CN116642974A - 高效液相色谱法测定三唑类化合物制剂中有关物质及辅料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供高效液相色谱法测定三唑类化合物制剂中有关物质及辅料的方法。相比现有技术,本发明提供的方法能够检测出更多的杂质,并且三唑类化合物、杂质、辅料之间能够实现良好的基线分离,专属性强、耐用性高、操作方便。此外,本发明提供的方法无需借助手性色谱柱即可实现三唑类化合物与其一非对映异构体的分离,应用成本低、易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体涉及一种利用高效液相色谱法(HPLC)测定三唑类化合物制剂中有关物质及辅料的方法。
背景技术
艾氟康唑(Efinaconazole)是一种三唑类抗真菌药,其具有广谱的抗真菌活性和高指甲穿透性。艾氟康唑的化学名为(2R,3R)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(4-亚甲基-1-哌啶基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇,在结构中含有2个手性中心,其结构及其有关物质的结构如下:
艾氟康唑制剂是一种主要用于灰指甲的治疗的外用溶液,其通过独特的内置用量控制型趾甲刷给药,与其他药物相比副作用小,不存在严重药物相互作用和急性肝损伤,具有较为可观的临床前景。
艾氟康唑原料及其制剂中的有关物质主要有以下两个来源:一为合成过程中引入的原料、中间体、副产物;二为贮藏过程中由于环境的影响产生的降解杂质。结合艾氟康唑原料合成路线和相关文献报道(PHarmazie,2018,73(8):438-441.CN106918672 A)发现工艺杂质中的艾氟康唑非对映异构体(2S,3R)-艾氟康唑)和降解杂质中的氮氧杂质艾氟康唑-N-氧化物易在合成、生产、贮存过程中出现,均需进行严格控制。
在阿根廷药监局官网示出的艾氟康唑外用溶液制剂中,辅料使用了己二酸二异丙酯、二丁基羟基甲苯(BHT)等。另外,丁基羟基苯甲醚(BHA)与二丁基羟基甲苯结构相似,在制剂中也可起到抗氧化作用,可被用于替换二丁基羟基甲苯(BHT)或与二丁基羟基甲苯(BHT)联合发挥作用。上述提及的辅料,其结构分别如下:
截至目前,国内外药典均没有收载艾氟康唑,现有文献报道对艾氟康唑及其制剂中有关物质的检测方法也较为局限,未见文献报道艾氟康唑中辅料含量测定的方法。因此,建立一种简单快捷、专属性高、耐用性强的HPLC方法测定艾氟康唑外用溶液制剂中的主要有关物质及辅料,对艾氟康唑制剂的研究及质量控制具有积极意义。本发明提供的方法可同时检出上述三个辅料组分(己二酸二异丙酯、二丁基羟基甲苯及丁基羟基苯甲醚),可用于反向工程研究及辅料定量研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速分析分离三唑类化合物制剂,即艾氟康唑制剂中活性药物组分及主要有关物质、主要辅料的高效液相色谱方法。本发明提供的方法实现了艾氟康唑制剂中原料药、己二酸二异丙酯、二丁基羟基甲苯(BHT)和/或丁基羟基苯甲醚(BHA)、艾氟康唑氮氧化杂质及艾氟康唑非对映异构体(2S,3R)-艾氟康唑在同一色谱条件下的分离和测定。
因此,本发明的目的在于提供一种高效液相测定三唑类化合物制剂中有关物质及辅料的方法,其中所述三唑类化合物制剂为艾氟康唑制剂。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下。
一方面,本发明提供一种高效液相测定三唑类化合物制剂中有关物质及辅料的方法,其中,所述三唑类化合物制剂为艾氟康唑制剂,所述高效液相测定采用包含如下的色谱条件进行:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或辛基硅烷键合硅胶色谱柱;
流动相:由A相和B相组成,其中所述A相为磷酸盐缓冲液,B相为乙腈或甲醇;
洗脱程序:梯度洗脱。
优选地,所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自Eclipse Plus-C18色谱柱、Symmetry-C18色谱柱和Triart-C18色谱柱;
优选地,所述辛基硅烷键合硅胶色谱柱为ZORBAX SB-C8色谱柱;
优选地,所述A相的磷酸盐缓冲液为选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵和磷酸铵盐缓冲液中的一种或几种;进一步优选地为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢铵缓冲液;
优选地,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005-0.02mol/L,进一步优选地为0.01mol/L;
优选地,所述磷酸盐缓冲液的pH为5.4-6.5;更优选地为5.4-5.8,最优选地为5.8;再进一步地,采用三乙胺来调节所述磷酸盐缓冲液的pH;
优选地,在所述方法中,采用紫外检测器进行测定,更优选地,在所述方法中,采用的检测波长为210nm-230nm;进一步优选地为210nm;
优选地,所述梯度洗脱按照如下程序进行:
时间/min | A相% | B相% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
运行时间:45min;
优选地,在所述方法中,所述流动相的流速为0.5ml/min~1.5ml/min,更优选地为1.0ml/min;
优选地,在所述方法中,所述色谱柱的柱温为25℃~40℃,进一步优选地为30℃;
优选地,在所述方法中,进样量为4μl~20μl,进一步优选地为10μl。
优选地,在所述方法中,采用稀释剂进行样品配制或作为空白溶液,进一步优选地,所述稀释剂为50%-90%的乙腈水溶液或90%的乙醇水溶液;进一步优选地为90%的乙醇水溶液;
优选地,在所述方法中,还包括供试加标样品的制备,所述供试加标样品的制备按照如下进行:取约500mg艾氟康唑制剂、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得,其中所述稀释剂为50%-90%的乙腈水溶液或90%的乙醇水溶液。
在本发明的实施方案中,所述艾氟康唑制剂优选地是指艾氟康唑外用溶液制剂,进一步优选地,所述艾氟康唑外用溶液制剂为活性成分为艾氟康唑、主要辅料包含己二酸二异丙酯、二丁基羟基甲苯(BHT)和/或丁基羟基苯甲醚(BHA)的艾氟康唑外用溶液制剂。
在本发明的优选实施方案中,提供一种高效液相测定三唑类化合物制剂中有关物质及辅料的方法,其中,所述三唑类化合物制剂为艾氟康唑制剂,所述高效液相测定如下进行:
色谱条件:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶(比如Eclipse Plus-C18色谱柱、Symmetry-C18色谱柱或Triart-C18色谱柱)或辛基硅烷键合硅胶色谱柱(比如ZORBAX SB-C8色谱柱);
流动相:由A相和B相组成,其中A相为0.01mol/L的磷酸二氢钠缓冲液,用三乙胺调节pH至5.4~5.8;B相为乙腈;
洗脱程序:
运行时间:45min;
流速:1.0ml/min;
柱温:30℃;
紫外检测器,检测波长210nm;
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水=90:10,V:V);
供试加标样品的制备:取约500mg艾氟康唑制剂、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
测定:分别吸取上述供试加标样品和空白溶液10μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。
本发明提供的方法可使艾氟康唑制剂中主成分、主要有关物质、主要辅料实现良好分离,分析方法专属性强、精密度高、准确性高、操作方便,可有效控制艾氟康唑制剂的质量。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1:按照实施例1条件所得的高效液相色谱图;
图2:按照实施例2条件所得的高效液相色谱图;
图3:按照实施例3条件所得的高效液相色谱图;
图4:按照实施例4条件所得的高效液相色谱图;
图5:按照实施例5条件所得的高效液相色谱图;
图6:按照实施例6条件所得的高效液相色谱图;
图7:按照实施例7条件所得的高效液相色谱图;
图8:按照实施例8条件所得的高效液相色谱图;
图9:按照实施例9条件所得的高效液相色谱图;
图10:按照实施例10条件所得的高效液相色谱图;
图11:按照实施例11条件所得的高效液相色谱图;
图12:按照实施例12条件所得的高效液相色谱图;
图13:按照实施例13条件所得的高效液相色谱图;
图14:按照实施例14条件所得的高效液相色谱图;
图15:按照实施例15条件所得的高效液相色谱图;
图16:按照实施例16条件所得的高效液相色谱图;
图17:按照实施例17条件所得的高效液相色谱图;
图18:按照对比例1条件所得的高效液相色谱图;
图19:按照对比例2条件所得的高效液相色谱图;
图20:按照对比例3条件所得的高效液相色谱图;
图中,色谱峰(1)是氮氧杂质艾氟康唑-N-氧化物的色谱峰;色谱峰(2)是己二酸二异丙酯的色谱峰;色谱峰(3)是艾氟康唑非对映异构体(2S,3R)-艾氟康唑的色谱峰;色谱峰(4)是艾氟康唑的色谱峰;色谱峰(5)是二丁基羟基甲苯(BHT)的色谱峰;色谱峰(6)是2-叔丁基-4-羟基苯甲醚(2-BHA)色谱峰;色谱峰(7)是3-叔丁基-4-羟基苯甲醚(3-BHA)色谱峰。
具体实施方式
本文还提供了以下实施例以进一步举例说明本发明及其实施方式。在实施例中给出的具体详细内容仅是出于举例说明的目的,而不是应将其解释为限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例中所用的艾氟康唑原料药通过市购获得,艾氟康唑制剂为申请人所在单位自制,其中,艾氟康唑制剂1制备处方与阿根廷药监局官网(http://www.anmat.gov.ar/boletin_anmat/enero_2018/Dispo_0018-18.pdf)所示保持一致,艾氟康唑制剂2制备处方即将艾氟康唑制剂1制备处方中的二丁基羟基甲苯(BHT)替换为丁基羟基苯甲醚(BHA)。
实施例1
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;Symmetry-C18,4.6×250mm,5μm;Triart-C18,4.6×250mm,5μm;ZORBAX SB-C8,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈-水(50:50,V:V);
供试加标样品:取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试加标样品,按上述条件进行洗脱和检测。四种色谱柱平行操作,检测结果见图1。其中,图1A是色谱柱为Eclipse Plus-C18时的色谱图,图1B是色谱柱为Symmetry-C18时的色谱图,图1C是色谱柱为Triart-C18时的色谱图,图1D是色谱柱为ZORBAX SB-C8时的色谱图。
实验结果显示,选择不同类型的C18色谱柱和C8色谱柱进行检测时,均可以获得良好的峰型,且主峰与杂质峰、杂质与杂质之间能够实现良好的基线分离,该方法可用各类型色谱柱进行分析检测。
实施例2
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);0.01mol/L磷酸二氢铵缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈-水(50:50,V:V);
供试加标样品:取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试加标样品,按上述条件进行洗脱和检测。三种缓冲盐同法操作,检测结果见图2。其中,图2A是缓冲盐为磷酸二氢钠时的色谱图,图2B是缓冲盐为磷酸二氢钾时的色谱图,图2C是缓冲盐为磷酸二氢铵时的色谱图。
实验结果显示,三种类型缓冲盐均可使各峰之间实现良好的分离,且保留时间适中,均可作为本发明所述方法的流动相A液。
实施例3
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:甲醇;
梯度洗脱程序如下:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈:水=50:50(V:V);
供试加标样品:取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试加标样品,按上述条件进行洗脱和检测。检测结果见图3。
实验结果显示,以甲醇为流动相B液也可使各峰之间实现良好的分离,但考虑乙腈为流动相B液时基线更平稳,故优选乙腈为本发明所述方法的流动相B液。
实施例4
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至4.8);0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.4);0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至6.5);0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至8.0);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈:水=50:50(V:V);
供试加标样品:取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25mL量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试加标样品,按上述条件进行洗脱和检测。四种pH值的磷酸二氢钠缓冲盐同法操作,检测结果见图4。其中,图4A是pH为4.8时的色谱图,图4B是pH为5.4时的色谱图,图4C是pH为5.8时的色谱图,图4D是pH为6.5时的色谱图,图4E是pH为8.0时的色谱图。
实验结果显示,pH=4.8时,(2S,3R)-艾氟康唑色谱峰与艾氟康唑色谱峰重合,无法分离。pH为5.4~8.0时,艾氟康唑、杂质、辅料之间能够实现良好的基线分离,且峰型较优。由于pH=6.5、pH=8.0时所得色谱图基线稍差于5.4~5.8,故更优选pH值范围为5.4~5.8。
实施例5
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
洗脱程序:
时间/min | A% | B% |
0 | 50 | 50 |
60 | 50 | 50 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈:水=50:50(V:V);
供试品溶液:取约500mg艾氟康唑制剂1,精密称定后置于50ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试品溶液,按上述条件进行洗脱和检测,检测结果见图5。
实验结果显示,在该色谱条件下可检测到己二酸二异丙酯和艾氟康唑的色谱峰,但未见二丁基羟基甲苯色谱峰,疑是流动相洗脱能力不足使其残留在色谱柱上。
实施例6
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序:
时间/min | A% | B% |
0 | 50 | 50 |
20 | 50 | 50 |
25 | 10 | 90 |
60 | 10 | 90 |
61 | 50 | 50 |
66 | 50 | 50 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈:水=50:50(V:V);
供试品溶液:取约500mg艾氟康唑制剂1,精密称定后置于50ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品氧化破坏溶液:取约500mg艾氟康唑制剂,精密称定后置于50ml量瓶中,加入30%过氧化氢1mL,摇匀,置于阴凉处24h后,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试品溶液、供试品氧化破坏溶液,按上述条件进行洗脱和检测,检测结果见图6。其中,图6A是供试品溶液得到的色谱图,图6B是供试品氧化破坏溶液得到的色谱图。
结果显示,在该色谱条件下可以检测到供试品溶液中的二丁基羟基甲苯色谱峰,但检测供试品氧化破坏溶液时,保留时间2~3min的艾氟康唑降解杂质无法实现基线分离。
实施例7
仪器与色谱条件:Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
5 | 80 | 20 |
6 | 70 | 30 |
11 | 70 | 30 |
12 | 50 | 50 |
35 | 50 | 50 |
36 | 10 | 90 |
55 | 10 | 90 |
60 | 80 | 20 |
70 | 80 | 20 |
柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂:乙腈:水=50:50(V:V);
空白溶液:移取30%过氧化氢1ml置于50ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品氧化破坏溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1,精密称定后置于50ml量瓶中,加入30%过氧化氢1mL,摇匀,置于阴凉处24h后,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试品氧化破坏溶液,按上述条件进行洗脱和检测,检测结果见图7。
结果显示,艾氟康唑及其制剂中氧化降解的有关物质可以在同一色谱条件下达到良好的分离。
实施例8
仪器与色谱条件:Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂:乙腈:水=50:50(V:V);
空白溶液:移取30%过氧化氢1ml置于50ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品氧化破坏溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1,精密称定后置于50ml量瓶中,加入30%过氧化氢1ml,摇匀,置于阴凉处48h后,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试品氧化破坏溶液,按上述条件进行洗脱和检测,检测结果见图8。
结果显示,在该色谱条件下可以更快速、高效的实现艾氟康唑及其制剂中氧化降解的有关物质达到良好的分离。
实施例9
仪器与色谱条件:Agilent 1620型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;230nm;260nm;
流动相A:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂:乙腈:水=50:50(V:V);
供试品氧化破坏溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1,精密称定后置于50ml量瓶中,加入30%过氧化氢1ml,摇匀,置于阴凉处48h后,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
按上述条件使同一样品分别在210nm;230nm;260nm波长下检测。检测结果见图9。其中,图9A为波长为210nm时的色谱图,图9B为波长为230nm时的色谱图,图9C为波长为260nm时的色谱图。
艾氟康唑的最大紫外吸收在210nm,在该波长下能检测8个降解杂质,2个辅料;230nm、260nm波长下仅能检测4个降解杂质,且260nm无法检测辅料。为更好的检测有关物质,故优选210nm本发明所述方法的检测波长。
实施例10
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A:0.005mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈-水(50:50,V:V);
供试加标样品:称取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得。
分别取空白溶液、供试加标样品,按上述条件进行洗脱和检测。三种浓度的磷酸二氢钠缓冲盐同法操作,检测结果见图10。其中,图10A为磷酸二氢钠缓冲液浓度为0.005mol/L时的色谱图,图10B为磷酸二氢钠缓冲液浓度为0.01mol/L时的色谱图,图10C为磷酸二氢钠缓冲液浓度为0.02mol/L时的色谱图。
实验结果显示,A液缓冲盐浓度在0.005mol/L~0.02mol/L时,峰型良好、保留时间适中,均可进行进样分析,考虑到基线平滑度及缓冲盐浓度太高可能损伤色谱柱,故优选A液浓度为0.01mol/L。
实施例11
仪器与色谱条件:Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液(三乙胺调节pH至5.8)
流动相B相:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:乙腈-水(50:50,V:V);90%乙腈(乙腈:水,90:10,V:V);90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V)
供试品溶液:称取艾氟康唑制剂1约500mg,精密称定置于25mL量瓶中,分别加入上述稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液。
分别取空白溶液、供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图11。
实施例11结果中,用乙腈-水(50:50,V:V)作为稀释剂时,定容后溶液呈浑浊状,静置后底部有无色油状液滴,其色谱图见图11A。以90%乙腈为稀释剂时,定容后溶液呈透明澄清,静置后无油滴聚沉,其色谱图见图11B。以90%乙醇为稀释剂时,定容后溶液呈无色透明澄清状,静置后无油滴,其色谱图见图11C。结果表明,以90%乙腈和90%乙醇为稀释剂时,均能有效解决溶液浑浊、油滴聚沉的问题,且其峰形、对称因子等与用乙腈-水(50:50,V:V)作为稀释剂时相比未受显著影响。出于溶剂潜在毒性和经济性方面考虑,优选90%乙醇为稀释剂。
为进一步验证以90%乙醇为稀释剂时对分离度的影响,取上述以90%乙醇为稀释剂配制得到的供试品溶液,加入适量的艾氟康唑-N-氧化物、(2S,3R)-艾氟康唑,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图11D。
结果表明,以90%乙醇为稀释剂时各色谱峰能得到有效分离。
实施例12
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl;20μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
供试加标样品溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置于25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试加标样品溶液。
分别取空白溶液、供试加标样品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图12。其中,图12A为进样量为10μl时的色谱图,图12B为进样量为20μl时的色谱图。
结果显示进样量为20μl时色谱峰拖尾因子增加,因此优选进样量为10μL。
因此,通过上述实施例的研究,建立了本发明优选的高效液相色谱法测定艾氟康唑制剂中艾氟康唑、主要有关物质和辅料的方法。
色谱条件:
固定相:十八烷基硅烷键合硅胶,粒径5μm;
流动相:A液为0.01mol/L磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢铵缓冲液(三乙胺调节pH至5.4~5.8);流动相B液是乙腈,按下表进行梯度洗脱:
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
流速:1.0ml/min;
柱温:30℃;
紫外检测器,检测波长210nm;
稀释剂/空白溶液:90%乙醇。
实施例13
仪器与色谱条件:Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
供试品溶液:取60℃下放置20天的艾氟康唑制剂1约500mg,精密称定置于25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液。
分别取空白溶液、供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图13。
实施例13结果显示,保留时间25.176min的为艾氟康唑色谱峰,己二酸二异丙酯、二丁基羟基甲苯保留时间分别对应22.891min、32.591min,其他保留时间色谱峰均为有关物质,各有关物质间分离度良好,其中保留时间为4.184min的色谱峰和保留时间为5.149min的色谱峰间分离度为1.78,这一结果表明该色谱条件在Agilent 1260型高效液相色谱系统中适用。
实施例14
仪器与色谱条件:Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
供试品溶液:精密称取艾氟康唑原料药50mg置25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液。
分别取空白溶液、供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图14。
实施例14结果显示,艾氟康唑保留时间为25.050min,有关物质保留时间分别为2.272min、28.917min、33.974min,各色谱峰间分离度好,峰型优异。这表明本方法对可用于艾氟康唑原料药的质量检测。
实施例15
仪器与色谱条件:Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲液(三乙胺调节pH至5.8)
流动相B相:乙腈
梯度洗脱程序如下;
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
酸破坏供试品溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1,精密称定后于25ml棕色量瓶中,加入1mol/L盐酸溶液2ml,于阴凉处放置24h后加入稀释剂至刻度,摇匀作为酸破坏供试品溶液。
碱破坏供试品溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1,精密称定后置于25ml棕色量瓶中,加入1mol/L氢氧化钠溶液2ml,于阴凉处放置24h后加入稀释剂至刻度,摇匀作为碱破坏供试品溶液。
光照破坏供试品溶液:称取艾氟康唑制剂1约600mg,精密称定后置于10ml顶空瓶中,在4500Lux的光照试验箱内放置10天后取样。精密称取光照破坏后的艾氟康唑制剂500mg于25ml量瓶中,加入稀释剂至刻度,摇匀作为光照破坏供试品溶液。
分别取空白溶液,酸破坏、碱破坏、光照破坏供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图15。其中,图15A是酸破坏供试品溶液色谱图,图15B是碱破坏供试品溶液色谱图,图15C是光照破坏供试品溶液色谱图。
结果表明,艾氟康唑制剂1经酸破坏、碱破坏、光照破坏产生的杂质均可在同一色谱条件下达到良好分离。
实施例16
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Agilent Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(三乙胺调节pH至5.8);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
高温破坏供试品溶液:取60℃下放置30天的艾氟康唑制剂1约500mg,精密称定置于25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液。
分别取空白溶液、高温破坏供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图16。
结果表明,艾氟康唑制剂1经高温破坏产生的杂质可在同一色谱条件下达到良好分离。
实施例17
仪器与色谱条件:Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(三乙胺调节pH至5.73);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
30 | 10 | 90 |
35 | 10 | 90 |
36 | 80 | 20 |
45 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:30℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
供试品溶液:取60℃下放置10天的艾氟康唑制剂2约500mg,精密称定置于25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试品溶液。
分别取空白溶液、供试品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图17。
实施例17结果显示,保留时间24.803min的为艾氟康唑色谱峰,2-叔丁基-4-羟基苯甲醚(2-BHA)、3-叔丁基-4-羟基苯甲醚(3-BHA)、己二酸二异丙酯保留时间分别对应19.620min、20.179min、22.573min,其他保留时间色谱峰均为有关物质,各有关物质间分离度良好,其中2-BHA色谱峰和3-BHA色谱峰的分离度为2.25,这一结果表明该色谱条件适用于艾氟康唑制剂2的质量检测。
对比例1
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:230nm;210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(三乙胺调节pH至6.0);
流动相B:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
时间/min | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
8 | 46 | 54 |
10 | 46 | 54 |
19 | 41 | 59 |
21 | 20 | 80 |
26 | 20 | 80 |
26.1 | 80 | 20 |
31 | 80 | 20 |
色谱柱柱温:20℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
供试加标样品溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试加标样品溶液。
分别取空白溶液、供试加标样品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图18。
对比例1结果中,图18A为230nm波长下所获得的色谱图,图18B为210nm波长下所获得的色谱图。结果显示,在两个检测波长下二丁基羟基甲苯均未出峰,230nm波长下目标色谱峰响应值比210nm波长下响应值弱且检出杂质较少。
对比例2
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:260nm;210nm
流动相A相:0.01mol/L甲酸铵缓冲液(甲酸调节pH至5.8)
流动相B相:乙腈;
梯度洗脱程序如下;
色谱柱柱温:35℃;
流速:1mL/min;
进样量:10μL。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
供试加标样品溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑,精密称定后置25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试加标样品溶液。
分别取空白溶液、供试加标样品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图19。
对比例2结果中,图19A为260nm波长下所获得的色谱图,图19B为210nm波长下所获得的色谱图。结果显示,在两个检测波长下二丁基羟基甲苯均未出峰,260nm波长下基线较210nm波长下平稳,但260nm波长下目标色谱峰响应值较弱且检出杂质较少。
对比例3
仪器与色谱条件:Waters e2695型高效液相色谱系统及工作站;
色谱柱:Eclipse Plus-C18,4.6×250mm,5μm;
检测器:UV检测器;
检测波长:210nm;
流动相A相:0.01mol/L磷酸二氢钾溶液与乙腈,体积比95:5,磷酸二氢钾用三乙胺调节pH至6.5;
流动相B:乙腈与甲醇的混合溶液,体积比3:1;
梯度洗脱程序如下;
/>
色谱柱柱温:20℃;
流速:1ml/min;
进样量:10μl。
实验步骤:
稀释剂/空白溶液:90%乙醇(乙醇:水,90:10,V:V);
供试加标样品溶液:称取约500mg艾氟康唑制剂1、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑置25ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀作为供试加标样品溶液。
分别取空白溶液、供试加标样品溶液,按上述条件进行高效液相色谱分析,记录色谱图,结果见图20。
实验结果表明,该方法无法检测辅料二丁基羟基甲苯色谱峰,且色谱图基线不稳,波动较大。
综上所述,本发明所述的检测方法可以实现艾氟康唑与杂质、主要辅料的良好分离。与现有技术相比,本发明提供的方法能够检测出更多的杂质,专属性高、耐用性强、操作方便。此外,本方法无需借助手性色谱柱即可实现艾氟康唑与其一非对映异构体的分离,应用成本低、易于推广。
Claims (9)
1.一种高效液相测定三唑类化合物制剂中有关物质及辅料的方法,其中,所述三唑类化合物制剂为艾氟康唑制剂,所述高效液相测定采用包含如下的色谱条件进行:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或辛基硅烷键合硅胶色谱柱;
流动相:由A相和B相组成,其中,所述A相为磷酸盐缓冲液,B相为乙腈或甲醇;
洗脱程序:梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述A相的磷酸盐缓冲液为选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵和磷酸铵盐缓冲液中的一种或几种;优选地为磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢铵缓冲液;
优选地,所述磷酸盐缓冲液的pH为5.4~6.5;更优选地为5.4~5.8;进一步地,采用三乙胺来调节所述磷酸盐缓冲液的pH;
优选地,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005mol/L~0.02mol/L。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中,所述梯度洗脱按照如下程序进行:
。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,在所述方法中,采用紫外检测器进行测定,更优选地,在所述方法中,采用的检测波长为210nm-230nm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,所述流动相的流速为0.5ml/min~1.5ml/min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,所述色谱柱的柱温为25~40℃。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,所述进样量为4μl~20μl。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,在所述方法中,采用稀释剂进行样品配制或作为空白溶液,优选地,所述稀释剂为50%-90%的乙腈水溶液或90%的乙醇水溶液。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中,在所述方法中,还包括供试加标样品的制备,所述供试加标样品的制备按照如下进行:精密称取500mg艾氟康唑制剂、5mg艾氟康唑-N-氧化物、5mg(2S,3R)-艾氟康唑置于25ml量瓶中,加入稀释剂稀释至刻度,摇匀,即得,其中所述稀释剂为50%-90%的乙腈水溶液或90%的乙醇水溶液。
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