CN114594081A - 一种植物油中黄曲霉毒素b1的拉曼快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，包括：S1)植物油处理：称取适量植物油待检样品，加入一定量提取液和净化填料，涡旋或超声振荡后离心，取上清液待用；S2)液液萃取：在上清液中加入有机试剂，进行液液萃取，静置分层后取有机相层备用；S3)富集：取有机相层液体1‑3mL于瓶中进行氮气吹干，加入复溶液复溶；S4)拉曼检测：取上述富集后的液体与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测。本发明通过简单前处理结合金属纳米粒子的表面增强拉曼散射效应，满足黄曲霉毒素B1在植物油中简单、快速、廉价、高灵敏度等方面的检测需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物油检测方法，尤其涉及一种植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法。
背景技术
我国是植物油生产和消费大国，食用油是居民日常消费必需品之一，为人体提供必需的脂肪酸及亚油酸等人体所需营养物质，在人们饮食体系中占有重要位置。植物油种类非常丰富，常见的食用植物油主要有大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、油茶籽油、芝麻油等。近年来居民对油品质量愈发关注，国家对居民食用油质量安全问题也高度重视，其中由于食用植物油的原料和加工属性，极易受到黄曲霉毒素的污染。天然食物中以黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)最为多见，黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种，黄曲霉毒素B1对人类具有强烈的毒性，黄曲霉毒素B1的急性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，且黄曲霉毒素耐热性强，280℃才可分解，故一般烹调加工温度下难以破坏，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。依次提供一种简单、高效、准确、快速的黄曲霉毒素B1检测方法对植物油质量安全监管问题有着重要意义。
目前，常用的检测方法是胶体金法、薄层层析法、酶联免疫法、高效液相色谱法，液质联用等，但这些方法存在各种不足，胶体金法灵敏度较低；薄层层析法对检测的规范和熟练度要求较高，准确度较差；酶联免疫吸附测定法检测时，易出现假阳性误判，需要采用高效液相色谱法或气相色谱-质谱法进行确证；高效液相色谱法方法简单，检测限低，但免疫亲和柱价格昂贵，成本较高，对仪器设备、操作人员的要求较高，耗时较长，在检测过程中往往是作为确认检验方法。
在中国专利文献CN 107462564B中公开了一种基于银超晶体的黄曲霉毒素B1快速免标记检测方法，该方法采用超大孔介孔二氧化硅模板负载银结合多元校正方法建立黄曲霉毒素B1测试模型，但未介绍植物油样本中黄曲霉毒素B1具体分离、提取方法。该方法所用增强基底合成方法复杂、步骤繁琐且该模型建立需要一定计算机专业背景，普通分析测试人员不易通过该方法得到准确的黄曲霉毒素B1信号。
在中国专利文献CN106928397A中和中国专利文献CN106442465A中公布了两种黄曲霉毒素B1拉曼检测方法，这两种方法均存在所用SERS基底合成难度大、样品净化、富集方法表述不清问题，不适合海关口岸现场执法使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，能够现场采集植物油样本，并通过简单前处理结合金属纳米粒子的表面增强拉曼散射效应，来满足黄曲霉毒素B1在植物油中简单、快速、廉价、高灵敏度等方面的检测需求。
本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，包括如下步骤：S1)植物油处理：称取适量植物油待检样品，加入一定量提取液和净化填料，涡旋或超声振荡后离心，取上清液待用；S2)液液萃取：在上清液中加入有机试剂，进行液液萃取，静置分层后取有机相层备用；S3)富集：取有机相层液体1-3mL于瓶中进行氮气吹干，加入复溶液复溶；S4)拉曼检测：取上述富集后的液体与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测。
进一步地，所述步骤S1中提取液为甲醇、乙醇和乙腈中一种。
进一步地，所述步骤S1中提取液的质量百分浓度为70％-90％。
进一步地，所述步骤S1中净化填料为中性氧化铝、弗罗里硅土和GCB填料中一种。
进一步地，所述步骤S1中离心旋转速度为4000-7000r/min，离心处理时间为2-5min。
进一步地，所述步骤S2中的有机溶剂为二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯中一种。
进一步地，所述步骤S3复溶液为甲醇、乙醇或丙酮，质量百分浓度为15％-45％，加入体积为200-500μL。
进一步地，所述步骤S4中的金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
进一步地，所述步骤S4中的辅助增强试剂是摩尔浓度为0.01-1M卤盐溶液。
进一步地，所述步骤S4包括：将待测液、纳米溶胶、0.01-1M卤盐溶液按体积比1～3：5～10：1混加入样品检测瓶中，混合均匀后，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。
本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，以卤盐溶液为团聚剂，通过简单、快捷的前处理方法，实现多种植物油体系中黄曲霉B1测试。本发明可使用便携式拉曼光谱仪或手持式光谱仪进行检测，其中手持式光谱仪体积小、重量轻、易于携带，采用3000-4000rpm/min转速进行离心，对离心设备要求低，市面上大部分便携式小型离心机均可满足要求。整体检测方案简单易行，无需大型设备，检测时间在20min内，单次检测成本控制在5-10元内，与液相色谱、气相色谱、质谱等方法相比，成本仅为其10％-20％，对植物油中黄曲霉毒素B1最低检出可达到10ppb，符合国标《GB2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定中黄曲霉毒素B1限值点，满足海关口岸、食药监等部门进行一线现场快速地、大批量地检测的应用要求。
附图说明
图1为本发明黄曲霉毒素B1的标品系列浓度测信号图；
图2为本发明菜籽油中黄曲霉毒素B1的加标检测信号图；
图3为本发明大豆油中黄曲霉毒素B1的加标检测信号图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。
拉曼光谱检测分析法是基于印度科学家C.V.拉曼(Raman)所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息。表面增强拉曼光谱(SERS)技术具有灵敏度高、快速分析及振动光谱等优势。由于不同物质是由不同分子结构组成的，即每种物质都有自己的拉曼“指纹”谱。本发明从黄曲霉毒素B1自身化学性质出发，结合SERS技术特点设计了一种简单、易行的前处理方法，只需通过简单的液液提取即可完成植物油中黄曲霉毒素B1样品制备，检测结果符合国标《GB2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定中黄曲霉毒素B1限量要求。具体来说，本发明提供的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，包括如下步骤：
S1)植物油处理：称取1mL植物油待检样品，加入1-3mL提取液，再加入0.3-0.5g净化填料，涡旋或超声振荡后离心，取上清液待用；所述净化填料为中性氧化铝、弗罗里硅土和GCB填料((石墨化炭黑))中一种；离心旋转速度优选为4000-7000r/min，离心处理时间优选为2-5min；
S2)液液萃取：在上清液中加入1-3mL有机试剂，进行液液萃取，静置分层后取有机相层备用；所述有机溶剂为二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯中一种；
S3)富集：取有机相层液体1-3mL于瓶中进行氮气吹干，加入复溶液复溶；
S4)拉曼检测：取上述富集后的液体与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测，其拉曼特征峰位于540±4cm-1。
本发明提供的检测方法操作简单，对仪器设备要求低，检测准确度高，无需大量的有机溶剂及有毒试剂，对实验人员身体健康和自然环境不会造成伤害、检测时间短、成本低。检测结果符合市场监管部门快速筛查的检测要求。
本发明提供的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，所述步骤S1中提取液为甲醇、乙醇和乙腈中一种；提取液的质量百分浓度优选为70％-90％，浓度过低时，因黄曲霉毒素B1溶解性为不溶于水，故提取液必须含有极性有机溶剂；且浓度过低时，提取效率较差，导致检测信号较弱以至检测不出来目标物。而浓度过高时，不利于下一步骤中的液液萃取，因两相会互溶，将会导致无法进行萃取步骤。该浓度范围已进行实验验证，能在满足检测情况下，可使目标物在检测中信号最优，最便于判别。
本发明提供的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，所述步骤S3中的复溶液为甲醇、乙醇和丙酮中的一种，所述复溶液质量百分浓度为15％-45％，加入体积为200-500uL。
本发明提供的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，所述金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子，粒径优选为55nm。卤盐对黄曲霉毒素选择性较好，使用卤盐作为团聚剂对黄曲霉B1拉曼检测信号较佳。但卤盐浓度过大，纳米粒子聚集速度加快，不利于得到稳定的测试信号，导致测试信号偏弱；卤盐浓度太低纳米粒子聚集时间耗时太久，检测时间增长，也不利于纳米粒子与目标物结合。优选地，所述步骤S4中的辅助增强试剂为摩尔浓度为0.01-1M卤盐溶液，比如0.01-1M碘化钾溶液。所述步骤S4包括：将待测液、纳米银溶胶、0.01-1M卤盐溶液按体积比1～3：5～10：1加入样品检测瓶中，混合均匀后，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。待测液、纳米溶胶、碘化钾溶液加入比例对后续拉曼信号有较大影响，加入太多金属溶胶会导致检测成本上升，另一方面三者加入比例不合适会使检测体系之间不能充分作用，进而影响后续拉曼特征峰强度，最终使得目标待测物不能检出。
实施例一
对黄曲霉毒素B1标准品进行测试，其步骤如下：
合成金纳米溶胶
将100mL 0.01％氯金酸加热至沸腾，快速加入0.7mL 1％柠檬酸三钠溶液，剧烈搅拌30min，冷却至室温。
合成纳米银溶胶
取100mL 1mM硝酸银溶液加热至沸腾，加入2mL 1％柠檬酸三钠水溶液，持续反应30min后取出冷却即为纳米银溶胶。
标准溶液配制：分别配置10μg/L、20μg/L、100μg/L系列浓度标准品。
检测：取20μL样品，再加入50μL 1mol/L碘化钾溶液，加入200μL金纳米粒子快速混匀，上机检测，检测结果如图1，特征峰为537cm-1。
实施例二
对菜籽油中不同浓度加标的检测，其步骤如下：
标准品制备：配置浓度为100ppb的黄曲霉毒素B1标准溶液。
样品加标及前处理：将菜籽油样品，以《GB2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中限值点进行不同样品加标，使加标浓度符合国标限值要求。
取1mL油样，加入1mL 70％甲醇水溶液，再加入0.3gGCB，涡旋2min，4000rpm/min离心3min，取上清液1mL，加入1mL二氯甲烷，涡旋1min，离心10s，取下层液体氮吹，加入200μL20％乙醇水溶液复溶。测定时，取20μL复溶液，再加入50μL1mol/L碘化钾溶液，加入200μL金纳米粒子快速混匀，上机检测，检测结果如图2，特征峰为540cm-1。
实施例三
采用实施例一中系列浓度的标准品,并采用相同的加标方法，对大豆油样品进行加标、前处理和检测，检测结果如图3，特征峰为542cm-1。
上述实施例检测过程中，样品的检测时间不超过20min，单次实验物料检测的成本在5～10元内，相对于传统的液相色谱、气相色谱、质谱等检测方法，不仅快速，廉价，检测结果也满足各地海关口岸、市场监管部门的快速筛查、复核的检测要求。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1)植物油处理：称取适量植物油待检样品，加入一定量提取液和净化填料，涡旋或超声振荡后离心，取上清液待用；
S2)液液萃取：在上清液中加入有机试剂，进行液液萃取，静置分层后取有机相层备用；
S3)富集：取有机相层液体1-3mL于瓶中进行氮气吹干，加入复溶液复溶；
S4)拉曼检测：取上述富集后的液体与纳米金属粒子、辅助增强试剂混合均匀后进行检测。
2.如权利要求1所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1中提取液为甲醇、乙醇和乙腈中一种。
3.如权利要求2所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1中提取液的质量百分浓度为70％-90％。
4.如权利要求1所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1中净化填料为中性氧化铝、弗罗里硅土和GCB填料中一种。
5.如权利要求1所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1中离心旋转速度为4000-7000r/min，离心处理时间为2-5min。
6.如权利要求1所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的有机溶剂为二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯中一种。
7.如权利要求1所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S3复溶液为甲醇、乙醇或丙酮，质量百分浓度为15％-45％，加入体积为200-500μL。
8.如权利要求1所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S4中的金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
9.如权利要求1所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S4中的辅助增强试剂是摩尔浓度为0.01-1M卤盐溶液。
10.如权利要求9所述的植物油中黄曲霉毒素B1的拉曼快速检测方法，其特征在于，所述步骤S4包括：将待测液、纳米溶胶、0.01-1M卤盐溶液按体积比1～3：5～10：1混加入样品检测瓶中，混合均匀后，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。
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