.25μl试剂C混合；在热循环仪上通过95℃裂解细菌并解链5分钟；然后用94℃变性30～60秒，55～58℃复性30～60秒钟，72℃延伸30～90秒钟，如此循环25～35次，最后在72℃保温8～12分钟，将鲨鱼弧菌的特异片段增加到108mol以上；
(c)电泳和显色检测：取5～10μl扩增后的样品，与1～2μl试剂E混合，W/V为0.8～1.2％的琼脂糖电泳和显色，在紫外光下检测是否有一条470核苷酸对的条带，如果有一条470bp的条带，说明样品中含有鲨鱼弧菌，反之则没有鲨鱼弧菌；
所述样品为水样。
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| 菌落PCR方法的建立及其与常规PCR方法的比较. 徐丽，蔡俊鹏.华南理工大学学报，第32卷第5期. 2004 |
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