CN116660238A - 一种基于免标记sers金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法 - Google Patents

一种基于免标记sers金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于免标记SERS金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法。本发明通过在AuNPs表面修饰不同的强配体分子2‑巯基苯并咪唑‑5‑羧酸(MBIA)和4,5‑二苯基‑2‑咪唑硫醇(DPI)来调节界面能力，从而实现在AuNPs上生长附加域(Ag岛或Au帽)的目标。获得的Au‑AgJanus NPs和Au‑mushroomNPs均表现出来源于配体的强SERS信号，且两者之间具有互不干扰的特征峰。利用这些优异性质，将这两种检测探针与Fe3O4@Au NPs进行组装，可实现对AFB1和AFB2的同时检测。而且，由于目标分子与适配体的特异性结合，Fe3O4@AuNPs之间从聚集到分散的状态还可以实现对AFM1的准确检测。所构建的组装体既可以充当SERS传感器，又可充当磁性弛豫传感器，可以实现在复杂食品基质中对黄曲霉毒素的亚型分析。

Description

一种基于免标记SERS金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析 方法
技术领域
本发明属于拉曼光谱分析技术领域，尤其是指一种基于免标记SERS金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，其主要的几种亚型包括黄曲霉毒素B1、B2和M1。其中，黄曲霉毒素B1(AFB1)具有最强的毒性，致癌率极高，其主要的代谢产物黄曲霉毒素M1(AFM1)的毒性仅次于它。黄曲霉毒素B2(AFB2)也同样具有强毒性。这些毒素常存在于玉米、花生、坚果等农作物中，而且会通过食物链进入到动物体内进而污染肉制品以及乳制品。因此，迫切需要开发一种能快速、灵敏且准确检测黄曲霉毒素的传感器。
检测黄曲霉毒素的传统分析方法主要包括色谱法、免疫分析法、荧光分析法等，这些方法可能会存在仪器昂贵、成本高、效率低、易受干扰等缺点。表面增强拉曼散射作为一种优秀的痕量检测技术，现已被广泛应用于食品安全快速检测中。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于免标记SERS金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法。
本发明的目的在于提供一种基于免标记SERS金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法，包括以下步骤：
(1)将Au-Ag Janus NPs和Au mushroomNPs分别与黄曲霉毒素的适配体AFB1-Apt和AFB2-Apt孵育过夜，固液分离取固相，并将固相分散在溶剂中，得到Au-Ag Janus NPs/AFB1-Apt溶液和Au-mushroom NPs/AFB2-Apt溶液；
(2)将Fe3O4@Au NPs等分成两份，其中一份与AFM1的适配体AFM1-Apt以及AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C混合孵育过夜，另一份与AFM1适配体互补链AFM1-Apt-C以及AFB2适配体互补链AFB2-Apt-C混合孵育过夜，固液分离取固相，并将固相分散在溶剂中；
(3)将步骤(1)和步骤(2)中的混合溶液孵育后最终得到用于黄曲霉毒素亚型分析的组装体，将其与待检测溶液在缓冲溶液中混合，反应后磁性分离取固相，并检测固相的SERS信号强度或T2值强度，实现黄曲霉毒素的定性和定量分析。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述Au-Ag Janus NPs与AFB1-Apt的摩尔比1:50-1:100；所述Au mushroomNPs与AFB2-Apt的用量比为1:50-1:100。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述溶剂为0.5×TBE(Tris硼酸)缓冲液。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中所述溶剂为PBS(磷酸盐)缓冲液。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述Au-Ag Janus NPs的制备方法如下：
将Au NPs溶液与MBIA(4,5-二苯基-2-咪唑硫醇)在50-70℃下混合孵育，并加入对苯二酚和银盐溶液，静置反应2-6h后，获得Au-Ag Janus NPs。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述Au-mushroomNPs的制备方法如下：
将AuNPs溶液与DPI(4,5-二苯基-2-咪唑硫醇)在50-70℃下混合孵育，并加入NaOH、DHN和HAuCl4溶液，静置反应12h以上，获得Au-mushroom NPs。
进一步的，AuNPs和DPI之间的摩尔比1:250000。
进一步的，AuNPs和NaOH之间的摩尔比1:25000-50000。
进一步的，AuNPs和DHN(2,7-二羟基萘)之间的摩尔比1:10000-30000。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中所述Fe3O4@AuNPs的制备方法如下：
S1，将铁盐和柠檬酸三钠溶解于乙二醇中，再加入醋酸钠，搅拌均匀后置于反应釜中加热至210-230℃进行反应，得到Fe3O4 NPs；
S2，将S1中所得到的Fe3O4NPs与PEI(聚乙烯亚胺)溶液混合并超声处理，加入Au种子溶液超声后，将其添加到含PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)和盐酸羟胺的水溶液中，并加入HAuCl4溶液超声得到Fe3O4@AuNPs。
在本发明的一个实施例中，步骤S1中所述铁盐选自氯化铁、硝酸铁和硫酸铁中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，步骤S1中铁盐、柠檬酸三钠、醋酸钠的摩尔比2:1:10。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述AFM1的适配体AFM1-Apt以及AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C的摩尔比为1:1。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述黄曲霉毒素的适配体AFB1-Apt的序列为-SH-(CH2)6-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCT AGGCCCACA；AFB2-Apt序列为-SH-(CH2)6-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TGC TGA CAC CCT GGA CCT TGG GAT TCC GGAAGT TTT CCG GTACCTATG CGT GCTACC GTGAA。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中AFM1的适配体AFM1-Apt的序列为-SH-(CH2)6-ACT GCTAGAGATTTT CCACAT，AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C的序列为-SH-(CH2)6-GAGAGA CAA CAC GTG CCCAAC；所述AFM1适配体互补链AFM1-Apt-C的序列为-SH-(CH2)6-ATGTGG AAA ATC TCT AGC AGT，AFB2适配体互补链AFB2-Apt-C的序列为-SH-(CH2)6-GCATCTGAC CTC TGT GCT GCT。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中定量分析的标准曲线的制备方法如下：
将组装体与不同浓度的黄曲霉毒素溶液混合，反应后固液分离取固相，检测固相的SERS信号强度或T2值强度，以黄曲霉毒素浓度的对数值为横坐标，分别以1278cm-1和1000cm-1处的SERS信号强度以及T2值强度为纵坐标，得到所述的标准曲线。
在本发明的一个实施例中，所述定量检测黄曲霉毒素三种亚型为AFB1、AFB2和AFM1。
在本发明的一个实施例中，AFB1的浓度范围为0.01ng/mL-10.00ng/mL，AFB2的浓度范围为0.10pg/mL-5.00ng/mL，AFM1的浓度范围为0.10pg/mL-0.50ng/mL。
进一步的，所述AFB1的线性检测范围为0.01ng/mL-10.00ng/mL。
进一步的，所述AFB2的线性检测范围为0.10pg/mL-5.00ng/mL。
进一步的，所述AFM1的线性检测范围为0.50pg/mL-0.10ng/mL。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中缓冲溶液为Tris-HCl溶液。
在本发明的一个实施例中，使用785nmAr+离子激光源检测SERS信号强度。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提出的一种基于免标记SERS金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法，具有优异的特异性。本发明选用两种免标记的SERS金属纳米探针Au-Ag Janus NPs和Au-mushroom NPs。它们均具有无需额外拉曼信标分子修饰的免标记的优势，且由于金属与金属之间强烈的等离子体耦合效应，两者都具有极强的SERS信号。Au-Ag Janus NPs和Au-mushroomNPs表现出的SERS信号具有互不干扰的特征峰，可应用于AFB1和AFB2的双重检测。同时，该传感器又可以充当磁性弛豫传感器完成对AFM1的检测，主要以其中的Fe3O4@AuNPs作为检测探针，目标物AFM1的存在会使Fe3O4@Au NPs从聚集到分散，从而引起T2值降低。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1是本发明实施例二中制备得到的Au-Ag Janus NPs(a)和Au mushroomNPs(b)的TEM图。
图2是本发明实施例二中组装体检测不同浓度的AFB1(a)、AFB2(b)和AFM1(c)时的标准曲线。
图3是本发明测试例中特异性实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例一
1、制备Au-Ag Janus NPs和Au mushroomNPs：
首先通过柠檬酸钠还原法合成AuNPs，将其用于后续制备。
Au-Ag Janus NPs的合成：将5mL的AuNPs溶液稀释10倍，加入1mL MBIA后60℃孵育2h。冷却至室温后依次缓慢加入2.8mL 10mM对苯二酚和5.6mL 1mM硝酸银，搅拌均匀后静置4h，离心后重新分散在水中，得到Au-Ag Janus NPs。
Au mushroomNPs的合成：在搅拌条件下，将5mLAuNPs溶液缓慢滴加到5mL MTAB水溶液(20mM)中，持续搅拌1h后，逐滴加入200μL DPI(10mM)，将混合溶液搅拌均匀后置于60℃水浴锅中孵育1.5h。待溶液冷却至室温后，在剧烈搅拌下，依次缓慢滴加4.00mLNaOH(20mM)、2.40mL DHN(20mM)和3.40mL HAuCl4(3.5mM)，混合溶液需要静置12h以上。最终经离心洗涤后分散在水中得到Au-mushroomNPs溶液。
2、制备Fe3O4@AuNPs：
Fe3O4 NPs的合成：将0.6g FeCl3和0.4g柠檬酸三钠加入到20mL乙二醇中，一起搅拌30min后再加入1.2g醋酸钠。将混合溶液搅拌均匀后转移至50mL反应釜中，在210℃下加热反应12h。最终得到的Fe3O4 NPs用乙醇洗涤三次。
Au种子溶液的合成：在室温和剧烈搅拌的条件下，在50mL超纯水中依次加入0.5mLHAuCl4(25mM)和1.5mL柠檬酸钠(1wt％)，1min后立即加入0.5mL新鲜配制的NaBH4(0.075wt％)。混合溶液在室温下持续搅拌12h得到Au种子溶液。
Fe3O4@Au NPs的合成：称取0.1g Fe3O4 NPs加入到10mL PEI溶液(1mg/mL)中，超声处理15min，磁分离洗涤五次后再分散在10mL水中。取1mL Fe3O4@PEI NPs加入到5mLAu种子溶液中，继续超声处理30min后得到Fe3O4-Au seedNPs。将0.0450g PVP和0.0075gNH2OH·HCl溶解于15mL水中，添加1mL Fe3O4-Au seedNPs，超声处理15min后加入50μLHAuCl4(25mM)，继续超声15min。最终得到的Fe3O4@AuNPs用超纯水洗涤三次。
3、建立黄曲霉毒素亚型分析的传感器：
将Au-Ag Janus NPs与AFB1的适配体AFB1-Apt在0.5×TBE缓冲液中混合孵育过夜，得到Au-Ag Janus NPs/AFB1-Apt溶液。同样地，将Au-mushroom NPs与AFB2的适配体AFB2-Apt在0.5×TBE缓冲液中混合孵育过夜，得到Au-mushroomNPs/AFB2-Apt溶液。
将Fe3O4@Au NPs等分成两份，其中一份与AFM1的适配体AFM1-Apt以及AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C混合孵育过夜，另一份与AFM1适配体互补链AFM1-Apt-C以及AFB2适配体互补链AFB2-Apt-C混合孵育过夜。
将Au-Ag Janus NPs/AFB1-Apt溶液与修饰有AFM1-Apt和AFB1-Apt-C的Fe3O4@AuNPs孵育过夜；而Au-mushroom NPs/AFB2-Apt溶液与修饰有AFM1-Apt-C和AFB2-Apt-C的Fe3O4@AuNPs孵育过夜。最终，将上述两种混合溶液再次孵育过夜，得到用于黄曲霉毒素亚型分析的组装体。
4、建立检测AFB1、AFB2和AFM1的标准曲线：
将组装体与AFB1和AFB2(AFB1：0、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL和10.00ng/mL；AFB2：0、0.10pg/mL、1.00pg/mL、0.01ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL和5.00ng/mL)混合在Tris-HCl溶液中，室温下孵育2h，磁分离后使用785nmAr+离子激光源检测组装体的SERS强度，以AFB1和AFB2浓度的对数值为横坐标，分别以1278cm-1和1000cm-1处的SERS信号强度为纵坐标，得到检测AFB1和AFB2的标准曲线。
将组装体与不同浓度的AFM1(0、0.10pg/mL、0.50pg/mL、1.00pg/mL、5.00pg/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL和0.50ng/mL)混合孵育2h，磁分离后重新分散在水中，并通过核磁共振仪器记录T2值，以AFM1浓度的对数值为横坐标，以T2值强度为纵坐标，得到检测AFM1的标准曲线。
实施例二
1、制备Au-Ag Janus NPs和Au mushroomNPs：
首先通过柠檬酸钠还原法合成AuNPs，将其用于后续制备。
Au-Ag Janus NPs的合成：将5mL的AuNPs溶液稀释10倍，加入1mL MBIA后60℃孵育2h。冷却至室温后依次缓慢加入2.8mL 10mM对苯二酚和2.8mL 1mM硝酸银，搅拌均匀后静置6h，离心后重新分散在水中，得到Au-Ag Janus NPs。所述Au-Ag Janus NPs的TEM表征结果如图1a所示。
Au mushroomNPs的合成：在搅拌条件下，将5mLAuNPs溶液缓慢滴加到5mL MTAB水溶液(20mM)中，持续搅拌1h后，逐滴加入200μL DPI(10mM)，将混合溶液搅拌均匀后置于60℃水浴锅中孵育2h。待溶液冷却至室温后，在剧烈搅拌下，依次缓慢滴加4.00mLNaOH(20mM)、2.40mL DHN(10mM)和3.40mL HAuCl4(1.75mM)，混合溶液需要静置12h以上。最终经离心洗涤后分散在水中得到Au-mushroomNPs溶液。所述Au-mushroomNPs具蘑菇形状，具体见其TEM表征结果如图1b所示。
2、制备Fe3O4@AuNPs：
Fe3O4 NPs的合成：将0.6g FeCl3和0.4g柠檬酸三钠加入到20mL乙二醇中，一起搅拌30min后再加入1.2g醋酸钠。将混合溶液搅拌均匀后转移至50mL反应釜中，在230℃下加热反应12h。最终得到的Fe3O4 NPs用乙醇洗涤三次。
Au种子溶液的合成：在室温和剧烈搅拌的条件下，在50mL超纯水中依次加入0.5mLHAuCl4(25mM)和1.5mL柠檬酸钠(1wt％)，1min后立即加入0.5mL新鲜配制的NaBH4(0.075wt％)。混合溶液在室温下持续搅拌12h得到Au种子溶液。
Fe3O4@Au NPs的合成：称取0.1g Fe3O4 NPs加入到10mL PEI溶液(1mg/mL)中，超声处理15min，磁分离洗涤五次后再分散在10mL水中。取1mL Fe3O4@PEI NPs加入到5mLAu种子溶液中，继续超声处理30min后得到Fe3O4-Au seedNPs。将0.0450g PVP和0.0075gNH2OH·HCl溶解于15mL水中，添加1mLFe3O4-Au seedNPs，超声处理15min后加入200μLHAuCl4(25mM)，继续超声15min。最终得到的Fe3O4@AuNPs用超纯水洗涤三次。
3、建立黄曲霉毒素亚型分析的传感器：
将Au-Ag Janus NPs与AFB1的适配体AFB1-Apt在0.5×TBE缓冲液中混合孵育过夜，得到Au-Ag Janus NPs/AFB1-Apt溶液。同样地，将Au-mushroom NPs与AFB2的适配体AFB2-Apt在0.5×TBE缓冲液中混合孵育过夜，得到Au-mushroomNPs/AFB2-Apt溶液。
将Fe3O4@Au NPs等分成两份，其中一份与AFM1的适配体AFM1-Apt以及AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C混合孵育过夜，另一份与AFM1适配体互补链AFM1-Apt-C以及AFB2适配体互补链AFB2-Apt-C混合孵育过夜。
将Au-Ag Janus NPs/AFB1-Apt溶液与修饰有AFM1-Apt和AFB1-Apt-C的Fe3O4@AuNPs孵育过夜；而Au-mushroom NPs/AFB2-Apt溶液与修饰有AFM1-Apt-C和AFB2-Apt-C的Fe3O4@AuNPs孵育过夜。最终，将上述两种混合溶液再次孵育过夜，得到用于黄曲霉毒素亚型分析的组装体。
4、建立检测AFB1、AFB2和AFM1的标准曲线：
将组装体与AFB1和AFB2(AFB1：0、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL和10.00ng/mL；AFB2：0、0.10pg/mL、1.00pg/mL、0.01ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL和5.00ng/mL)混合在Tris-HCl溶液中，室温下孵育2h，磁分离后使用785nmAr+离子激光源检测组装体的SERS强度，以AFB1和AFB2浓度的对数值为横坐标，分别以1278cm-1和1000cm-1处的SERS信号强度为纵坐标，得到检测AFB1和AFB2的标准曲线。结果如图2a，b所示，随着AFB1和AFB2浓度的增加，在1278cm-1和1000cm-1处的SERS强度均逐渐减弱，且在0.01ng/mL-10.00ng/mL的范围内，AFB1浓度的对数值与1278cm-1处的SERS强度存在良好的线性关系(I1278＝-1338.44Log CAFB1+2929.20)，而在0.10pg/mL-5.00ng/mL的范围内，AFB2浓度的对数值与1000cm-1处的SERS强度存在良好的线性关系(I1000＝-726.48LogCAFB2+1848.13)。
将组装体与不同浓度的AFM1(0、0.10pg/mL、0.50pg/mL、1.00pg/mL、5.00pg/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL和0.50ng/mL)混合孵育2h，磁分离后重新分散在水中，并通过核磁共振仪器记录T2值，以AFM1浓度的对数值为横坐标，以T2值强度为纵坐标，得到检测AFM1的标准曲线。结果如图2c所示，随着AFM1浓度的增加，T2值减小，且在0.0005ng/mL-0.1000ng/mL的范围内，AFM1浓度的对数值与T2值存在良好的线性关系(IT2＝-20.15LogCAFM1-6.51)。
实施例三
1、制备Au-Ag Janus NPs和Au mushroomNPs：
首先通过柠檬酸钠还原法合成AuNPs，将其用于后续制备。
Au-Ag Janus NPs的合成：将5mL的AuNPs溶液稀释10倍，加入1mL MBIA后60℃孵育2h。冷却至室温后依次缓慢加入2.8mL 10mM对苯二酚和4.0mL 1mM硝酸银，搅拌均匀后静置2h，离心后重新分散在水中，得到Au-Ag Janus NPs。
Au mushroomNPs的合成：在搅拌条件下，将5mLAuNPs溶液缓慢滴加到5mL MTAB水溶液(20mM)中，持续搅拌1h后，逐滴加入200μL DPI(10mM)，将混合溶液搅拌均匀后置于60℃水浴锅中孵育1.5h。待溶液冷却至室温后，在剧烈搅拌下，依次缓慢滴加4.00mLNaOH(10mM)、2.40mL DHN(10mM)和3.40mL HAuCl4(3.5mM)，混合溶液需要静置12h以上。最终经离心洗涤后分散在水中得到Au-mushroomNPs溶液。
2、制备Fe3O4@AuNPs：
Fe3O4 NPs的合成：将0.6g FeCl3和0.4g柠檬酸三钠加入到20mL乙二醇中，一起搅拌30min后再加入1.2g醋酸钠。将混合溶液搅拌均匀后转移至50mL反应釜中，在220℃下加热反应10h。最终得到的Fe3O4 NPs用乙醇洗涤三次。
Au种子溶液的合成：在室温和剧烈搅拌的条件下，在50mL超纯水中依次加入0.5mLHAuCl4(25mM)和1.5mL柠檬酸钠(1wt％)，1min后立即加入0.5mL新鲜配制的NaBH4(0.075wt％)。混合溶液在室温下持续搅拌12h得到Au种子溶液。
Fe3O4@Au NPs的合成：称取0.1g Fe3O4 NPs加入到15mL PEI溶液(1mg/mL)中，超声处理15min，磁分离洗涤五次后再分散在10mL水中。取1mL Fe3O4@PEI NPs加入到5mLAu种子溶液中，继续超声处理30min后得到Fe3O4-Au seedNPs。将0.0450g PVP和0.0075gNH2OH·HCl溶解于15mL水中，添加1mLFe3O4-Au seedNPs，超声处理15min后加入100μLHAuCl4(25mM)，继续超声15min。最终得到的Fe3O4@AuNPs用超纯水洗涤三次。
3、建立黄曲霉毒素亚型分析的传感器：
将Au-Ag Janus NPs与AFB1的适配体AFB1-Apt在0.5×TBE缓冲液中混合孵育过夜，得到Au-Ag Janus NPs/AFB1-Apt溶液。同样地，将Au-mushroom NPs与AFB2的适配体AFB2-Apt在0.5×TBE缓冲液中混合孵育过夜，得到Au-mushroomNPs/AFB2-Apt溶液。
将Fe3O4@Au NPs等分成两份，其中一份与AFM1的适配体AFM1-Apt以及AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C混合孵育过夜，另一份与AFM1适配体互补链AFM1-Apt-C以及AFB2适配体互补链AFB2-Apt-C混合孵育过夜。
将Au-Ag Janus NPs/AFB1-Apt溶液与修饰有AFM1-Apt和AFB1-Apt-C的Fe3O4@AuNPs孵育过夜；而Au-mushroom NPs/AFB2-Apt溶液与修饰有AFM1-Apt-C和AFB2-Apt-C的Fe3O4@AuNPs孵育过夜。最终，将上述两种混合溶液再次孵育过夜，得到用于黄曲霉毒素亚型分析的组装体。
4、建立检测AFB1、AFB2和AFM1的标准曲线：
将组装体与AFB1和AFB2(AFB1：0、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL和10.00ng/mL；AFB2：0、0.10pg/mL、1.00pg/mL、0.01ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL和5.00ng/mL)混合在Tris-HCl溶液中，室温下孵育2h，磁分离后使用785nmAr+离子激光源检测组装体的SERS强度，以AFB1和AFB2浓度的对数值为横坐标，分别以1278cm-1和1000cm-1处的SERS信号强度为纵坐标，得到检测AFB1和AFB2的标准曲线。
将组装体与不同浓度的AFM1(0、0.10pg/mL、0.50pg/mL、1.00pg/mL、5.00pg/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL和0.50ng/mL)混合孵育2h，磁分离后重新分散在水中，并通过核磁共振仪器记录T2值，以AFM1浓度的对数值为横坐标，以T2值强度为纵坐标，得到检测AFM1的标准曲线。
测试例
特异性实验：为了进一步评估实施例二所构建的黄曲霉毒素亚型分析的传感器的选择性，将组装体分别与0.1ng/mL的AFB1、AFB2、AFM1、OTA、MC-LR、TTX和FB1混合孵育，反应后固液分离取固相测试SERS强度以及T2值强度。特异性结果如图3所示，由于适配体与各自的目标物之间存在特有的亲和力，1278cm-1处的SERS强度只会因AFB1的存在而减弱，1000cm-1处的SERS强度只会因AFB2的存在而减弱，T2值只会因AFM1的存在而降低，而其它非特异性分子并不会影响SERS强度或T2值的大小。这进一步证实了本发明所构建的传感器具有良好的特异性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种基于免标记SERS金属纳米探针的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Au-AgJanusNPs和AumushroomNPs分别与黄曲霉毒素的适配体AFB1-Apt和AFB2-Apt孵育过夜，固液分离取固相，并将固相分散在溶剂中，得到Au-AgJanusNPs/AFB1-Apt溶液和Au-mushroomNPs/AFB2-Apt溶液；
(2)将Fe3O4@AuNPs等分成两份，其中一份与AFM1的适配体AFM1-Apt以及AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C混合孵育过夜，另一份与AFM1适配体互补链AFM1-Apt-C以及AFB2适配体互补链AFB2-Apt-C混合孵育过夜，将两份反应液固液分离取固相，并将固相分散在溶剂中得到混合溶液；
(3)将步骤(1)中Au-AgJanusNPs/AFB1-Apt溶液和Au-mushroom NPs/AFB2-Apt溶液和步骤(2)所得混合溶液孵育后最终得到用于黄曲霉毒素亚型分析的组装体，将其与待检测溶液在缓冲溶液中混合反应，反应后磁性分离取固相，并检测固相的SERS信号强度或T2值强度，实现黄曲霉毒素的定性和定量分析。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述Au-AgJanusNPs的制备方法如下：
将AuNPs溶液与MBIA在50-70℃下混合孵育，并加入对苯二酚和银盐溶液，静置反应2-6h后，获得Au-AgJanusNPs。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述Au-mushroomNPs的制备方法如下：
将AuNPs溶液与DPI在50-70℃下混合孵育，并加入NaOH、DHN和HAuCl4溶液，静置反应12h以上，获得Au-mushroomNPs。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述Fe3O4@AuNPs的制备方法如下：
S1，将铁盐和柠檬酸三钠溶解于乙二醇中，再加入醋酸钠，搅拌均匀后置于反应釜中加热反应，得到Fe3O4NPs；
S2，将S1中所得到的Fe3O4NPs与PEI溶液混合并超声处理，加入Au种子溶液超声后，将其添加到含PVP和盐酸羟胺的水溶液中，并加入HAuCl4溶液超声得到Fe3O4@AuNPs。
5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，所述定量检测黄曲霉毒素三种亚型为AFB1、AFB2和AFM1。
6.根据权利要求5所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，AFB1的检测浓度范围为0.01ng/mL-10.00ng/mL，AFB2的检测浓度范围为0.10pg/mL-5.00ng/mL，AFM1的检测浓度范围为0.10pg/mL-0.50ng/mL。
7.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，步骤(1)中所述黄曲霉毒素的适配体AFB1-Apt的序列为-SH-(CH2)6-GTTGGGCAC GTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA；AFB2-Apt序列为-SH-(CH2)6-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACAC CCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCT ACCGTGAA。
8.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，步骤(2)中AFM1的适配体AFM1-Apt的序列为-SH-(CH2)6-ACTGCTAGAGATTTT CCACAT，AFB1适配体互补链AFB1-Apt-C的序列为-SH-(CH2)6-GAGAGA CAACACGTGCCCAAC；所述AFM1适配体互补链AFM1-Apt-C的序列为-SH-(CH2)6-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGT，AFB2适配体互补链AFB2-Apt-C的序列为-SH-(CH2)6-GCATCTGACCTCTGTGCTGCT。
9.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，步骤(3)中定量分析的标准曲线的制备方法如下：
将组装体与不同浓度的黄曲霉毒素亚型溶液混合，反应后固液分离取固相，检测固相的SERS信号强度或T2值强度，以黄曲霉毒素浓度的对数值为横坐标，分别以1278cm-1和1000cm-1处的SERS信号强度以及T2值强度为纵坐标，得到所述的标准曲线。
10.根据权利要求9所述的黄曲霉毒素亚型分析方法，其特征在于，使用785nmAr+离子激光源检测SERS信号强度。
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