CN116622726A - 一种烟草钾离子通道基因NtKAT3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种烟草钾离子通道基因NtKAT3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的一种烟草钾离子通道基因NtKAT3，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtKAT3基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtKAT3基因发生编辑的烟草植株。在MS培养条件下，所述基因发生编辑的成熟期烟草植株的打顶株高、腰叶长、腰叶宽及自然株高均低于基因未发生编辑的烟草植株。同时对NtKAT3基因编辑植株中钾含量进行测定，发现在现蕾期、打顶期、成熟期基因编辑植株中钾含量均低于基因未发生编辑的烟草植株。这为研究烟草生长发育与产量品质相关基因功能提供了遗传材料和理论依据。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种烟草钾离子通道基因NtKAT3及其应用。
背景技术
烟叶含钾量是衡量烟叶品质的重要指标之一，烟草是一种需钾量较大的植物。KAT型钾离子通道是一种内向型钾离子通道，主要在叶中表达，特别是在叶中的保卫细胞中表达，通过介导钾离子的内流，引起保卫细胞渗透压增加，吸水使其保卫细胞体积增大，气孔开放。
拟南芥中研究表明，将2个KAT型钾离子通道(KAT1和KAT2)敲掉1个时，保卫细胞内向钾电流明显减小，但不影响其气孔的开放程度及植株的生长；当同时使KAT1和KAT2缺失功能时，突变体植株在气孔的开闭与野生型相比都明显延迟，显著降低了植物生物量的积累。烟草中钾含量不仅影响烟草的生长发育，同时也影响着卷烟产品的燃烧性，研究烟草钾离子通道对烟草生长发育与产量品质具有重要意义。目前对于烟草钾离子通道基因(NtKAT3)的基因功能及应用暂无研究。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种烟草钾离子通道基因NtKAT3及其应用，为研究烟草生长发育与产量品质相关基因功能提供遗传材料和理论依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种烟草钾离子通道基因NtKAT3，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，包括1920bp个碱基，该基因来源于烟草(Nicotianatabacum，命名为NtKAT3)。
本发明第二方面提供了一种烟草钾离子通道基因NtKAT3的编码蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括639个氨基酸。
本发明第三方面提供了一种上述烟草钾离子通道基因NtKAT3在烟草生长发育方面的应用，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtKAT3基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtKAT3基因发生编辑的烟草植株。
优选地，所述基因发生编辑的成熟期烟草植株在MS培养条件下打顶株高、腰叶长、腰叶宽及自然株高均低于基因未发生编辑的烟草植株。
优选地，所述基因发生编辑的烟草植株钾含量在现蕾期、打顶期、成熟期均低于基因未发生编辑的烟草植株。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过NCBI数据库CDD与DeepTMHMM分析氨基酸序列的保守结构域与跨膜结构域，表明NtKAT3为钾离子通道，同时具有4个跨膜结构域。
2、本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtKAT3基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtKAT3基因发生编辑的红花大金元突变体植株。
3、本发明通过在MS培养条件下，成熟期进行NtKAT3基因编辑植株与基因未发生编辑的烟草植株(下文称对照植株)农艺性状调查，NtKAT3基因编辑植株中打顶株高、腰叶长、腰叶宽及自然株高等农艺性状均低于对照植株。同时对NtKAT3基因编辑植株中钾含量进行测定，发现在现蕾期、打顶期、成熟期基因编辑植株中钾含量均低于对照植株。
4、本发明利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtKAT3基因获得影响植株生长发育与烟草品质的基因编辑植株，这为烟草钾离子通道研究及烟草生长发育与产量品质研究提供遗传材料和理论依据。
附图说明
图1为NtKAT3氨基酸序列保守结构域；
图2为NtKAT3氨基酸序列跨膜结构域；
图3为对照植株和基因编辑植株在成熟期MS培养条件下，进行植株有效叶数、打顶株高、腰叶长、腰叶宽、自然株高及自然叶数的测定；
图4为对照植株和基因编辑植株在现蕾期、打顶期及成熟期MS培养条件下进行钾含量的测定。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。
本申请中所使用的烟草品种为红花大金元，一种商品化烟草品种。
实施例1
本实施例主要就烟草钾离子通道相关基因NtKAT3的获得过程，简要介绍如下。
以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用：
按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。
1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：
TotalRNA 1μg
Oligo(dT)(10μM) 1.5μL
ddH2O up to 15μL
将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：
上述体系放入PCR仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。
通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：
F：5’-ATGTCGTACTCGGATACGGCG-3’，(SEQ ID No.3)
R：5’-TCAAAATATATACAAGTGATC-3’；(SEQ ID No.4)
以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：
扩增体系(50μL)：
混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2.5min，共30个循环；72℃10min；12℃Hold。
对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草钾离子通道相关基因NtKAT3序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，共包括1920bp个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括639个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。
实施例2
利用实施例1中所获得烟草钾离子通道相关基因NtKAT3，本发明进一步构建了CRISPR/Cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。
选择NtKAT3基因中较特异的23nt核苷酸序列(SEQ ID No.5)为CRISPR/Cas9的引导序列，并将该序列片段与CRISPR/Cas9载体(由西南大学提供)进行连接，获得转化的克隆子，进行PCR扩增检测，后将PCR阳性克隆送测序公司进行测序确认，最后得到CRISPR/Cas9-NtKAT3编辑载体。
利用上一步所构建的CRISPR/Cas9-NtKAT3编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化试验，以敲除植物体内的烟草钾离子通道相关基因NtKAT3。
将获得的NtKAT3基因编辑植株进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得NtKAT3基因编辑植株。
实施例3
在成熟期对基因编辑植株与对照植株分别进行烟草植株株高、腰叶长、腰叶宽测定，基因编辑植株中打顶株高、腰叶长、腰叶宽及自然株高均低于对照植株(结果如图3所示)。同时测定现蕾期、打顶期及成熟期叶片中钾含量，基因编辑植株中钾含量均低于对照植株(结果如图4所示)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种烟草钾离子通道基因NtKAT3，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述烟草钾离子通道基因NtKAT3的编码蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述烟草钾离子通道基因NtKAT3在烟草生长发育方面的应用，其特征在于，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtKAT3基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtKAT3基因发生编辑的烟草植株。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因发生编辑的成熟期烟草植株在MS培养条件下打顶株高、腰叶长、腰叶宽及自然株高均低于基因未发生编辑的烟草植株。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因发生编辑的烟草植株钾含量在现蕾期、打顶期、成熟期均低于基因未发生编辑的烟草植株。
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