CN116655817A

CN116655817A - 一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法及应用

Info

Publication number: CN116655817A
Application number: CN202310451819.9A
Authority: CN
Inventors: 胡惠; 李远彬; 冯冠北; 韩褒; 陈一凡; 胡明铭; 杨广珍; 潘明; 张嘉恒
Original assignee: Zhongke Xuanjia Medical Care Zhuhai Health Technology Co ltd; Henan Aoaisi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhongke Xuanjia Medical Care Zhuhai Health Technology Co ltd; Henan Aoaisi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-04-25
Filing date: 2023-04-25
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2043-04-25
Also published as: CN116655817B

Abstract

本发明公开了一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法及应用，将酶解工艺、依克多因泛醇NaDES溶剂加热搅拌提取工艺两种方式联用到极微小球藻中多糖类化合物的提取；联合提取工艺有效的提高了多糖类化合物的含量，依克多因泛醇NaDES溶剂提取过程中可以有效破坏植物原料微观结构，促进活性成分溶出，提取效率更高；经人皮肤成纤维细胞测试，极微小球藻的酶解耦合DES提取液的IC90＝4.729％，生物相容性良好，同时功效检测显示在一定浓度下，可以抑制人皮肤成纤维细胞的MMP‑1表达，提高Elastin含量，促进人Ⅰ型胶原蛋白合成，具有抗皱、紧致功效。

Description

一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法及应用

技术领域

本发明涉及极微小球藻多糖提取提取技术领域，特别涉及一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法及应用。

背景技术

极微小球藻是一种绿色/黄绿色、油脂含量很高的海水藻，油脂以C16和C18为主，富含不饱和脂肪酸，其中EPA含量很高，且不含DHA。2012年将之收录在《饲料原料目录》，同期收录的还有小球藻粉、微藻粕、裂壶藻粉。其本身富含各种营养物质比较突出的球藻产品有EPA、球藻蛋白、球藻胞外多糖。

微藻多糖是存在于微藻胞内或胞外的一种具有广泛而独特生物活性的天然大分子物质，其品种多、资源丰，对调节微藻浮力、调控渗透压、抵抗捕食、固定金属离子、稳定群落组成等具有重要作用，更有大量研究表明微藻多糖具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、增强免疫功能和降血糖等活性功效。

随着海洋植物活性成分领域的发展，海藻是海洋生物资源的重要组成部分，随着科技进步，越来越多的海藻活性物质被发现和利用，广泛应用于医药、食品、化工及农业等方面。海藻中生物活性物质主要有多糖类、蛋白类、萜类、甾醇类、多酚类、环状多硫化合物、大环内酯类等，近年来多糖类物质仍然是学者的研究重点，广泛应用于各领域。

如图9所示的藻多糖分子结构，极微小球藻多糖是一类有机体的细胞壁结构的一部分，其结构可以被加以改变，可以用于制药，食品，化妆品等领域。

目前基于极微小球藻的提取工艺主要是水和有机溶剂，他们或多或少的存在着提取效率过低，活性物质不稳定易分解、有机溶剂易燃易爆且后续难以分离或者分离成本过高等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法及应用。该方法利用天然深共熔溶剂(NaDES)协同酶解提取的方式达到极微小球藻细胞细胞壁高效破壁、稳定提取的效果，从而制得的极微小球藻多糖产率较高且提取成本低、提取条件温和，提取工艺简单且可靠稳定。

深共熔溶剂(DES)是一种由氢键受体和氢键供体通过氢键作用力相互连接在一起的低共熔混合物，具有高度的可设计性。作为一种新型的绿色溶剂，深共熔溶剂具有制备工艺简单、无蒸汽压、生物相容性好的突出优势而被广泛应用于食药妆等领域。

依克多因可以使嗜盐菌免受伤害，它有两大功能：①保湿：它是维持渗透压平衡的重要物质，其独特分子结构具有很强的水分子络合能力，能使细胞内的游离水结构化，是非常优秀的天然保湿剂。②修复：依克多因能对抗紫外线对皮肤的伤害，修复紫外线导致的细胞DNA损伤。

泛醇进入人体能转化为泛酸进而合成为辅酶A，促进人体蛋白质、脂肪、糖类的代谢，保护皮肤表面的粘膜和光泽，预防疾病的发生。泛醇主要用于配制护发制品和局部使用的化妆品；可以防治小皱纹、炎症、日晒、糜烂，防止脱发，促进生发。研究表明泛醇能穿透毛下形成弹性薄膜留在毛干的内外侧，在内侧可显示毛发柔性和弹性，在外侧显示毛发的光泽。同时泛醇能使头发增稠10％，并能修补已损坏的头发。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(2)酶解液的制备：将纤维素酶、木瓜蛋白酶溶于柠檬酸缓冲液得到复合酶液；

(3)依克多因泛醇NaDES溶剂的制备：将依克多因和泛醇以不同摩尔比投入反应器，一定温度下搅拌加热一段时间，得到粘稠液体,该粘稠液体即为所述依克多因泛醇NaDES溶剂；

(4)将干燥后的极微小球藻粉加入到复合酶液中酶解一段时间后，加热灭酶最终得到酶解液；

(5)向酶解液中加入一定量的依克多因泛醇NaDES溶剂，采用加热搅拌的方式进行提取，结束后经离心、过滤得到极微小球藻多糖提取液。

优选的，所述步骤(2)中，纤维素酶与木瓜蛋白酶均为0.5-2mg/ml，其中柠檬酸浓度为1-3mg/mL。

优选的，所述步骤(3)中，依克多因、泛醇以摩尔比1:0.2～4投入反应器，在30-70℃加热搅拌3-8h。

优选的，所述步骤(4)中，极微小球藻的固液比为10-100mg/mL,酶解时间为1-5h,酶解温度为30-50℃，加热灭酶温度为80-90℃，相应时间为10-30min。

优选的，所述步骤(5)中，依克多因泛醇NaDES溶剂的浓度为0.1-0.5g/mL,加热温度为40-70℃，提取时间为1～3h。

优选的，所述步骤(5)中，离心参数为4000-12000r/min，离心5-20min。

优选的，所述依克多因泛醇NaDES溶剂作为一种绿色溶剂，能够加速溶解和破坏极微小球藻细胞的细胞壁，促使极微小球藻中的功能性成分高效流出，使得多糖等功能性成分产率增加，高达12.3621％。

上述所制备得到的极微小球藻多糖，可以作为一种日化原料添加到日化产品中，发挥优异的抗皱、紧致功效。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

1、本发明一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法及应用，提取效率优于传统水、醇溶液，得到的提取液生物相容性良好，并且在一定浓度下，可以抑制人皮肤成纤维细胞的MMP-1表达，提高Elastin含量，促进人Ⅰ型胶原蛋白合成，具有抗皱、紧致功效。

2、依克多因泛醇NaDES溶剂能够加速溶解极微小球藻细胞的细胞壁，促使极微小球藻中的活性物质高效流出，进而有效提高多糖产率。获得的极微小球藻多糖提取液，可以作为一种日化原料添加到精华水、保湿剂等产品中，发挥优异的抗皱、紧致功效。

附图说明

图1是本发明提取黑松露中多糖的方法的流程图；

图2是本发明的不同处理方法多糖含量测定图；

图3是本发明的极微小球藻原料不同溶剂处理前后SEM分析图；

图4是本发明DES的红外分析(a)，DSC分析(b)；

图5是本发明的人皮肤成纤维细胞相对存活率趋势；

图6是本发明的MMP-1相对含量测试；

图7为本发明的Elastin相对含量测试；

图8为本发明的人Ⅰ型胶原蛋白相对含量测试；

图9为藻多糖分子结构图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1至图9所示,为本发明一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法及应用的实施例、对比例和测试例。

如图1所示，为本发明一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的制备方法流程图。

本发明具体实施例、对比例和测试例如下：

实施例1：

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(2)酶解液的制备：将纤维素酶、木瓜蛋白酶溶于柠檬酸缓冲液得到复合酶液；纤维素酶与木瓜蛋白酶均为1mg/ml，其中柠檬酸浓度为2mg/mL。

(3)依克多因泛醇NaDES溶剂的制备：将依克多因和泛醇以1:4摩尔比投入反应器，60℃加热搅拌8h，得到粘稠液体,该粘稠液体即为所述依克多因泛醇NaDES溶剂。

(4)将干燥后的极微小球藻粉加入到复合酶液中酶解一段时间后，加热灭酶最终得到酶解液；极微小球藻的固液比为30mg/mL,酶解时间为2h,酶解温度为40℃，加热灭酶温度为85℃，相应时间为20min。

(5)向酶解液中加入一定量的依克多因泛醇NaDES溶剂，采用加热搅拌的方式进行提取，结束后经离心、过滤得到极微小球藻多糖提取液。依克多因泛醇NaDES溶剂的浓度为0.3g/mL,加热温度为60℃，提取时间为1.5h。离心参数为10000r/min，离心15min。

实施例2：

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(3)依克多因泛醇NaDES溶剂的制备：将依克多因和泛醇以1:3摩尔比投入反应器，60℃加热搅拌8h，得到粘稠液体,该粘稠液体即为所述依克多因泛醇NaDES溶剂。

实施例3：

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(3)依克多因泛醇NaDES溶剂的制备：将依克多因和泛醇以1:2摩尔比投入反应器，60℃加热搅拌8h，得到粘稠液体,该粘稠液体即为所述依克多因泛醇NaDES溶剂。

实施例4：

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(3)依克多因泛醇NaDES溶剂的制备：将依克多因和泛醇以1:1摩尔比投入反应器，60℃加热搅拌8h，得到粘稠液体,该粘稠液体即为所述依克多因泛醇NaDES溶剂。

对比例1：水提取液

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(2)将干燥后的极微小球藻粉加入到超纯水中，采用加热搅拌的方式进行提取，极微小球藻的固液比为100mg/mL。结束后经离心、过滤得到极微小球藻水提取液。加热温度为60℃，提取时间为1.5h。离心参数为10000r/min，离心15min。

对比例2：乙醇提取液

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(2)将干燥后的极微小球藻粉加入到乙醇中，采用加热搅拌的方式进行提取，极微小球藻的固液比为100mg/mL。结束后经离心、过滤得到极微小球藻乙醇提取液。加热温度为60℃，提取时间为1.5h。离心参数为10000r/min，离心15min。

对比例3：NaDES提取液

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(2)依克多因泛醇NaDES溶剂的制备：将依克多因和泛醇以1:1摩尔比投入反应器，60℃加热搅拌8h，得到粘稠液体,该粘稠液体即为所述依克多因泛醇NaDES溶剂。

(3)将干燥后的极微小球藻粉加入到依克多因泛醇NaDES溶剂中，采用加热搅拌的方式进行提取，极微小球藻的固液比为100mg/mL。结束后经离心、过滤得到极微小球藻NaDES提取液。依克多因泛醇NaDES溶剂的浓度为0.3g/mL,加热温度为60℃，提取时间为1.5h。离心参数为10000r/min，离心15min。

对比例4：酶解液

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(3)将干燥后的极微小球藻粉加入到复合酶液中酶解一段时间后，加热灭酶最终得到酶解液；极微小球藻的固液比为30mg/mL,酶解时间为2h,酶解温度为40℃，加热灭酶温度为85℃，相应时间为20min。

(4)将酶解液离心、过滤得到极微小球藻酶解液。离心参数为10000r/min，离心15min。

测试例1：不同溶剂或工艺对多糖含量的影响

检测方法：使用适量蒸馏水将极微小球藻提取液(水提取、乙醇提取、依克多因泛醇NaDES提取、酶解)稀释定容至250ml，然后准确移取1ml多糖溶液于10ml玻璃试管中，并向玻璃试管中加入5％苯酚水溶液、浓硫酸5ml定容，然后摇匀后静置30min，在490nm处通过紫外分光光度计测定吸光度，通过葡萄糖标准曲线进行分析计算，从而得到极微小球藻多糖得率。

如图2所示，为本发明测试例1的不同处理方法多糖含量测定。

检测结论：不同溶剂或工艺对极微小球藻多糖提取的影响见图2，以水，乙醇，0.3g/mL依克多因泛醇NaDES溶剂，酶解耦合DES提取方式提取极微小球藻多糖。由测试结果可知，酶解耦合DES溶剂的提取效率优于其他溶剂和工艺，高达15.78％，是水提的3.82倍，是乙醇提取的的2.74倍,是依克多因泛醇NaDES处理的2.08倍，是酶解处理的2.31倍。故酶解耦合DES在原先酶解液有效提高多糖含量的基础上加入DES提取，有效的提高了多糖含量，增量高于水、乙醇溶剂。

测试例2：极微小球藻原料不同溶剂处理前后SEM分析

电镜扫描结果显示未经提取处理的极微小球藻原料呈较为小块完整的球状；经水和乙醇处理的极微小球藻原料发生一些物理结构上的变化，球状结构开始受到破坏，纹路出现明显的的凹陷；采用依克多因泛醇NaDES溶剂处理后的极微小球藻部分球状结构明显被破坏，大量活性物质溶出，并且团聚在一起。而最终酶解耦合依克多因泛醇NaDES溶剂处理后，极微小球藻中几乎所有的球状结构被完全破坏，大量活性物质溶出，团聚成一片。这说明依克多因泛醇NaDES溶剂提取过程中可以有效破坏植物原料微观结构，促进活性成分溶出，提取效率更高。并且通过结合酶解工艺，可以进一步提高活性物质的溶出率，有效增强多糖类化合物的含量。

如图3所示，为本发明测试例3中的极微小球藻原料不同溶剂处理前后SEM分析，其中(a-b)极微小球藻(未处理)；(c-d)极微小球藻(水提取处理)；(e-f)极微小球藻(乙醇提取处理)；(g-h)极微小球藻(依克多因泛醇NaDES溶剂提取处理)；(i-j)极微小球藻(酶解耦合依克多因泛醇NaDES溶剂提取处理)。

测试例3：NaDES结构和热表征

根据深共熔溶剂形成机理，对其组成原料及成品进行了傅里叶红外光谱表征，根据其化学键位和化学基团判断是否形成了需要的DES，结果如图4所示：其中DES的红外分析(a)，DSC分析(b)，在形成NaDES后，依克多因的特征峰发生轻微的偏移且峰形加宽，依克多因和泛醇特征峰向低波数方向移动，氢键的形成导致振动频率的降低和谱带的变宽，从而导致两个组分的特征峰发生重叠，在图所示中表现为峰位置的偏移。在排除水存在的情况下所有红外图中出现的宽峰都可以推测为依克多因与泛醇之间形成了氢键。

利用差式扫描量热分析来确定形成的DES的熔点及玻璃化转变温度。从图4中可以看出，在-40℃左右，热流值呈先下降后上升，出现了一个拐点，说明此区间为DES的玻璃化转变温度区间。

测试例4：极微小球藻的酶解耦合DES提取液细胞毒性测试

检测目的及原理：检测样品对人皮肤成纤维细胞毒性的影响；通过代谢活性测定细胞的存活率，MTT(噻唑蓝)在活细胞内代谢性还原，生成蓝紫色不可溶的甲臜，活细胞的数目与甲臜溶于醇类后光度计测定的色度相关。

检测依据：SN/T 2328-2009《化妆品急性毒性的角质细胞试验》

如图5所示，为本发明测试例4的人皮肤成纤维细胞相对存活率趋势。

检测结论：基于人皮肤成纤维细胞，极微小球藻的酶解耦合DES提取液的IC₉₀＝4.729％，生物相容性良好。

测试例5：极微小球藻的酶解耦合DES提取液人皮肤成纤维细胞MMP-1释放量测试

检测目的及原理：评价样品体外抗皱功效；试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人MMP-1抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的MMP-1与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。洗涤后，加入显色底物TMB，避光显色，颜色反应的深浅与样本中MMP-1的浓度成正比。

检测依据：PJJC-SOP3-65《人皮肤成纤维细胞中MMP-1检测标准操作程序》。

图6所示，为本测试例5的MMP-1相对含量测试，其检测结论如下：

(1)与BC组相比，模型组的MMP-1含量显著上升(P<0.05)，说明本次测试刺激条件有效。

(2)与模型组相比，PC组的MMP-1含量显著下降(P<0.05)，说明本次测试阳性对照有效。

(3)与模型组相比，样品SHINE+小球藻提取物在2.5％、1％的测试浓度下，MMP-1含量无显著性下降，则SHINE+小球藻提取物在2.5％、1％％浓度下，无促进MMP-1含量变化的作用；样品SHINE+小球藻提取物在0.5％的测试浓度下，MMP-1含量有显著下降，抑制率为8.61％(P<0.05)，则SHINE+小球藻提取物在2.5％、0.5％浓度下具有一定的抗皱功效。

测试例6：极微小球藻的酶解耦合DES提取液人皮肤成纤维细胞-测定Elastin(ELISA法)

检测目的及原理：评估待测样品的紧致功效；弹性蛋白是一种存在于多种结缔组织中并具有独特生理弹性的蛋白质。尽管弹性蛋白仅占真皮总蛋白的2％，但它促进了皮肤稳态的重要功能。皮肤光老化的分子机制之一，是UV辐射可以调控弹性蛋白酶基因表达，导致弹性蛋白含量减少，如基质金属蛋白酶(MMP)，特别是人巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MMP12)，它是弹性蛋白降解中最活跃的蛋白酶。同时弹性蛋白的产生随着年龄的增长或太阳辐射造成的损害而减少。本实验通过ELISA法测定弹性蛋白含量变化，评价待测物的紧致功效。

检测依据：PJJC-SOP3-64《人皮肤成纤维细胞中Elastin检测标准操作程序》。

如图7所示，为本发明测试例6的Elastin相对含量测试，其检测结论如下：

与NC组相比，PC组的Elastin含量上调有显著性(P<0.05)，说明本次试验阳性对照有效。

与NC组相比，样品SHINE+小球藻提取物在0.5％、0.25％、0.1％的测试浓度下，Elastin含量上升，上调率分别为141.71％(P<0.05)、50.98％(P<0.05)、28.85％(P<0.05)，则表示SHINE+小球藻提取物在0.5％、0.25％、0.1％的浓度下有促进Elastin含量合成作用，在该浓度下具有紧致功效。

测试例7：极微小球藻的酶解耦合DES提取液人Ⅰ型胶原蛋白含量

检测目的及原理：基于人皮肤成纤维细胞，通过检测人Ⅰ型胶原蛋白合成含量变化，评估待测样品的紧致抗皱功效；Ⅰ型胶原蛋白是真皮细胞外基质的主要成分之一，由真皮成纤维细胞在胞内合成Ⅰ型胶原分泌至胞外，在末端前胶原肽酶的作用下，端肽分离后，聚合形成胶原纤维。因此，可以通过给药后成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的含量，评估待测样品的紧致抗皱功效。

检测依据：T/SHRH 031-2020《化妆品紧致、抗皱功效测试-体外成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量测定》。

如图8所示，为本发明测试例7的人Ⅰ型胶原蛋白相对含量测试图，其检测结论如下：

(1)与NC组相比，PC组的人Ⅰ型胶原蛋白含量上调具有显著性(P＜0.05)，说明本次试验阳性对照有效。

(2)与NC组相比，SHINE+小球藻提取物在0.1％的测试浓度下，人Ⅰ型胶原蛋白含量无显著性上升，则表示SHINE+小球藻提取物在0.1％的浓度下无促进人Ⅰ型胶原蛋白分泌作用；SHINE+小球藻提取物在0.5％、0.25％的测试浓度下，人Ⅰ型胶原蛋白含量上升，上调率分别为77.20％(P＜0.05)、61.25％(P＜0.05)，则表示SHINE+小球藻提取物在0.5％、0.25％的浓度下有促进人Ⅰ型胶原蛋白合成的能力，在该浓度下具有抗皱、紧致功效。

本发明具体提供了一种酶解耦合超声波辅助依克多因泛醇NaDES溶剂从极微小球藻藻粉中提取多糖的制备方法。具体优点如下：

1、本发明将酶解工艺、依克多因泛醇NaDES溶剂加热搅拌提取工艺两种方式联用到极微小球藻中多糖类化合物的提取。两种工艺的结合有效的提高了多糖类化合物的含量，高达15.78％，是水提的3.82倍，是乙醇提取的的2.74倍,是依克多因泛醇NaDES处理的2.08倍，是酶解处理的2.31倍。

2、通过对不同溶剂或工艺处理的极微小球藻扫描电镜图片分析可以得到，依克多因泛醇NaDES溶剂提取过程中可以有效破坏植物原料微观结构，促进活性成分溶出，提取效率更高。并且通过结合酶解工艺，可以进一步提高活性物质的溶出率，有效增强多糖类化合物的含量。

3、基于人皮肤成纤维细胞，极微小球藻的酶解耦合DES提取液的IC₉₀＝4.729％，生物相容性良好，并且在一定浓度下，可以抑制人皮肤成纤维细胞的MMP-1表达，提高Elastin含量，促进人Ⅰ型胶原蛋白合成，具有抗皱、紧致功效。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法，其特征在于，所述极微小球藻多糖的制备方法具体步骤如下：

(1)将极微小球藻粉放入恒温干燥箱脱水处理；

(2)酶解工艺的酶解液的制备：将纤维素酶、木瓜蛋白酶溶于柠檬酸缓冲液得到复合酶液；

(5)向所述酶解液中加入一定量的依克多因泛醇NaDES溶剂，采用加热搅拌的方式进行提取，结束后经离心、过滤得到极微小球藻多糖提取液。

2.如权利要求1所述的酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，纤维素酶与木瓜蛋白酶均为0.5-2mg/ml，其中柠檬酸浓度为1-3mg/mL。

3.如权利要求1所述的酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，依克多因、泛醇以摩尔比1:0.2～4投入反应器，在30-70℃加热搅拌3-8h。

4.如权利要求1所述的酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述极微小球藻的固液比为10-100mg/mL,酶解时间为1-5h,酶解温度为30-50℃，加热灭酶温度为80-90℃，相应时间为10-30min。

5.如权利要求1所述的酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述依克多因泛醇NaDES溶剂的浓度为0.1-0.5g/mL,加热温度为40-70℃，提取时间为1～3h。

6.如权利要求1所述的酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，离心参数为4000-12000r/min，离心5-20min。

7.如权利要求1所述的酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的方法，其特征在于，所述酶解工艺和所述依克多因泛醇NaDES溶剂提取两种方式能够加速溶解极微小球藻细胞的细胞壁，促使所述极微小球藻中的活性物质高效流出，进而有效提高多糖产率，并且最终得到的多糖提取液生物相容性良好。

8.一种酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的应用，其特征在于，经人皮肤成纤维细胞测试，所述极微小球藻的酶解耦合DES提取液的IC₉₀＝4.729％，生物相容性良好。

9.如权利要求8所示的酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖的应用，其特征在于，所述酶解耦合深共熔溶剂提取极微小球藻多糖，在一定浓度下，可以抑制人皮肤成纤维细胞的MMP-1表达，提高Elastin含量，促进人Ⅰ型胶原蛋白合成，具有抗皱、紧致功效。