CN116640798A - 一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法 - Google Patents

一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法，通过PCR技术从盐胁迫处理的蒺藜苜蓿品种R108基因组中克隆获得启动子；通过对该启动子的元件进行分析，发现其有多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件分布；本发明利用启动子MsPro1构建报告基因GUS的植物表达载体，通过农杆菌侵染法转化植物，获得转基因拟南芥；实验证实转基因拟南芥在盐处理条件下，报告基因GUS的表达活性比对照显著升高，表明启动子MsPro1是一个受盐胁迫诱导表达的启动子；该启动子可应用于植物耐盐基因研究或耐盐基因工程育种。

Description

一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法。
背景技术
苜蓿属于多年生草本豆科植物，含有多种矿物元素以及满足动物机体生长所需的各类维生素，蛋白含量高达17％～24％。紫花苜蓿(Medicago sativa)具有种植面积广、历史悠久、适应性好、营养成分丰富等特点，主要在我国西北、东北、华北和华中等优势产业区域种植。蒺藜苜蓿(Medicago trμncatμla)是目前公布的与紫花苜蓿亲缘关系最近的豆科植物，由于其基因组序列已知、基因功能注释完善，已作为豆科模式物种被广泛应用于植物基因生物学功能解析和豆科饲草遗传育种中。在我国，豆科饲草紫花苜蓿种植区域主要集中在北方。为了提高土地利用率，黄淮海地区的盐碱地被广泛用于种植苜蓿。通常，盐胁迫会导致植物受到离子胁迫、渗透胁迫、次生胁迫以及氧化胁迫的危害。在盐渍土壤条件下生长的植物会经历高渗透胁迫、离子毒性和营养失调，直接造成植物生产力的下降，从而降低作物产量以及牧草品质。因此挖掘蒺藜苜蓿的抗盐基因及其启动子具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法，包括抗盐基因启动子的挖掘和载体构建及农杆菌转化；
载体构建及农杆菌转化包括以下步骤：
(1)DAN提取：用蒺藜苜蓿土培苗提取DNA；
(2)通过配制的带有模板DNA的第一溶液进行PCR扩增；
(3)胶回收，用胶回收试剂盒将目的片段回收；
(4)同源重组连接、转化及菌落PCR鉴定：
a、将配制的带有胶回收产物的第二溶液进行同源重组连接，第二溶液在37℃反应30min，降至4℃或立即置于冰上冷却；
b、转化大肠杆菌感受态细胞，并通过第三溶液进行菌落PCR鉴定；
(5)质粒提取及酶切验证，根据菌落PCR结果在第四溶液中进行摇菌培养，提取质粒，进行酶切验证；
(6)根据酶切结果选取菌落送样测序；
(7)质粒转农杆菌感受态，选取送测结果正确的大肠杆菌提取质粒用于转化农杆菌感受态；
(8)拟南芥转化及筛选：
a、取验证成功的农杆菌接种于100ml YEP液体培养基，28℃，220rpm恒温摇床过夜；
b、当菌液的0D600值在0.8～1.5之间时，即可进行转化；
c、室温4000rpm，离心15min收集菌体，配置等体积重悬液重悬菌体；
d、将拟南芥植株倾斜，使花序浸入装有菌液的培养皿中，浸泡2min后取出；
e、将转化后的植株用黑色塑料袋罩住，第二天去除；
f、纯合体拟南芥的筛选，被农杆菌浸染的拟南芥收获种子后，将其播种于含20mg/l的Basta的MS平皿上，选择抗性植株移苗，单株收种，检测后代，直到筛选出转基因拟南芥纯合体；
(9)盐胁迫处理及GUS染色：
将验证成功的株系收种，晾晒后种子播种于20mg/l的Basta的MS平皿上，生长10天后，移苗到含有不同浓度NaCl的MS板上，7天后取苗进行GUS染色，不同浓度NaCl处理的拟南芥随着盐浓度的变化GUS染色颜色也发生不同程度的变化，由此克隆获得的启动子MsPro1受到盐胁迫诱导调控。
具体的是，所述抗盐基因启动子的挖掘包括以下步骤：
a、将培养后的蒺藜苜蓿R108使用适量浓度NaCl处理0小时、1小时、6小时、12小时，分别取地上部分和地下部分，进行转录组测序；
b、对蒺藜苜蓿R108的RNA-seq测序结果进行分析，以0.5％氯化钠溶液处理R1080小时作为对照，筛选出0.5％氯化钠溶液处理R1081小时、6小时、12小时后表达量均发生变化的基因，然后设计引物，对筛选出的13个基因进行其启动子的克隆，构建抗盐基因工程载体。
具体的是，所述步骤(1)包括以下步骤：
a、65℃预热CTAB；
b、取1～3g植物材料液氮研磨至研钵侧壁粉末；
c、将预热后的15mlCTAB和150μl巯基乙醇还原剂加入50ml离心管中混匀；
d、将研磨后的植物材料加入离心管中混匀，65℃水浴60～90min，每10min摇晃一次；
e、冷却至室温，加入10ml氯仿辛醇，抽提10min，称重配平，10000rpm室温离心10min，取上清，重复抽提一次；
f、吸取10ml上清，加入400μl的5mol/L的NaCl，充分混匀；
g、加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，产生絮状沉淀；
h、用剪口的蓝枪头吸取大块絮状沉淀至10ml的离心管中，之后加入75％无水乙醇，静置于冰上15～20min；
i、50ml离心管中的剩余沉淀放入-20℃冰箱10min，之后离心10min，无水乙醇倒掉，加75％乙醇洗涤沉淀，最后将其放进10ml离心管中；
j、将离心管中的液体吸出，再次加入75％的乙醇洗涤沉淀，然后加入无水乙醇冲洗，倒掉无水乙醇后晾干沉淀；
k、用100μlTE溶解，若检测质量不佳或者DNA呈粘稠状，再加入900μ1的TE于管中，继续进行下列步骤：
l、加入TE后放在4℃冰箱，充分溶解后，加入10μlRNase，放37℃水浴30min，消化掉RNA；
m、从水浴锅取出后加入1ml氯仿辛醇，抽提10分钟，10000rpm离心10分钟；
n、用剪口的蓝枪头吸取大约800μ1上清液，分装到两个2ml离心管中；
o、加入2.5倍体积的无水乙醇，放在-20℃沉淀20分钟，取出10000rpm，离心10min，倒掉无水乙醇，用1.5ml的75％的乙醇洗涤沉淀两次；
P、倒掉75％乙醇，加入无水乙醇冲洗后倒掉，晾干沉淀；
q、用100μlTE溶解，提取出DNA。
具体的是，所述步骤(7)包括以下步骤：
a、将-83～-78℃保存的农杆菌感受态放置于室温或指尖捏住片刻，待其部分融化后插入冰上；
b、加入目的质粒，轻轻混匀依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
c、向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌液体培养基，混匀后28℃，200rpm复苏2～3h；
d、吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含抗生素的YEP平板上，将平板倒置放于28℃培养箱培养2～3天；
e、挑单克隆进行菌液PCR验证。
本发明具有以下有益效果：通过PCR技术从盐胁迫处理的蒺藜苜蓿品种R108基因组中克隆获得启动子的核苷酸序列；通过对该启动子的元件进行分析，发现其有多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件分布；利用启动子MsPro1构建报告基因GUS的植物表达载体，通过农杆菌侵染法转化植物，获得转基因拟南芥；实验证实转基因拟南芥在盐处理条件下，报告基因GUS的表达活性比对照显著升高，表明启动子MsPro1是一个受盐胁迫诱导表达的启动子；该启动子可应用于植物耐盐基因研究或耐盐基因工程育种。
附图说明
图1为未转基因对照拟南芥在不同浓度盐胁迫处理条件下的GUS染色分析图。
图2为转基因拟南芥在不同浓度盐胁迫处理条件下的GUS染色分析图。
具体实施方式
现在对本发明作进一步详细的说明。
一种响应光、脱落酸、赤霉素、生长素和盐胁迫的苜蓿基因MTR_1g077660的启动子MsPro1的编码序列及其应用，该启动子的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示，其是通过PCR技术从盐胁迫处理的蒺藜苜蓿品种R108基因组中克隆获得。
一种苜蓿基因的启动子的盐胁迫的分析方法，包括以下步骤：
1、抗盐基因挖掘
首先将蒺藜苜蓿R108培养至适合大小，使用适量浓度氯化钠处理0小时、1小时、6小时、12小时，分别取地上部分和地下部分，进行转录组测序；对蒺藜苜蓿R108的RNA-seq测序结果进行分析，以0.5％氯化钠溶液处理R108，0小时作为对照，筛选出0.5％氯化钠溶液处理R108，1小时、6小时、12小时，表达量均上调的基因，分别为MTR_4g035905、MTR_0200s0050、MTR_5g064550、MTR_7g103390、MTR_5g022970。表达量均下调的基因，分别是MTR_7g099265、MTR_1g077660、MTR_2g087430、MTR_3g070210、MTR_4g068340、MTR_4g083340、MTR_5g074500、MTR_2g081770、MTR_2g101920、MTR_8g074570。其中，未在NCBI上查询到MTR_0200s0050和MTR_7g099265启动子序列，因此共设计启动子引物13对，用于克隆以上基因的启动子，构建抗盐基因工程载体。
2、载体构建及农杆菌转化
(1)DAN提取：用蒺藜苜蓿土培苗提取DNA，包括以下步骤：
a、65℃预热2×CTAB。
b、取植物材料(1～3g)液氮研磨至研钵侧壁粉末成片下落为宜。
c、将15ml预热好的CTAB和150μl巯基乙醇还原剂加入50ml离心管中混匀。
d、将研磨好的材料加入离心管中混匀，65℃水浴60～90min，每10min摇晃一次(注意放气)。
e、冷却至室温，加入10ml氯仿辛醇，抽提10min；称重配平，10000rpm室温离心10min，取上清，重复抽提一次。
f、吸取确定体积的上清(通常10ml)，加入400μl的5mol/L的NaCl，充分混匀。
g、加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，产生絮状沉淀。
h、用剪口的蓝枪头吸取大块絮状沉淀至10ml的离心管中(用枪头将沉淀挑到管壁上，将多余溶液吸去)，之后加入75％无水乙醇，静置于冰上15～20min。
i、50ml离心管中的剩余沉淀放入-20℃冰箱10min，之后离心10min，无水乙醇倒掉，加75％乙醇洗涤沉淀(2遍)，最后将其放进新的10ml离心管中。
j、将离心管中的液体吸出，再次加入75％的乙醇洗涤沉淀，然后加入无水乙醇冲洗，倒掉无水乙醇后晾干沉淀。
k、用100μlTE溶解(4℃过夜，第二天电泳检测DNA质量)。
(本次取材为1.5g左右，若材料量不同，试剂用量请同比例改变)。
若检测质量不佳(或者DNA呈粘稠状)，就再加入900μ1的TE于管中，继续进行下列步骤：
l、加入TE后放在4℃冰箱，充分溶解后(没有明显的块状物)，加入10μlRNase，放37℃水浴30min，消化掉RNA。
m、从水浴锅取出后加入1ml氯仿辛醇，抽提10分钟，10000rpm离心10分钟。
n、用剪口的蓝枪头吸取大约800μ1上清液，分装到两个2ml离心管中。
o、加入2.5倍体积的无水乙醇，放在-20℃沉淀20分钟，取出10000rpm，离心10分钟，倒掉无水乙醇，用1.5ml的75％的乙醇洗涤沉淀两次。
P、倒掉75％乙醇，加入无水乙醇冲洗后倒掉，晾干沉淀。
q、用100μlTE溶解。
(2)PCR扩增
体系：
程序：
(3)胶回收，用胶回收试剂盒将目的片段回收。
(4)同源重组连接、转化及菌落PCR
同源重组连接(诺唯赞)体系：
37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。转化大肠杆菌感受态细胞，并进行菌落PCR鉴定。
菌落PCR：
体系：
程序：
(5)质粒提取及酶切验证：根据菌落PCR结果进行摇菌培养，提取质粒，进行酶切验证。
37℃金属浴30min。
(6)根据酶切结果选取菌落送样测序。
(7)质粒转农杆菌感受态：选取送测结果正确的大肠杆菌提取质粒用于转化农杆菌感受态：
a、将-83～-78℃保存的农杆菌感受态放置于室温或指尖捏住片刻，待其部分融化后插入冰上。
b、加入目的质粒，轻轻混匀依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。
c、向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌液体培养基(YEP)，混匀后28℃，200rpm复苏2-3h。
d、根据实验需要，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含抗生素(kan+rif)的YEP平板上，将平板倒置放于28℃培养箱培养2～3天。
e、挑单克隆进行菌液PCR验证。
3、拟南芥转化及筛选
a、取验证成功的农杆菌(GV3101)接种于100mlYEP液体培养基(kan+rif)，28℃，250rpm恒温摇床过夜。
b、当菌液的0D600值在0.8-1.5之间时，即可进行转化。0D600在1.2左右时转化效果最好。
c、室温4000rpm，离心15min收集菌体。
d、配置等体积重悬液重悬菌体(100ml)
蔗糖 5％ 5g
Silwet L-77 0.02％ 20μl
e、将拟南芥植株倾斜，使花序浸入装有菌液的培养皿中，浸泡2min后取出。
f、将转化后的植株用黑色塑料袋罩住，第二天去除。
g、纯合体拟南芥的筛选：被农杆菌浸染的拟南芥收获种子后，将其播种于含Basta(20mg/l)的MS平皿上，选择抗性植株移苗，单株收种，检测后代，直到筛选出转基因拟南芥纯合体。
3、盐胁迫处理及GUS染色
a、将验证成功的株系收种，晾晒后种子播种于MS平皿(含20mg/l Basta)上，生长至10天后，移苗到含有不同浓度NaCl(0mM、50mM、100mM、150mM)的MS板上，7天后取苗进行GUS染色，结果如图2所示，与MS相比，50mM NaCl、100mM NaCl及150mM NaCl盐处理的转基因拟南芥随着盐浓度的变化GUS染色颜色也发生不同程度的变化，如图1，未转基因的对照拟南芥在不同程度盐胁迫处理条件下并无GUS染色出现，说明克隆获得的启动子MsPro1确实是受到盐胁迫诱导调控的。
本发明不局限于上述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
SEQ ID NO.1
CTCCTCTTTTGGTACACTTATTAAAATTGAAAACCAAAATCACTCACCTTCTCTTGCACTTCAAGCAACAACCTTGTGGACTACTAGACTTGTCAATCAAGTAGGTAAACAAGTGAAGAAACCTCCTTGTGTGTCCTGCACTTCAAGAGATGCATTGCAACCCATATGCCTTTTTTTAAAAAAAAGGCAGGGCAGCCCGGTGTACTAAAGCTCCCGCATACGCAGGCCGGGTCTGGAACGGGGCTCCACCATTTGATGTATAGTACGCAGTCTTACCCTGTTTTTTACACAAGAGGTTGTTTCTAGGAATGGAACATGTGATATTTCAGTCACATGACAATAACTTTACCGTTGCGCCAAAGCTCCCCCTTATATTTATCCAACCCATATGCCTTTTGAAGCAAAAAAAAAAAAAAAAGCCTTATATTTATGTTTTCTTGATAAATAAGTAGCATCGTCAACTTTCTTGAGAAACAAGAAAAAAATTCTAACAAGATTTTGAGTCACACTCAACAACTTATTATATTTTTTGTAGCTTTGTCAATAATTTTTTTAATATATTTTTACAAATATAGCCTTTTAGATGATATATTTGATTTGTTTTGTATAAGACCAAAACTTTAAGAGAAGTATTATTAATATTATTACAGTTATATCATGGATTGTATTTTAATTATTTTTTTTGTTAAAATATCCTTTTAGATAATATACAATTTTTTTAAGAAAGATCATATACAATTTTTTTTGAAGTAGATAATATACAATTTTGTTAACTATATTTTATTTTTCTACATTAGTGAACATGCCTCTATATACATATAAAAGATGCTTAAAACGGTCCTCTATAATGGATGAGGAAGAAGAATGAGAAAGCTAGAGATAAGGATTTTCTTAAAAAATAAAATAGTTAGAGATAAGATGGAGCATCTCTCTAAAAATTAGTGTTCGTTAAAGTTTTAATTTTTTTAATAAAATCAGAAAAAACATGATACGAATAAATATTTTAAATGAGACACATGATATGATATTGTTCTTGTCTGGGTCCATGCCCAACCCTTGATAGGTTTTGGATAGGTCCTACAAGGCCCATATGGGCTATGGCATGGACCTCTCTTAGTACCATACTCGAACAATGACTCTTGAAGGCAATATAGACCATCCTGTGCAGATCCAATGTCAACTCCTCTTAATCTGCTCACAACTGTCCATTGAGGACTCTAACTATCCTTTGAGGACAATTGTTGAGTAAAGGGTTCTAGGATCAAAACCCTAAACCTACATTATAAATACTAACTCCACGACATTTGCTTAGGTACACATACTCCTACTATAAATACCATATCAATCACGACACTGAATGGCTTGAACGATGGAGTATGCACGTACACCACACCCTTATTCATTGAAGAAGAAGCTGCTGCTGTACTAAAGTACCTTACTCTAAGACAATTCAACGCCCTCACTAAAGGATTTCAGGTCTATCAGAATCAGCGATGGAGAGAGTACTTTTTTGTCCAAGTGTATATTTGTAATTAATACTATGCACAACACTTCAAAGATCAAAGTCATTATATTTCACTTTACATTTTCCCTCCAAAAAAAAAAATAATCACTTTGCATTTATCATAATGATGATAATGATGAACACACATCGATCTCTGATAAGAATAATTTGATAAAATTAATACTTCTTTGATTTATATGGTATTTTCTTAATGTGTACGACATGAGCCTACTCAAAAATTTGAATCACATGTGTCCAAAAATTTGAAACTAGGTACTAAAAATTATAGCACTTAAGTGTAGTTGTGCTCTTGCATCATCTTCGTCTAAGAATAGAAATTAAATAAAAGTTAGCACATTCTACTATCTCTAATAAACTGGAATTAAAAATAGGATGCTTTGTCCTGAATCTTGATTAATATAATATCCTCATGTTGAGACATGCGGTACATCCAAATTATTTCTCTATAAATACAAATGATACTCCTCTAGTTTAG

Claims (4)

1.一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法，其特征在于，包括抗盐基因启动子的挖掘和载体构建及农杆菌转化；
载体构建及农杆菌转化包括以下步骤：
(1)DAN提取：用蒺藜苜蓿土培苗提取DNA；
(2)通过配制的带有模板DNA的第一溶液进行PCR扩增；
(3)胶回收，用胶回收试剂盒将目的片段回收；
(4)同源重组连接、转化及菌落PCR鉴定：
a、将配制的带有胶回收产物的第二溶液进行同源重组连接，第二溶液在37℃反应30min，降至4℃或立即置于冰上冷却；
b、转化大肠杆菌感受态细胞，并通过第三溶液进行菌落PCR鉴定；
(5)质粒提取及酶切验证，根据菌落PCR结果在第四溶液中进行摇菌培养，提取质粒，进行酶切验证；
(6)根据酶切结果选取菌落送样测序；
(7)质粒转农杆菌感受态，选取送测结果正确的大肠杆菌提取质粒用于转化农杆菌感受态；
(8)拟南芥转化及筛选：
a、取验证成功的农杆菌接种于100ml YEP液体培养基，28℃，220rpm恒温摇床过夜；
b、当菌液的0D600值在0.8～1.5之间时，即可进行转化；
c、室温4000rpm，离心15min收集菌体，配置等体积重悬液重悬菌体；
d、将拟南芥植株倾斜，使花序浸入装有菌液的培养皿中，浸泡2min后取出；
e、将转化后的植株用黑色塑料袋罩住，第二天去除；
f、纯合体拟南芥的筛选，被农杆菌浸染的拟南芥收获种子后，将其播种于含20mg/l的Basta的MS平皿上，选择抗性植株移苗，单株收种，检测后代，直到筛选出转基因拟南芥纯合体；
(9)盐胁迫处理及GUS染色：
将验证成功的株系收种，晾晒后种子播种于20mg/l的Basta的MS平皿上，生长10天后，移苗到含有不同浓度NaCl的MS板上，7天后取苗进行GUS染色，不同浓度NaCl处理的拟南芥随着盐浓度的变化GUS染色颜色也发生不同程度的变化，由此克隆获得的启动子MsPro1受到盐胁迫诱导调控。
2.根据权利要求1所述的一种苜蓿基因启动子的盐胁迫的分析方法，其特征在于，所述抗盐基因启动子的挖掘包括以下步骤：
a、将培养后蒺藜苜蓿R108使用适量浓度NaCl处理0小时、1小时、6小时、12小时，分别取地上部分和地下部分，进行转录组测序；
b、对蒺藜苜蓿R108的RNA-seq测序结果进行分析，以0.5％氯化钠溶液处理R108 0小时作为对照，筛选出0.5％氯化钠溶液处理R108 1小时、6小时、12小时后表达量均发生变化的基因，然后设计引物对筛选出的13个基因进行启动子的克隆，构建抗盐基因工程载体。
3.根据权利要求1所述的一种苜蓿基因的启动子的盐胁迫的分析方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：
a、65℃预热CTAB；
b、取1～3g植物材料液氮研磨至研钵侧壁粉末；
c、将预热后的15mlCTAB和150μl巯基乙醇还原剂加入50ml离心管中混匀；
d、将研磨后的植物材料加入离心管中混匀，65℃水浴60～90min，每10min摇晃一次；
e、冷却至室温，加入10ml氯仿辛醇，抽提10min，称重配平，10000rpm室温离心10min，取上清，重复抽提一次；
f、吸取10ml上清，加入400μl的5mol/L的NaCl，充分混匀；
g、加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，产生絮状沉淀；
h、用剪口的蓝枪头吸取大块絮状沉淀至10ml的离心管中，之后加入75％无水乙醇，静置于冰上15～20min；
i、50ml离心管中的剩余沉淀放入-20℃冰箱10min，之后离心10min，无水乙醇倒掉，加75％乙醇洗涤沉淀，最后将其放进10ml离心管中；
j、将离心管中的液体吸出，再次加入75％的乙醇洗涤沉淀，然后加入无水乙醇冲洗，倒掉无水乙醇后晾干沉淀；
k、用100μlTE溶解，若检测质量不佳或者DNA呈粘稠状，再加入900μ1的TE于管中，继续进行下列步骤：
l、加入TE后放在4℃冰箱，充分溶解后，加入10μlRNase，放37℃水浴30min，消化掉RNA；
m、从水浴锅取出后加入1ml氯仿辛醇，抽提10分钟，10000rpm离心10分钟；
n、用剪口的蓝枪头吸取大约800μ1上清液，分装到两个2ml离心管中；
o、加入2.5倍体积的无水乙醇，放在-20℃沉淀20分钟，取出10000rpm，离心10min，倒掉无水乙醇，用1.5ml的75％的乙醇洗涤沉淀两次；
P、倒掉75％乙醇，加入无水乙醇冲洗后倒掉，晾干沉淀；
q、用100μlTE溶解，提取出DNA。
4.根据权利要求1所述的一种苜蓿基因的启动子的盐胁迫的分析方法，其特征在于，所述步骤(7)包括以下步骤：
a、将-83～-78℃保存的农杆菌感受态放置于室温或指尖捏住片刻，待其部分融化后插入冰上；
b、加入目的质粒，轻轻混匀依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
c、向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌液体培养基，混匀后28℃，200rpm复苏2～3h；
d、吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含抗生素的YEP平板上，将平板倒置放于28℃培养箱培养2～3天；
e、挑单克隆进行菌液PCR验证。
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