CN116660349A - Cu-Im/CF微电极的制备及其对多巴胺的电化学检测应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学生物传感器领域，提供了Cu‑ImCF微电极的制备及其对多巴胺的电化学检测应用。将1‑乙基‑3‑甲基咪唑(EMI)通过电化学聚合的方式聚合在碳纤维上，并通过旋蒸将硝酸铜与聚咪唑进行配位，成功制备了有Cu‑Im纳米酶修饰的碳纤维材料，并将其制备成微电极用于多巴胺的电化学检测。制备的Cu‑Im碳纤维微电极与裸的碳纤维微电极相比，用Cu‑Im碳纤维微电极检测多巴胺获得了明显的多巴胺氧化信号，并且具备良好的选择性、稳定性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物传感器领域，特别涉及一种Cu-Im/CF微电极的制备及其对多巴胺的电化学检测应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
多巴胺(DA)，也称作3-羟酪胺，是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质。帕金森病是一种神经变性疾病，其主要病理特征是黑质多巴胺能神经元的损失。多巴胺神经元的损失导致多巴胺水平下降，导致了帕金森病的症状，如僵硬、震颤、运动迟缓和姿势不稳等。精神分裂症是一种复杂的精神疾病，精神分裂症患者可能存在多巴胺过度活跃的情况，导致了症状的出现，如幻觉、妄想和思维紊乱等。ADHD是一种儿童神经发育疾病，大脑中的多巴胺神经元可能在ADHD患者中活跃过度，导致了多巴胺水平的升高，从而影响了大脑中的调节功能。因此，检测多巴胺对研究和治疗上述脑疾病具有重大意义。
目前已有多种方法应用于多巴胺的检测。FSCV、安培法、荧光成像法、MRS、PET、MD等。其中由于安培法成本低、操作简单，以及有出色的时间分辨率和灵敏度而备受关注。其原理是利用将保持恒电位的碳纤维微电极放置在细胞附近，电活性神经递质在电极表面发生氧化还原反应会产生法拉第电流，通过电流响应可定量检测电活性物质的浓度，其优势在于有亚毫秒级的时间分辨率和高灵敏度。
电极选择方面，碳纤维微电极由于其体积小、灵敏度高、操作简便、低成本以及良好的生物相容性，并且在植入过程中不会对生物组织造成严重的损害的特点，广泛的应用于体内的生物分析。但单纯的运用碳纤维电极由于难以区分具有相似氧化还原电位的分子，使其选择性较低，然而通过电极表面的修饰可以提高其选择性。
修饰材料方面，纳米酶是具有类酶活性的纳米材料，因其催化活性可调、在恶劣环境中仍能保持高稳定性与催化活性、组成和结构设计灵活，以及其良好的生物相容性等多种独特优势。因此可通过在材料上引入不同的纳米酶，从而显著提高材料的选择性、催化性能以及降低检测限等等。但目前行业内尚未找到能够有效提高安培法检测多巴胺的选择性、灵敏度和检测限的纳米酶修饰的碳纤维材料。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种Cu-Im/CF微电极的制备及其对多巴胺的电化学检测应用。在碳纤维上电聚合EMI，再与硝酸铜配位，获得原位合成了Cu-Im纳米酶的碳纤维材料，将其制成微电极，运用安培法，在体外模拟脑脊液条件下实现了多巴胺的检测，并具有良好的选择性、灵敏度、检测限等。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种Cu-Im/CF微电极的制备方法，包括：
将碳纤维除浆，待用；
取1-乙基-3-甲基咪唑溶于乙腈溶液中，得到EMI乙腈溶液；
将除浆后的碳纤维分散在铜片上，使之在铜片上并联，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，采用恒电位法使单体在碳纤维表面进行电聚合，得到电聚合有咪唑的碳纤维；
将所述电聚合有咪唑的碳纤维洗涤，置于硝酸铜溶液中旋蒸，反应完成后，取出，洗涤，干燥，得到Cu-Im纳米酶修饰的碳纤维材料；
将所述Cu-Im纳米酶修饰的碳纤维材料制成碳纤维微电极，即得；
所述EMI乙腈溶液的浓度为0.05～0.2M。
本发明利用聚咪唑与硝酸铜配合，来模拟Cu催化位点，有效提高了安培法检测多巴胺的选择性、灵敏度和检测限等。
同时，本发明利用原位合成法修饰电极表面，原位合成法可让电极表面上催化颗粒空间隔离，产生更高的质量传递，这不仅显著促进了材料的利用，而且还使催化粒子的活性以及电化学性能得到更准确的测量。
本发明的第二个方面，提供了上述的方法制备的Cu-Im/CF微电极。
本发明的第三个方面，提供了一种电化学传感器，以上述的Cu-Im/CF微电极为工作电极。
本发明的第四个方面，提供了上述的Cu-Im/CF微电极在电化学检测多巴胺中的应用。
本发明的有益效果
(1)本发明在碳纤维上通过电聚合方法辅助在碳纤维上原位合成了Cu-Im纳米酶，并将其制造成Cu-Im/CF微电极，且优化了Cu-Im/CF微电极的合成条件，即将碳纤维在1.3V电位下0.1M EMI的乙腈溶液中进行EMI的电聚合。随后在体外模拟脑脊液的环境下研究了Cu-Im/CF微电极对多巴胺进行电化学检测的可行性。结果表明，Cu-Im纳米酶能有效的催化多巴胺的氧化反应，制备的Cu-Im/CF微电极能在体外模拟脑脊液的条件下明显提高碳纤维对多巴胺检测的电流响应，且能有效降低脑脊液中相应的内源性电活性物质的干扰，有效提高了体外多巴胺的电化学检测的灵敏度、选择性、时间分辨率以及制备的Cu-Im/CF微电极具有良好的稳定性和重现性。综上所述，本发明制备的Cu-Im/CF微电极有望进一步应用于脑内多巴胺的电化学检测。
(2)本发明制备方法简单、实用性强，易于推广。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为(a)CF(b)Cu-Im/CF的SEM及其相对应的元素分布图(c)C(d)N(e)Cu；
图2为未修饰的碳纤维微电极在0.1M EMI的乙腈溶液中的CV曲线；
图3为在(a)0.05M、(b)0.075M、(c)0.1M、(d)0.2M的EMI乙腈溶液下进行电聚合的材料所制备的碳纤维微电极在氮气饱和aCSF中连续滴加10μM多巴胺的CV曲线。施加的电压：0.2V vs.Ag/AgCl；
图4为从(a)至(g)为0.9V、1.0V、1.1V、1.2V、1.3V、1.4V、1.5V电压下0.1M EMI的乙腈溶液中进行EMI的电聚合合成的材料所制备成的微电极在氮气饱和aCSF中连续滴加10μM多巴胺的CV曲线。施加的电压：0.2Vvs.Ag/AgCl；
图5为A未修饰的碳纤维电极在含(a)20μM DA(b)0μM DA的脑脊液中的CV曲线；B修饰后的碳纤维电极在含(a)20μM DA(b)0μM DA的脑脊液中的CV曲线；C(a)修饰后的碳纤维微电极与(b)未修饰的碳纤维微电极在20μM DA的脑脊液中的CV曲线；D(a)修饰后的碳纤维微电极与(b)未修饰的碳纤维微电极在0μM DA的脑脊液中的CV曲线；
图6为(a)未修饰的碳纤维微电极与(b)修饰后的碳纤维微电极在氮气饱和aCSF中连续滴加10μM DA的CA曲线。施加的电压：0.2V vs.Ag/AgCl；
图7为修饰的碳纤维电极滴加20μM DA的时间响应曲线；
图8为(A)Cu-Im/CF微电极在氮气饱和下的20μM多巴胺的aCSF中的不同扫速(a)到(m)为10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300mV·s-1下的CV曲线及(B)电流扫速的对应关系曲线；
图9为(A)Cu-Im/CF微电极对于在氮气饱和下的aCSF中连续滴加不同浓度的多巴胺的电流响应曲线，施加电位：0.2V vs.Ag/AgCl；(B)电流与多巴胺浓度的对应曲线；
图10为Cu-Im/CF微电极在氮气饱和的aCSF中连续滴加相同浓度的多巴胺、DOPAC、肾上腺素、H2O2、多巴胺的CA曲线。施加的电压：0.2V vs.Ag/AgCl
图11为Cu-Im/CF微电极在氮气饱和的aCSF中滴加20μM的多巴胺后连续监测1h的电流响应曲线。
图12为相同条件下制备的Cu-Im/CF微电极对相同浓度的多巴胺的电流响应。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
一种Cu-Im/CF微电极的制备方法，包括：
将碳纤维除浆，待用；
取1-乙基-3-甲基咪唑溶于乙腈溶液中，得到EMI乙腈溶液；
将除浆后的碳纤维分散在铜片上，使之在铜片上并联，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，采用恒电位法使单体在碳纤维表面进行电聚合，得到电聚合有咪唑的碳纤维；
将所述电聚合有咪唑的碳纤维洗涤，置于硝酸铜溶液中旋蒸，反应完成后，取出，洗涤，干燥，得到Cu-Im纳米酶修饰的碳纤维材料；
将所述Cu-Im纳米酶修饰的碳纤维材料制成碳纤维微电极，即得；
所述EMI乙腈溶液的浓度为0.05～0.2M。
在一些实施例中，所述电聚合的点位为0.9V～1.5V。
在一些实施例中，所述电聚合的时间为15～20min。
在一些实施例中，所述硝酸铜溶液的浓度为1～1.5M。
在一些实施例中，所述旋蒸的时间为30～40min。
在一些实施例中，所述洗涤采用水。
在一些实施例中，所述干燥的时间为3～4h。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1电极材料的制备
1)碳纤维的除浆：把碳纤维剪短成5cm左右的短簇，并在丙酮溶液中浸泡48h，之后在超纯水中超声以此清洗碳纤维，洗涤三次后放入真空干燥箱中，于85℃干燥3h。
2)碳纤维表面电聚合咪唑：称取适量1-乙基-3-甲基咪唑(EMI)于50ml乙腈溶液中配置成为0.05M、0.075M、0.1M、0.2M的EMI的乙腈溶液。将除浆后的碳纤维充分分散在打磨好的光亮的铜片上，使之在铜片上并联(即：铜片和电解液是电路上的两个节点，每一根碳纤维相当于一个电流支路。碳纤维之间相互不交错)，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，EMI的乙腈溶液为电解液，采用恒电位法在0.9V、1.0V、1.1V、1.2V、1.3V、1.4V、1.5V电位下使单体在碳纤维表面发生氧化聚合，聚合时间15min。
3)铜配位：将上述电聚合后的碳纤维用纯水洗涤并剪去未浸入电解液进行电聚合的部分后，置于硝酸铜(1M，5ml)中旋蒸30min，随后取出碳纤维，用纯水洗涤表面残留的硝酸铜后置于真空干燥箱干燥3h，得到Cu-Im/CF材料。
实施例2碳纤维微电极的制备
本发明将实施例1制备的Cu-Im/CF材料与直径为100μm，长为10cm的铜丝用导电银胶相连。待导电银胶干燥后，从玻璃电极的一端穿入使碳纤维一端到达玻璃电极的中间部位(外径：1.5mm，内径：1.10mm，长：10cm)，从另一端穿入另一根与铜丝粘好的碳纤维，将玻璃电极的两端的铜丝固定住，将穿了碳纤维的毛细玻璃管用微电极拉制仪拉制成两个。将1mL的注射器在酒精灯的烧制下拉制成前端足够细长的细管，然后用注射器吸取单组份室温硫化硅橡胶，在显微镜下从拉制好的玻璃电极的尾端进入，将尖端封住，室温下自然干燥。在显微镜下，将尖头的碳纤维切割至300μm，得到Cu-Im/CF微电极。
实施例3人造脑脊液的配制
将NaCl(126mM)、KCl(2.4mM)、KH2PO4(0.5mM)、MgCl2(0.85mM)、NaHCO3(27.5mM)、Na2SO4(0.5mM)、以及CaCl2(1.1mM)在超纯水中溶解，然后用浓盐酸和NaOH溶液调pH至7.4。用其作为体外电化学的电解质。
实施例4性能测试
1)电极材料的表征
扫描电子显微镜(SEM)：取多根未修饰的碳纤维和Cu-Im/CF用导电胶粘在载样台上，进样，抽真空，发射加速电压20KV，进行材料表面的微观表征。
2)微电极对多巴胺的电化学检测
电化学检测使用CHI760E电化学工作站，采用传统的三电极体系，以制备的碳纤维微电极(Cu-Im/CF微电极)为工作电极、Ag/AgCl(饱和氯化钾)为参比电极以及铂丝为对电极。利用循环伏安法(Cyclic Voltammetry，CV)和计时电流法(Chronoamperometry，CA)研究人造脑脊液(aCSF)中多巴胺在Cu-Im/CF微电极上的电化学行为和电流响应。
测试结果表明：
1)Cu-Im/CF的表征
为观察Cu-Im/CF的表面形貌，本发明对其用扫描电子显微镜(SEM)进行了表征。从图1可以看出碳纤维表面有许多沟壑，而修饰后的材料沟壑明显变浅了，说明本发明在碳纤维上修饰了薄薄一层的Cu-Im纳米酶。图1表明，C、N、Cu元素在Cu-Im/CF中是存在且分布是相对均匀的。初步证明了本发明的材料的原位合成是成功的。
2)聚合电位窗口的确定
为测试碳纤维在EMI的乙腈溶液中的聚合电位，本发明将一根裸的碳纤维制备成微电极将其在0.1M的EMI乙腈溶液中利用CV来初步确定EMI的聚合电位。结果如图2所示，从图2中可以明显看出，聚合的氧化峰在0.9V-1.5V之间。
3)单体浓度的优化
碳纤维在EMI的乙腈溶液中进行电聚合时，EMI的浓度是影响碳纤维上EMI电聚合的一个重要因素。因此，本发明进行了浓度的优化工作，即配制0.05M、0.075M、0.1M、0.2M的EMI的乙腈溶液，进行EMI的电聚合，并分别用合成的材料对多巴胺进行了CA的检测。如图3所示，在0.05M、0.075M、0.1M的EMI乙腈溶液下进行电聚合的材料所制备的碳纤维微电极对多巴胺的电流响应是在不断上升的，而0.1M、0.2M的EMI乙腈溶液下进行电聚合的材料所制备的碳纤维微电极对多巴胺的电流响应基本持平，由此可得碳纤维在0.1M的EMI乙腈溶液中进行EMI的电聚合是最佳的，浓度过低则碳纤维上不能充分的聚合上EMI，浓度过高则造成EMI的浪费。
4)电聚合电位的优化
同样，碳纤维材料在0.1M EMI的乙腈溶液中电聚合的电位也是影响EMI在碳纤维上聚合的关键因素，因而对于EMI电聚合的电位优化是至关重要的，因此本发明进行了对电聚合电位的优化工作。如图4所示，本发明分别在0.9V、1.0V、1.1V、1.2V、1.3V、1.4V、1.5V电位下对碳纤维材料进行EMI的电聚合，然后分别用合成的材料对多巴胺进行了CA的检测，可以看出在0.9V、1.0V、1.1V、1.2V、1.3V电位下进行电聚合的材料制备的微电极对多巴胺的电流响应是在不断增加的，而在1.3V、1.4V、1.5V电位下进行电聚合的材料制备的微电极对多巴胺的电流响应下降，说明1.3V电位是碳纤维材料进行EMI的电聚合的最佳电位。
5)多巴胺在Cu-Im/CF微电极上的电化学行为研究
采用CV以及CA研究了未修饰的碳纤维微电极以及在0.1M EMI乙腈溶液中和1.3V电位下电聚合制备的Cu-Im/CF微电极在氮气除氧20min后的人造脑脊液(aCSF，pH＝7.4)中对多巴胺的电催化性能。
如图5中A和B，未修饰和修饰后的碳纤维微电极在不含多巴胺与含20μM多巴胺的CV对比，表明微电极对多巴胺都有一定的催化活性。如图5中C和D，在含有20μM的多巴胺与不含多巴胺的脑脊液中，修饰与未修饰的碳纤维微电极的CV对比，可以看出修饰后的碳纤维微电极对多巴胺有着更明显的氧化峰，这表明本发明制备的Cu-Im/CF微电极对多巴胺有着更高的催化活性。
从图6中可以看出修饰后的碳纤维微电极在滴加多巴胺后能有明显的电流响应，而与之相反，未修饰的碳纤维微电极在滴加相同浓度的多巴胺后的电流响应几乎没有，这也表明修饰后的碳纤维微电极对多巴胺有着更高的催化活性。
如图7，着重观察了第一次加入20μM DA时的电流时间响应，可以看出在第100s加入DA后，经过了接近2s电流响应达到一个比较稳定的数值，这表明本发明制备的Cu-Im/CF微电极具有良好的时间分辨率。
综上所述，可以表明本发明成功的在碳纤维上合成了具有类似多酚氧化酶催化中心的纳米酶。
之后本发明在氮气饱和的aCSF(pH＝7.4)中，多巴胺的浓度为20μM时，研究了不同扫速对Cu-Im/CF微电极催化多巴胺氧化反应的催化活性的影响。如图8所示，同一根Cu-Im/CF微电极在不同扫速(a)10、(b)25、(c)50、(d)75、(e)100、(f)125、(g)150、(h)175、(i)200、(j)225、(k)250、(l)275、(m)300mV·s-1下的CV曲线对比，结果显示，随着扫速的增加氧化峰电流增大，且电流与扫速成正比关系，说明电极上的反应主要是由表面吸附过程控制。
6)标准曲线的建立
图9中A为在0.1M EMI的乙腈溶液中于1.3V电位电聚合EMI的材料所制备的Cu-Im/CF微电极，在0.2V电位下向氮气饱和的连续搅拌的aCSF(pH＝7.4)中连续滴加不同浓度的多巴胺的计时电流i-t曲线。从图9中可以看出随着多巴胺的不断加入，电流响应出现阶梯状上升的趋势且电流信号能很快的达到平衡，当滴加的多巴胺的浓度增大时，相应的电流响应也会增大。图9中B是对应的Cu-Im/CF微电极的电流与浓度关系曲线，从图9中B可以得到制备的碳纤维微电极在低浓度和高浓度的多巴胺中有不同的线性关系，低浓度中检测范围为0.0500μM-77.7μM，线性关系为y＝1.07x+1.03，检出限为0.0204μM；高浓度中检测范围为77.7μM-0.378mM，线性关系为y＝0.588x+42.2，检出限为7.84μM。通过表1可以看出，本发明制备的Cu-Im/CF微电极的检测范围和检测限对比于其他传感器相当甚至性能更优。
表1基于微电极电化学检测多巴胺的性能对比
7)选择性、稳定性以及重现性
由于脑中具有多种内源性电活性物质，如DPOAC、肾上腺素、H2O2等很容易在微电极上被电化学氧化还原，可能会影响多巴胺的检测。为验证本发明制备的Cu-Im/CF微电极的选择性，本发明利用计时电流法(i-t曲线)对多巴胺(20μM)以及同浓度的干扰物质进行连续滴加检测，滴加顺序为多巴胺、DOPAC、肾上腺素、H2O2、多巴胺。如图10所示，与多巴胺的电流响应相比，DOPAC、肾上腺素以及H2O2几乎没有电流响应，说明了本发明制备的Cu-Im/CF微电极对多巴胺的检测具有良好的选择性。
如图11所示，对所制备的Cu-Im/CF微电极进行了近1h的对多巴胺的连续监测，以此来评估Cu-Im/CF微电极对多巴胺监测的稳定性，从图11中可以看出Cu-Im/CF微电极在滴加多巴胺后的电流响应由于溶液达浓度平衡需要一段时间出现短暂的下降后，一直保持较为平稳的状态，说明本发明制备的Cu-Im/CF微电极对多巴胺的检测具有良好的稳定性。
为了评估本发明所制备的Cu-Im/CF微电极平台的重现性，将5个相同条件下制备的Cu-Im/CF微电极对相同浓度多巴胺进行检测。实验结果如图12所示，5个电极的电流响应的相对标准偏差为2.37％，这个结果表明本发明所开发的Cu-Im/CF微电极平台具有可接受区间的重现性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种Cu-Im/CF微电极的制备方法，其特征在于，包括：
将碳纤维除浆，待用；
取1-乙基-3-甲基咪唑溶于乙腈溶液中，得到EMI乙腈溶液；
将除浆后的碳纤维分散在铜片上，使之在铜片上并联，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，采用恒电位法使单体在碳纤维表面进行电聚合，得到电聚合有咪唑的碳纤维；
将所述电聚合有咪唑的碳纤维洗涤，置于硝酸铜溶液中旋蒸，反应完成后，取出，洗涤，干燥，得到Cu-Im纳米酶修饰的碳纤维材料；
将所述Cu-Im纳米酶修饰的碳纤维材料制成碳纤维微电极，即得；
所述EMI乙腈溶液的浓度为0.05～0.2M。
2.如权利要求1所述的Cu-Im/CF微电极的制备方法，其特征在于，所述电聚合的点位为0.9V～1.5V。
3.如权利要求1所述的Cu-Im/CF微电极的制备方法，其特征在于，所述电聚合的时间为15～20min。
4.如权利要求1所述的Cu-Im/CF微电极的制备方法，其特征在于，所述硝酸铜溶液的浓度为1～1.5M。
5.如权利要求1所述的Cu-Im/CF微电极的制备方法，其特征在于，所述旋蒸的时间为30～40min。
6.如权利要求1所述的Cu-Im/CF微电极的制备方法，其特征在于，所述洗涤采用水。
7.如权利要求1所述的Cu-Im/CF微电极的制备方法，其特征在于，所述干燥的时间为3～4h。
8.权利要求1-7任一项所述的方法制备的Cu-Im/CF微电极。
9.一种电化学传感器，其特征在于，以权利要求8所述的Cu-Im/CF微电极为工作电极。
10.权利要求8所述的Cu-Im/CF微电极在电化学检测多巴胺中的应用。
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