CN116617184A - 一种基于pH可逆激活光敏剂的诊疗一体化纳米胶囊的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于pH可逆激活光敏剂的诊疗一体化纳米胶囊的制备及应用，属于先进功能材料和生物医药技术领域。本发明所述的制备诊疗一体化纳米胶囊的方法包括如下步骤：(1)通过化学反应设计合成pH可逆激活型光敏剂BAC808；(2)选取两亲性材料DSPE‑PEG‑S‑S‑PEG‑DMMA和DSPE‑PEG‑cRGD为载体，制备负载BAC808的纳米胶囊。本发明制备得到的诊疗一体化纳米胶囊具有智能肿瘤靶向性、微环境响应型精准成像指引的光动力/光热治疗效果、以及良好的水分散性和生物相容性，具有巨大的应用潜力。

Description

一种基于pH可逆激活光敏剂的诊疗一体化纳米胶囊的制备及 应用

技术领域

本发明涉及一种基于pH可逆激活光敏剂的诊疗一体化纳米胶囊的制备及应用，属于先进功能材料和生物医药技术领域。

背景技术

恶性肿瘤一直是威胁人类生命健康安全的重大疾病之一。我国对于早期癌症的诊断率较低，随着肿瘤分期发展，治疗效果越来越差，患者的存活率降低。因此，发展一种简便、高效、安全的肿瘤早期诊断检测方法，进而实现对各类肿瘤的治疗，对于挽救生命至关重要。

光学疗法一直被认为是一种有前途的肿瘤治疗方法，因为它们具有时空精度高、侵入性和副作用小等优良特性。它们通常依赖于可激发的光活性荧光团，例如由特定波长的光触发的光敏剂。因此，设计可发射型光敏剂对于实现成像指引的光学治疗具有实际意义，因为它可以同时提供诊断和治疗，实时监测肿瘤治疗过程中的治疗效果。此外，与传统的“always on”探针相比，可逆激活型光敏剂尤其引人注目，因为它们能够实现对肿瘤的特异性成像治疗，同时减少了毒副作用。然而单独的光敏剂通常具有较差的水分散性、生物相容性以及肿瘤靶向性，阻碍了其在生物治疗领域的发展。随着纳米技术的发展，基于纳米平台的诊疗体系为解决该问题开辟了新的思路。因此，设计、合成一种兼具优异的生物相容性、理想的肿瘤靶向性以及可激活型荧光成像、治疗能力于一体的新型纳米材料，已然成为肿瘤诊疗领域的新挑战。

发明内容

[技术问题]

传统光敏剂大多为“always on”型探针，存在着较强的背景干扰以及对正常细胞的非特异性损伤。此外，单独的光敏剂大多具有较差的水分散性、生物相容性以及肿瘤靶向性，严重影响了其在生物体内的成像和治疗效果。

[技术方案]

为了解决上述问题，本发明设计合成了负载pH可逆激活光敏剂的诊疗一体化纳米胶囊，并将其用于肿瘤精准荧光成像指引的光热/光动力联合治疗，其克服和解决了传统光敏剂背景干扰高、非特异性损伤大以及肿瘤靶向性差等导致的治疗效果不理想的问题。

本发明的第一个目的是一种基于pH可逆激活光敏剂的光热/光动力/荧光诊疗一体化纳米胶囊的制备方法，包括如下步骤：

将pH可逆激活型光敏剂BAC808、DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA(含有二硫键的两亲性二硬脂基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)功能化的聚乙二醇)和DSPE-PEG-cRGD(DSPE和环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)多肽功能化的聚乙二醇)溶于有机溶剂中，混匀后缓慢滴加超纯水中，一段时间后除去有机溶剂，得到光热/光动力/荧光诊疗一体化纳米胶囊，记作DMMA@cRGD@BAC808；

其中，pH可逆激活型光敏剂BAC808的结构如式I所示：

在本发明的一种实施方式中，所述BAC808、DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA和DSPE-PEG-cRGD的质量比为1：(1-2)：(1-2)。具体可选1:1.5:1.5。

在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂可选四氢呋喃。

在本发明的一种实施方式中，有机溶剂与水的体积比为1：(8-10)。具体可选1:9。

在本发明的一种实施方式中，除去有机溶剂后通过滤膜过滤，过滤后得到DMMA@cRGD@BAC808。相应滤膜的直径是0.22μm。

在本发明的一种实施方式中，所述pH可逆激活型光敏剂的合成方法包括：

(a)以化合物1和3-甲基2-丁酮为起始物，反应得到化合物2；(b)以化合物2和化合物3为反应底物，反应得到化合物4；(c)向化合物4的乙醇溶液中加入碱试剂，混匀反应；(d)反应结束后，除去乙醇并将其重新溶解在水中，酸试剂酸化，离心，收集固体，洗涤，干燥，得到式I所示结构的化合物，记作BAC808；

其中，化合物1：化合物2：/>化合物3：/>化合物4：/>式I化合物：/>

在本发明的一种实施方式中，步骤(a)中，化合物1与3-甲基2-丁酮的摩尔比为1：(1-2)；反应的温度为80-120℃，反应的时间为12h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(b)中，化合物2与3的摩尔比为1：(1-2)；反应的温度为80-120℃，反应的时间为12h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(c)中，碱试剂为氢氧化钠饱和溶液；在溶剂中的体积比为10％-20％；反应的温度为50℃，反应的时间为6h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(d)中，去除乙醇的方法是负压蒸发，温度为40-50℃。

在本发明的一种实施方式中，步骤(d)中，酸试剂为1M盐酸溶液，酸化至pH 4-5。

在本发明的一种实施方式中，步骤(d)中，离心的转速为6000-8000rpm，时间为5min-10min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(d)中，洗涤沉淀物次数为2-4次；洗涤的溶剂为超纯水。

在本发明的一种实施方式中，步骤(d)中，干燥的方法是冷冻干燥。

本发明的第二个目的是上述方法制备提供一种基于pH可逆激活光敏剂的诊疗一体化纳米胶囊DMMA@cRGD@BAC808。

本发明的第三个目的是提供一种上述诊疗一体化纳米胶囊在生物成像试剂制备中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种活细胞成像或者活体成像的方法，所述方法是利用上述诊疗一体化纳米胶囊作为探针。所述的细胞具体可以包括小鼠鳞状细胞癌细胞SCC-7。

本发明的第五个目的是将上述的诊疗一体化纳米胶囊用于治疗肿瘤的药物制备中。

[有益效果]

(1)本发明制备得到的DMMA@cRGD@BAC808具有pH响应性能，弱酸性微环境激活的近红外吸收发射使其能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，展现了特异性强、灵敏度高且生物毒副作用小等特性。

(2)本发明制备得到的DMMA@cRGD@BAC808能够作为诊疗一体化探针，在808nm激光的激发下，实现对肿瘤的近红外成像指引协同光热/光动力治疗，克服了单一治疗的缺陷，极大地提高了治疗效果。

(3)本发明制备得到的DMMA@cRGD@BAC808不仅具有优异的水分散性、生物相容性，同时DMMA@cRGD@BAC808中的DMMA和cRGD赋予了其较长的血液循环时间以及理想的肿瘤智能靶向特性，使其可作为肿瘤靶向响应型诊疗一体化纳米材料实现对活体的肿瘤诊断和治疗。

附图说明

图1为实施例1所制备的pH可逆激活型光敏剂BAC808的核磁图。

图2为实施例1所制备的pH可逆激活型光敏剂BAC808的质谱图。

图3为实施例1所制备的化合物4、BAC808和DMMA@cRGD@BAC808的红外光谱图。

图4为实施例1所制备的DMMA@cRGD@BAC808的透射电镜图。

图5为实施例1所制备的DMMA@cRGD@BAC808的紫外吸收光谱和荧光发射光谱图。

图6为实施例1所制备的DMMA@cRGD@BAC808的产生单线态氧能力的图，其中A₀和A分别为光照前410nm处DPBF溶液的紫外吸收强度和光照后410nm处DPBF溶液的紫外吸收强度。

图7为实施例1所制备的DMMA@cRGD@BAC808光热效果图。

图8为实施例1所制备的BAC808和DMMA@cRGD@BAC808的细胞暗毒性图。

图9为实施例1所制备的DMMA@cRGD@BAC808的体外癌细胞杀伤效果图。

图10为实施例1所制备的DMMA@cRGD@BAC808的体内荧光成像图。

图11为实施例1所制备的DMMA@cRGD@BAC808的不同组小鼠治疗过程中的肿瘤相对体积变化图；V₀和V分别是治疗前和治疗后某一天的肿瘤体积。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

本发明涉及的DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA和DSPE-PEG-cRGD购自西安瑞禧生物科技有限公司。

实施例1

一种基于pH可逆激活光敏剂的诊疗一体化纳米胶囊的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)BAC808的合成：

化合物1与3-甲基-2-丁酮的摩尔比为摩尔比为1：1.2，加热到100℃，反应2h，冷却至室温用二氯甲烷萃取，浓缩，向所得红色液体中加入20mL冰醋酸，回流反应12h，冷却至室温，加入50mL二氯甲烷，用饱和的碳酸钠水溶液中和冰醋酸，二氯甲烷萃取，浓缩，柱层析分离，得到化合物2，产率为74％。

将制备的化合物2与化合物3按摩尔比为1：1分散在CH₃CN中，在80℃回流条件下剧烈搅拌过夜。混合物冷却至室温后，依次用二氯甲烷萃取，饱和碳酸钾水溶液和超纯水洗涤至中性，旋蒸浓缩。经柱层析分离，洗脱剂先为石油醚：乙酸乙酯＝10：1，后为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(V/V)得到化合物4，产率为42％。

将化合物4溶于30mL乙醇，再加入2mL饱和NaOH溶液，50℃搅拌6h后浓缩除去乙醇，加入30mL纯净水，用1M盐酸将溶液调节至酸性(pH 4-5)。将析出的沉淀用高速离心机8000rpm离心5min，得到的沉淀放入冷冻干燥机除去水分，得到BAC808。

通过核磁共振图、质谱图和傅立叶变换红外光谱对合成的BAC808的结构进行了表征。其核磁共振数据(图1)与质谱图(图2)与理论值相同。傅立叶变换红外(FT-IR)光谱中化合物4在1742cm^-1的酯基特征峰消失，产物在1715cm^-1处出现了新的吸收峰，为-COOH的特征峰，证明了BAC808的成功制备(图3)。

(2)DMMA@cRGD@BAC808的制备：

1.5mg DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA、1.5mg DSPE-PEG-cRGD和1mg BAC808溶于1mL四氢呋喃中，然后将溶液用1mL注射器在搅拌条件下逐滴滴入9mL纯净水中，在通风橱中室温搅拌除去四氢呋喃。12h后，将溶液用0.22μm的滤膜过滤，定容于10mL容量瓶中。

通过紫外可见分光光度计测量析出在瓶壁、注射器和滤膜上的BAC808的吸光值，参考BAC808的标准曲线计算出DMMA@cRGD@BAC808中BAC808的含量。通过傅立叶变换红外光谱对合成的DMMA@cRGD@BAC808进行了表征，1704cm^-1(C＝C)和1643cm^-1(-CONH-)特征吸收峰的出现证实了DMMA@cRGD@BAC808的成功合成(图3)。图4为其透射电镜图，可以看出制备的DMMA@cRGD@BAC808呈球形，平均直径约131.0±8.9nm。

对比例1

参照实施例1，仅改变步骤(2)中DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA、DSPE-PEG-cRGD和BAC808的用量1.5mg、1.5mg、0.3mg，其他不变，结果发现：合成的纳米胶囊包裹的探针量过少。

参照实施例1，仅改变步骤(2)中DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA、DSPE-PEG-cRGD和BAC808的用量为0.2mg、0.2mg、1mg，其他不变，结果发现：不能合成粒径均匀的纳米胶囊。

参照实施例1，仅改变步骤(2)中DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA、DSPE-PEG-cRGD和BAC808的用量0.2mg、1.5mg、1mg，其他不变，结果发现：合成的纳米胶囊无法实现酸性条件下的电荷反转，不适宜活体体内循环代谢。

实施例2

对实施例1所得的DMMA@cRGD@BAC808的光学性质进行探究：

取用DMMA@cRGD@BAC808(以BAC808浓度表示，1×10^-5mol L^-1)，用0.1M盐酸和0.1M氢氧化钠溶液分别将其调为酸性和碱性。用紫外可见近红外分光光度计测定其吸收光谱和荧光光谱仪扫描发射光谱(激发波长为其最大吸收波长)。

结果如图5所示，DMMA@cRGD@BAC808在碱性条件下在518nm处出现特征吸收峰，并无荧光发射。而当溶液转为酸性时，518nm处的特征吸收峰消失，808nm处出现很强的特征吸收，说明DMMA@cRGD@BAC808的激发波长为808nm，能够在808nm处有优异的激发效率。此外，酸性条件下DMMA@cRGD@BAC808的荧光亦被特异性激活，在830nm附近出现很强的近红外荧光发射。更重要的是，当探针溶液由酸性转至碱性时会发生上述过程的逆过程。该pH特异性可逆响应特性使得所得探针有望实现肿瘤环境呈弱酸性微环境特异性激活的高信噪比近红外荧光成像，同时还为肿瘤特异性治疗提供了可能。

同时，本发明还对比了其他光敏剂(结构如式II所示)，参照实施例1中的相同方法制得相应的纳米胶囊。

测定光学性质，结果发现：该纳米胶囊的激发波长为780nm，且在808nm的紫外吸收显著弱于DMMA@cRGD@BAC808，即DMMA@cRGD@BAC808在808nm处的激发效率要优于式II所示光敏剂所制备的纳米胶囊。

实施例3

对实施例1所得的DMMA@cRGD@BAC808的体外光动力/光热治疗效果进行探究：

(1)产单线态氧性能评价：

以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)为指示剂，取18mL浓度为6×10^-5M的DPBF溶液和2mL不同浓度的DMMA@cRGD@BAC808在50mL离心管中混合，所得溶液浓度分别为2.5×10^-6M，5.0×10^-6M和1.0×10^-5M，并将其pH调节至酸性。然后用功率密度为0.6W cm^-2的808nm激光灯照射5min。同时，用紫外可见近红外分光光度计在不同时间点测定了各溶液的紫外吸收光谱(0s，10s，20s，30s，40s，50s，60s，75s，1.5min，2min，3min，5min)。以相同条件下照射的碱性DMMA@cRGD@BAC808(1.0×10^-5M)和单独的DPBF作为对照组和空白组。

结果如图6所示，酸性条件下，随着光照时间的延长对应DPBF的紫外吸收逐渐降低，说明该过程有单线态氧的产生。而在碱性条件下，整个照射过程中未发现DPBF的荧光强度改变，说明碱性条件下没有单线态氧的产生。该实验结果证实只有在酸性条件下DMMA@cRGD@BAC808才具有产生单线态氧的能力，确保了肿瘤特异性光动力治疗，而不对临近正常组织造成损伤。

(2)光热性能评价：

将1mL不同浓度的酸性DMMA@cRGD@BAC808(以BAC808浓度表示，分别为2.5×10^-6M，5.0×10^-6M和1.0×10^-5M)放置在48孔板中。用功率密度为0.6W cm^-2的808nm激光灯照射10min。每隔1min用红外热像仪记录各溶液的温度。以相同条件下照射的碱性DMMA@cRGD@BAC808(1.0×10^-5M)和磷酸盐缓冲溶液作为对照组和空白组。

结果如图7所示，酸性条件下，探针溶液呈现出明显的升温效果，且随照射时间的延长和溶液浓度的增加而加强。与之相反，在碱性条件下，整个照射过程中未表现出明显的温度变化。由此可见，该探针仅在酸性条件下才具有强的光热转化效果，确保了肿瘤特异性治疗的可能。

实施例4

对实施例1所得的DMMA@cRGD@BAC808的细胞暗毒性以及细胞水平的光热/光动力杀伤效果评价。

(1)细胞暗毒性：

以3T3为例，向96孔板中加入1×10⁵cell/mL细胞悬液(100μL/孔)并孵育过夜。然后将培养基取出，加入100μL含不同浓度的探针(0，2.5，5，10，20，50μM)的新鲜培养基，每组平行5次，继续孵育24小时。去除培养基，PBS洗涤，加入100μL含0.5mg mL^-1MTT的新鲜培养基继续培养4h。弃去培养液，PBS洗涤，加入100μL DMSO，置于37℃恒温摇床避光震荡30min后用酶标仪测量570nm波长下的吸光度。

结果如图8所示，直到探针浓度高达50μM，3T3细胞的相对存活率仍高于90％，即此浓度下该探针没有明显的细胞毒性。此外，相比于单独的BAC808，该诊疗一体化纳米胶囊具有更低的细胞毒性，可用于细胞成像研究。

(2)细胞水平的光热/光动力杀伤效果评价：

细胞培养与孵育同上述细胞毒性试验。待细胞与探针(1×10^-5M)孵育后调节培养体系pH为6.5，用808nm 0.6W cm^-2激光器照射3，5和10min，然后再孵育12h。12h弃去培养基，PBS洗涤，加入100μL含0.5mg mL^-1MTT的新鲜培养基继续培养4h。去除孔内液体，PBS洗涤，加入100μL DMSO，置于37℃恒温摇床避光震荡30min。用酶标仪测570nm波长下的吸光度。

结果如图9所示，探针浓度为1×10^-5M时，在pH 6.5条件下照射5min即可杀死90％左右的肿瘤细胞，而在正常体液条件下对正常细胞没有杀伤作用。证明了探针只有在弱酸性的肿瘤部位才能发挥作用。

实施例5

对实施例1所得的DMMA@cRGD@BAC808的活体成像性能以及活体治疗效果评价。

(1)活体成像性能：

为探讨DMMA@cRGD@BAC808对肿瘤的成像指示作用，将构建的SCC-7荷瘤小鼠随机分成三组，通过尾静脉分别注射相同浓度的BAC808、DMMA@BAC808和DMMA@cRGD@BAC808(1×10^-4M，150μL)。通过IVIS成像系统于不同时间点(0h、4h、6h、8h、10h、12h和24h)采集小鼠的荧光图像。

DMMA@BAC808通过如下方法制备：参照实施例1，仅在步骤(2)中不添加DSPE-PEG-cRGD，其他不变。

结果如图10所示，在注射BAC808的SCC-7荷瘤小鼠的肿瘤部位没有检测到荧光信号，这是由于单独的BAC808没有靶向性并且容易通过血液循环代谢排出体外。相比之下，尾静脉注射DMMA@BAC808后，小鼠的肿瘤部位出现强烈的荧光信号。产生这一现象的原因是，与有机小分子荧光基团相比，纳米胶囊增强的渗透和滞留效应以及其表面DMMA的电荷反转性能同时赋予了DMMA@BAC808延长的血液循环时间和理想的肿瘤靶向能力。此外，与DMMA@BAC808实验组相比，注射DMMA@cRGD@BAC808纳米胶囊SCC-7荷瘤小鼠肿瘤部位的荧光强度更高，这是因为仅在肿瘤微环境中暴露的cRGD增强了该纳米胶囊与肿瘤细胞的结合能力，证明了DMMA@cRGD@BAC808可用于活体肿瘤的高灵敏度近红外荧光成像。

(2)活体治疗效果评价

构建的SCC-7荷瘤小鼠分成5组(n＝3)：(1)不处理，(2)磷酸盐缓冲溶液+808nm激光(0.6W cm^-2，5min)，(3)DMMA@cRGD@BAC808，(4)DMMA@BAC808+808nm激光(0.6W cm^-2，5min)，(5)DMMA@cRGD@BAC808+808nm激光(0.6W cm^-2，5min)。每天用游标卡尺测量肿瘤尺寸，计算其体重和肿瘤体积变化数值。

结果如图11所示，第(4)组和第(5)组小鼠的肿瘤组织体积均明显受到抑制。其中，DMMA@BAC808+808nm激光治疗组的肿瘤在两周内呈现了复发趋势，而DMMA@cRGD@BAC808+808nm激光治疗组的肿瘤被彻底消除，说明DMMA@cRGD@BAC808具有更为优异的体内光动力/光热治疗效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种基于pH可逆激活光敏剂的光热/光动力/荧光诊疗一体化纳米胶囊的制备方法，包括如下步骤：

将pH可逆激活型光敏剂BAC808、DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA和DSPE-PEG-cRGD溶于有机溶剂中，混匀后缓慢滴加超纯水中，一段时间后除去有机溶剂，得到光热/光动力/荧光诊疗一体化纳米胶囊，记作DMMA@cRGD@BAC808；

其中，pH可逆激活型光敏剂BAC808的结构如式I所示：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BAC808、DSPE-PEG-S-S-PEG-DMMA和DSPE-PEG-cRGD的质量比为1：(1-2)：(1-2)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为四氢呋喃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，有机溶剂与水的体积比为1：(8-10)。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述pH可逆激活型光敏剂的合成方法包括：

(a)以化合物1和3-甲基2-丁酮为起始物，反应得到化合物2；(b)以化合物2和化合物3为反应底物，反应得到化合物4；(c)向化合物4的乙醇溶液中加入碱试剂，混匀反应；(d)反应结束后，除去乙醇并将其重新溶解在水中，酸试剂酸化，离心，收集固体，洗涤，干燥，得到式I所示结构的化合物，记作BAC808；

其中，化合物1：化合物2：/>化合物3：/>化合物4：/>式I化合物：/>

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，化合物1与3-甲基2-丁酮的摩尔比为1：(1-2)，反应的温度为80-120℃，反应的时间为12h；步骤(b)中，化合物2与3的摩尔比为1：(1-2)，反应的温度为80-120℃，反应的时间为12h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，碱试剂为氢氧化钠饱和溶液，在溶剂中的体积分数为10％-20％，反应的温度为50℃，反应的时间为6h；步骤(d)中，酸试剂为1M盐酸溶液，酸化至pH 4-5。

8.权利要求1-7任一项所述方法制备得到的光热/光动力/荧光诊疗一体化纳米胶囊。

9.权利要求8所述的光热/光动力/荧光诊疗一体化纳米胶囊在生物成像试剂制备中的应用。

10.权利要求8所述的光热/光动力/荧光诊疗一体化纳米胶囊在用于治疗肿瘤的药物制备中的应用。