CN107402259B - 卡非佐米中手性异构体的检测方法 - Google Patents

卡非佐米中手性异构体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测卡非佐米中3种手性异构体(对映异构体、非对映异构体F和G)的正相高效液相色谱检测方法，所述正相高效液相色谱法采用以纤维素‑三(4‑氯‑3‑甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为正己烷‑异丙醇‑乙醇，正己烷‑异丙醇‑乙醇的体积比为(87～91):(6～4):(7～5)，该检测方法灵敏度高、专属性好、准确度高、耐用性好，可有效控制卡非佐米的质量。

Description

卡非佐米中手性异构体的检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种检测卡非佐米中3种手性异构体的正相高效液相色谱检测方法。
背景技术
卡非佐米(Carfilzomib)是经静脉给药的第二代蛋白酶体抑制剂，具有良好的抗肿瘤活性，用于治疗预先接受过至少2种药物治疗(包括第一代蛋白酶体抑制剂和一种免疫调节剂)，并有证据显示在完成末次治疗后60天内疾病恶化的难治性多发性骨髓瘤，于2012年7月20日由FDA批准上市，商品名：Kyprolis，其化学结构式如下式所示：
Figure BDA0000993233190000011
目前，卡非佐米检测手性异构体的分析方法未见文献报道。
卡非佐米含有5个手性中心，具有1个对映异构体和30个非对映异构体，不同的手性异构体药理活性和毒性可能会产生较大差别，卡非佐米中可能含有如此多的手性异构体，若不能对其含量进行严格控制，会影响卡非佐米的质量，进而可能会影响卡非佐米的药理活性，给患者带来安全隐患。
因此，建立灵敏度高、专属性好、准确度高、耐用性好的手性异构体检测方法，对卡非佐米的质量控制和患者用药安全性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测卡非佐米中手性异构体的正相高效液相色谱检测方法。
本发明人根据合成产物产生概率推算，得出绝大部分非对映异构体不会产生或者产生概率可以忽略不计，因此，仅研究卡非佐米的对映异构体和4个非对映异构体，即可实现其手性异构体的有效控制，保障卡非佐米的用药安全。卡非佐米的对映异构体和4个非对映异构体的具体结构如下：
Figure BDA0000993233190000021
本发明人首先尝试采用反相液相色谱，此时需要分析的除上述5个手性异构体外，还有9个杂质。色谱柱采用常规的ODS-C18(4.6×250mm，5μm)，流动相在等度条件(50：50)下先后尝试了甲醇和水、乙腈和水、甲醇和0.05％～0.2％醋酸溶液、甲醇和0.05％～0.15％三氟乙酸溶液、乙腈和0.05％～0.2％醋酸溶液、乙腈和0.05％～0.15％三氟乙酸溶液，甲醇和磷酸盐缓冲溶液，乙腈和磷酸盐缓冲溶液，发现在乙腈-0.05％三氟乙酸溶液的流动相体系中，基线噪音较低且主峰分离效果相对较好，但无论如何调整流动相比例，大多数杂质无法实现基本分离，后采用此流动相又尝试了各种梯度洗脱方式，但由于所研究的杂质个数(包括手性异构体)较多，将卡非佐米及其所有杂质均实现基本分离非常困难，经过多次摸索最终开发了一种能分析出尽可能多的杂质的梯度洗脱检测方法，这种检测方法能使卡非佐米与相邻杂质峰之间、大多数杂质峰与杂质峰之前能达到基线分离，但是对映异构体、非对映异构体F和非对映异构体G对其它色谱峰有干扰(非对映异构体F与某杂质重合，非对映异构体G与某杂质重合，对映异构体和卡非佐米重合)。
本发明人后续考虑采用正相液相色谱对卡非佐米中对映异构体、非对映异构体F和G进行单独的质量控制，先后尝试了以纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱(如CHIRALCEL OD-H手性色谱柱，4.6mm×250mm，5μm)和以直链淀粉-三(5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯)为固定相的手性色谱柱(如CHIRALCEL AY-H手性色谱柱，4.6mm×250mm，5μm)，无论调换流动相等色谱条件，都无法进行分离后，又尝试了以纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂的色谱柱(如CHIRALCEL OX-H色谱柱和CHIRALCEL OX-3色谱柱等)，并调整了大量不同的流动相系统，做出了本发明。
本发明提供了一种检测卡非佐米中如下3种手性异构体的正相高效液相色谱检测方法，
Figure BDA0000993233190000031
其特征在于：所述正相高效液相色谱法采用以纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为正己烷-异丙醇-乙醇，正己烷-异丙醇-乙醇的体积比为(87～91):(6～4):(7～5)。
进一步地，所述以纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂的色谱柱为CHIRALCEL OX-H色谱柱和CHIRALCEL OX-3色谱柱，经研究发现本品与其异构体在CHIRALCEL OX-H上的分离效果优于CHIRALCEL OX-3色谱柱，因此优选CHIRALCEL OX-H色谱柱；为保证卡非佐米及其异构体的有效分离，优先选择较长色谱柱，因此所述CHIRALCELOX-H优选长度为250mm。
进一步地，所述正己烷-异丙醇-乙醇的体积比为(88～90):(5.5～4.5):(6.5～5.5)，更进一步地，所述正己烷-异丙醇-乙醇的体积比为89:5:6。
进一步地，所述色谱柱柱温为常用柱温，如36℃～44℃，优选38℃～42℃，进一步优选40℃。
进一步地，所述色谱柱流速为0.8ml/min～1.2ml/min，优选0.9ml/min～1.1ml/min。进一步优选1.0ml/min。
进一步地，所述色谱法检测波长为216nm～224nm，优选218nm～222nm，进一步优选为220nm。
进一步地，所述检测方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
用流动相将卡非佐米或含卡非佐米的制剂制备成每1ml含1.0mg卡非佐米的供试品溶液。
(2)系统适用性溶液的制备：
用流动相将卡非佐米、卡非佐米对映异构体、非对映异构体F和G各对照品制备成每1ml含卡非佐米为1.0mg、对映异构体和各非对映异构体分别为0.01mg的系统适用性溶液。
(3)分析测定：
将供试品溶液和系统适用性溶液注入液相色谱仪。
另一方面，本发明还指出所述检测方法用于卡非佐米或包含卡非佐米的制剂的检测。
以下阐述本发明的有益效果，但不应将此理解为本发明卡非佐米中3种手性异构体的检测方法仅具有下列有益效果：
(1)专属性高、分离度和耐用性良好。
(2)准确度高，非对映异构体F、非对映异构体G和卡非佐米对映异构体的回收率分别为100.9％、100.6％和99.6％，RSD均小于2.0％。
(3)检测灵敏度高，非对映异构体F和G的检测限均为0.07μg/ml，定量限均为0.11μg/ml，卡非佐米对映异构体检测限和定量限分别为0.27μg/ml和0.54μg/ml。
附图说明
图1卡非佐米及其对映异构体、非对映异构体F和G检测方法系统适用性色谱图(色谱峰1为卡非佐米、色谱峰2为非对映异构体F、色谱峰3为对映异构体G、色谱峰4为卡非佐米的对映异构体)
图2非对映异构体F的色谱图
图3非对映异构体G的色谱图
图4卡非佐米对映异构体的色谱图
具体实施方式
以下实施例是对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
以下实施例所用供试品、对照品和试剂说明：
卡非佐米对照品(批号：20140301，含量：100.0％)、对映异构体对照品(批号：20131026，含量97.9％)、非对映异构体F对照品(批号：ZZ20140113，含量97.2％)、非对映异构体G对照品(批号：ZZ20140116，含量98.0％)、卡非佐米供试品(批号：20140302、20140401、20140402)均由石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司提供；所用试剂均为色谱纯。
实施例1系统适用性试验
仪器及色谱条件：
高效液相色谱仪Waters e2695型(包括e2489检测器和Empower色谱工作站)
色谱柱：纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂(CHIRALCELOX-H，4.6mm×250mm，5μm)
流动相：正己烷-异丙醇-乙醇(89:5:6)。
流速：1.0ml/min。
检测波长：220nm。
柱温：40℃。
运行时间：20分钟。
稀释液：流动相
实验步骤：
分别称取卡非佐米、对映异构体、非对映异构体F、非对映异构体G对照品各适量，用稀释液溶解并稀释制成每1ml含对映异构体和各非对映异构体分别为0.01mg、卡非佐米为1.0mg的溶液，摇匀，滤过，作为系统适用性溶液。另分别称取对映异构体、非对映异构体F、非对映异构体G对照品储备液(甲醇为溶剂，浓度为5mg/ml)，用稀释液溶解并稀释制成每1ml含各组分1.0mg的溶液，作为定性对照品溶液。
精密量取系统适用性溶液和各定性对照品溶液各20μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图(请见图1-图4)，结果详见表1。
表1系统适用性溶液分离效果
化合物 保留时间 分离度 拖尾因子 理论塔板数
卡非佐米 7.06 -- 1.28 4442
非对映异构体F 8.08 2.25 1.21 4879
非对映异构体G 10.11 3.74 1.12 4436
对映异构体 15.33 6.12 1.10 3273
可见，本检测方法分离度良好，灵敏度高，能对卡非佐米中对映异构体和非对映异构体F和G进行分析分离和检测，满足中国药典的要求(中国药典规定各杂质峰之间的分离度大于1.5)。
本发明中的色谱仪器不限于实施例所述设备，其它设备在本发明条件下均可实现卡非佐米及其对映异构体、非对映异构体F和G的分析和检测。
实施例2流动相比例对分离效果的影响
仪器及色谱条件：
仅调节流动相正己烷-异丙醇-乙醇的比例(请详见表2)，其它条件参照实施例1。
实验步骤：
在不同流动相正己烷-异丙醇-乙醇比例(请详见表2)条件下，分别对系统适用性溶液进行高效液相色谱分析，考察流动相比例对各组分分离效果的影响，结果详见表2。
表2流动相比例对分离效果的影响
Figure BDA0000993233190000061
Figure BDA0000993233190000071
结果表明，随着流动相极性在上表范围内变化，分离度、拖尾因子变化不大，柱效增加，整体分离效果仍良好，表明该方法耐用性良好。
实施例3流速对分离效果的影响
仪器及色谱条件：
仅调节流动相流速(请详见表3)，其它条件参照实施例1。
实验步骤：
在不同流速(请详见表3)条件下，分别对系统适用性溶液进行高效液相色谱分析，考察流动相流速对各组分分离效果的影响，结果详见表3。
表3流速对分离效果的影响
Figure BDA0000993233190000072
结果表明，在流速0.9～1.1ml/min流速范围内，柱效有所降低，拖尾因子变化不大，分离度变化不大，整体分离效果仍良好，表明该方法耐用性良好。
实施例4柱温对分离效果的影响
仪器及色谱柱条件：
仅调节色谱柱柱温(请详见表4)，其它条件参照实施例1。
实验步骤：
在不同色谱柱柱温(请详见表4)条件下，分别对系统适用性溶液进行高效液相色谱分析，考察色谱柱柱温对各组分分离效果的影响，结果详见表4。
表4柱温对分离效果的影响
Figure BDA0000993233190000081
结果表明，随着柱温的升高分离良好，分离度和拖尾因子变化不大，柱效有所增加，整体分离效果仍良好，表明该方法柱温在38-42℃范围内对温度耐用性良好。
实施例5样品测定
仪器及色谱柱条件：
条件参照实施例1。
实验步骤：
分别称取卡非佐米卡非佐米供试品(批号：20140302、20140401、20140402)适量，用稀释液溶解并稀释制成每1ml含卡非佐米为1.0mg的溶液，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
精密量取供试品溶液20μl，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，按峰面积归一化法计算各异构体含量。
结果表明，卡非佐米中对映异构体、非对映异构体G和非对映异构体F均为未检出。

Claims (12)

1.一种卡非佐米中如下3种手性异构体的正相高效液相色谱检测方法，
Figure FDA0002505958760000011
其特征在于：所述正相高效液相色谱法采用以纤维素-三(4-氯-3-甲基苯基氨基甲酸酯)键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为正己烷-异丙醇-乙醇，正己烷-异丙醇-乙醇的体积比为(87～91):(6～4):(7～5)。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为CHIRALCEL OX-H，CHIRALCEL OX-H的长度为250mm。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述正己烷-异丙醇-乙醇的体积比为(88～90):(5.5～4.5):(6.5～5.5)。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述正己烷-异丙醇-乙醇的体积比为89:5:6。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述正相高效液相色谱法采用紫外检测器，检测波长为216nm～224nm。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述正相高效液相色谱法采用紫外检测器，检测波长为218nm～222nm。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.9ml/min～1.1ml/min。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为36℃～44℃。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为38℃～42℃。
11.如权利要求1至10任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
用流动相将卡非佐米或含卡非佐米的制剂制备成每1ml含1.0mg卡非佐米的供试品溶液；
(2)系统适用性溶液的制备：
用流动相将卡非佐米、卡非佐米对映异构体、非对映异构体F和G各对照品分别制备成每1ml含卡非佐米为1.0mg、对映异构体和各非对映异构体分别为0.01mg的系统适用性溶液；
(3)分析测定：
将供试品溶液和系统适用性溶液注入高效液相色谱仪。
12.如权利要求1至10任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法用于卡非佐米或包含卡非佐米的制剂的检测。
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