CN116615170A - 用自组装肽和无定形磷酸钙加速牙齿再矿化和骨再生 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药用组织矿化领域，特别是用自组装肽进行牙齿再矿化和骨再生。在这些过程中使用自组装肽，如P11‑4，也称为寡肽‑104，会产生羟基磷灰石，羟基磷灰石也存在于天然牙釉质、牙本质和骨中。本发明人已经发现，通过添加无定形磷酸钙或钙和磷酸根离子，可以显著加速牙齿再矿化和骨再生，当将其混合在溶液中时，可以导致磷酸钙的立即沉淀，所述磷酸钙优选为无定形磷酸钙，即非结晶磷酸钙。然而，自组装肽的存在改变了沉淀的磷酸钙的结构，有利于诱导结晶，并协同加速形成结晶磷酸钙，特别是羟基磷灰石(HA)。因此，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含自组装肽，独立组合物中的钙离子和磷酸根离子，其如果在水的存在下混合，适于立即形成磷酸钙沉淀物，优选无定形磷酸钙(ACP)。本发明还提供了所述试剂盒的医药用途，特别是在牙齿中，用于病变的再矿化、凹坑和裂隙的矿化、敏感牙齿的治疗、盖髓和骨再生。

Description

用自组装肽和无定形磷酸钙加速牙齿再矿化和骨再生
本发明涉及药用组织矿化领域，特别是用自组装肽进行牙齿再矿化和骨再生。在这些过程中使用自组装肽，如P11-4，也称为寡肽-104，会产生羟基磷灰石，羟基磷灰石也存在于天然牙釉质、牙本质和骨中。本发明人已经发现，通过添加无定形磷酸钙或钙和磷酸根离子，可以显著加速牙齿再矿化和骨再生，当将其混合在溶液中时，可以导致磷酸钙的立即沉淀，所述磷酸钙优选为无定形磷酸钙，即非结晶磷酸钙。然而，自组装肽的存在改变了沉淀的磷酸钙的结构，有利于诱导结晶，并协同加速形成结晶磷酸钙，特别是羟基磷灰石(HA)。因此，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含自组装肽、独立组合物中适于立即形成磷酸钙沉淀物(例如无定形磷酸钙(ACP))的钙离子和磷酸根离子(如果在水的存在下混合)或优选包含至少50％ACP的磷酸钙颗粒悬浮液的磷酸钙颗粒。本发明还提供了所述试剂盒的医学用途，特别是在牙齿中，用于病变的再矿化、凹坑和裂隙的矿化、敏感牙齿的治疗、盖髓和骨再生。
蛀牙，又称龋齿，是世界上最常见的由产酸菌引起的疾病之一。它是由于细菌的代谢物，主要是细菌在分解牙齿表面或口腔生物膜中的食物碎片或糖类时产生的酸，导致牙齿材料的崩解。这导致脱矿质作用和再矿化过程之间的不平衡。牙釉质、牙本质和牙骨质等坚硬的牙齿结构被持续的脱矿质作用破坏，导致龋损的发生，最终形成牙洞。新发龋的最早标志是牙齿表面出现白垩色斑块，即所谓的白斑病(也特指早期龋损)，即亚表面病变。随着脱矿质作用的进展，病变的矿化表面(部分)塌陷和破裂，并在牙齿上出现微腔、空洞或洞。这被称为(部分)空洞性龋损或空洞。
牙齿病变，特别是龋齿病变的常见治疗方法是钻孔和填充牙齿。迄今为止，一旦龋损形成空洞，牙齿上出现洞，常用的治疗方法是有创性的。通常通过使用例如牙科手机(“钻头”)来去除腐烂的材料。可选地，可以使用激光、牙科勺或化学机械系统去除龋齿。
在去除(即挖掘)龋病的牙釉质和/或牙本质后，缺失的牙齿结构需要使用牙科修复材料，如封闭剂、汞合金、牙科复合材料、瓷或金。
然而，能够修复天然牙齿物质，而不失去宝贵的硬组织，然后用人体外来物质填充挖掘的病变是有利的，所述天然牙齿物质以羟基磷灰石为基础。例如，这种无缝再矿化可以减少继发龋的发生率，所述继发龋通常在填充边缘发生，或当填充失败时发生。
基于再矿化的无创方法已被建议用于治疗非空洞性龋损，即皮下病变。例如，经典的再矿化通过尝试局部应用氟化物来进行。
此外，牙釉质基质衍生物或自组装肽已被证明在亚表面龋损的再矿化中有效(Ruan等人，2013，ActaBiomater.9(7):7289-97；Ruan等人,2014，JVis Exp.10(89),doi10.379151606；Schmidlin等人,2016,J Appl Oral Sci.24(1),31-36；Alkilzy等人,2018,Adv Dent Res.29(1),42-47；Brunton等人,2013,Br Dent J,215:E6；Kind等人,2017,JDent Res.,96(7),790-797；Kirkham等人,2007,J Dent Res.,86,426-430)。在WO 2014/027012A1中，描述了一种将自组装肽靶向递送到牙齿亚表面病变的方法，其目的是使龋损再矿化。
PCT/EP2020/069360描述了用自组装肽预防和治疗空洞性龋损。
在WO 2017/168183A1中，描述了一种基于弹性蛋白样肽的仿生矿化磷灰石结构，其用作牙齿修复材料，特别是用于牙釉质的重建，以及用于治疗诸如龋齿的牙科疾病。
此外，已经开发了用于牙釉质再矿化和预防和/或治疗龋病或牙齿侵蚀的基于酪蛋白的策略(例如WO 00/06108A1和WO 2010/042754A2)。WO 02/094204A1已描述了将酪蛋白-磷酸肽-无定形磷酸钙复合物(CPP-ACP)和CPP稳定的无定形氟化钙-磷酸复合物与玻璃离子粘固粉组合作为再矿化牙齿修复材料。
其他磷酸钙颗粒，例如，包括无定形磷酸钙，也已用于脱矿化牙釉质的再矿化(例如，Weir等人，2012,J Dent Res.91(10):979-984；Meyer等人,2018.Open Dent J.12:406-423)。
在WO 2017/123986A1、US 2014/0186273 A1和US 2017/0000737A1中，描述了将基于釉原蛋白(Amelogenin)的生物矿化方法在牙本质超敏反应、牙齿美白或漂白以及龋病治疗的背景下用于牙齿修复。
在嵌合肽的引导下，还尝试用羧甲基壳聚糖/无定形磷酸钙颗粒(CMC/ACP)的纳米颗粒对脱矿化的牙釉质表面进行再矿化。为此所需的所述嵌合肽很长，并且包括两个功能结构域，包括可以将ACP转化为羟基磷灰石的釉原蛋白肽和一种已被发现与羟基磷灰石表面特异性结合的肽。形成了釉质样结构，其中CMC/ACP纳米颗粒被NaClO降解，并被嵌合肽引导成有序和定向的阵列(Xiao等人，2017，Dent.Mater.33(11):1217-1228)。
如WO 2004/007532A2所述，自组装肽已被证明成功用于亚表面病变的再矿化(例如，Kirkham等人，2007)，但问题仍然是再矿化不是很快，需要几周到几个月的时间才能在x线相片上或通过白斑病的外观变化可见(Brunton2013，Schlee 2017)。由于这个原因，仅自组装肽也不适合治疗龋齿病变，因为即使以组装的形式，即作为水凝胶，它们也可能在水凝胶变得足够再矿化和稳定之前被从空洞中去除。
自组装肽也已被教导可用于骨再生(例如，WO 2004/007532A2)，具有相同的矿化缓慢且在所述过程中缺乏体积稳定性的潜在临床缺点。
因此，根据现有技术，本发明人克服了这些问题中的至少一些问题，有利地，提供了用于牙齿病变和缺损的快速矿化和/或骨再生的组合物和制备方法。这个问题通过本文公开的本发明，特别是在权利要求的内容得以解决。
在一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，包括
a)自组装肽，所述自组装肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少70％一致性、优选地至少80％一致性的氨基酸序列，以及
b)(i)独立组合物中的钙离子和磷酸根离子，所述钙离子和磷酸根离子若在水的存在下混合适于立即形成优选为无定形磷酸钙(ACP)的磷酸钙沉淀物，其中所述组合物优选为溶液，或
(ii)磷酸钙颗粒，优选为包含至少50％ACP的磷酸钙颗粒悬浮液。
自组装肽
优选地，本发明中使用的自组装肽包括或由选自下表1中所列序列的序列组成。可用于本发明的自组装肽的净电荷通常为-2或更多的负电荷，例如，在中性pH下为-4，优选地，净电荷为-2。净电荷与电荷的间隔及其特定序列一起，使其能够特别好地与羟基磷灰石结合。
表1：优选的自组装肽。
SEQ ID NO:1、2、3、4或5的肽或包含所述序列的肽是本发明的自组装肽的具体实例。包含所定义序列的肽优选具有20个氨基酸或更少，例如15个氨基酸或更少，或12、13或14个氨基酸。优选为更短的肽，因为它们更容易合成，也更便宜。优选地，所述自组装肽包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1组成。由SEQ ID NO:1的序列组成的肽也被命名为P11-4或寡肽-104，并且其在整个发明中是优选的。例如，P11-4易于处理，例如溶解在水中。
可选地，本发明中所用的自组装肽包括自组装肽的混合物，其中所述自组装肽与SEQ ID NO:1具有至少70％、优选为80％的序列一致性。
自组装肽的特别有利的组合是：
·P11-4和P11-8。P11-4的净电荷为-2，即它与羟基磷灰石结合得特别好。P11-8和P11-4组合在显著低于仅P11-8或仅P11-4的浓度下自组装。
·P11-13和P11-14(SEQ ID NO:6:QQOFOWOFOQQ)。P11-13的净电荷为-6，也能很好地与羟基磷灰石结合。P11-14的净电荷为+4，但两者电荷总和为-2。P11-13和P11-14的组合在显著低于仅P11-13或仅P11-14的浓度下自组装。
·P11-29和P11-28(SEQ ID NO:7:OQOFOWOFOQO)。P11-29，净电荷为-4，也与羟基磷灰石结合非常好。p11-29和p11-28的组合在显著低于仅p11-29或仅p11-28的浓度下自组装。
·P11-29和P11-8。同样，在这种组合中，P11-29能很好地与羟基磷灰石结合，并且其与P11-8的组合降低了自组装所需的浓度。
自组装肽可以是包含Ac-N-末端和/或NH2-C-末端的修饰肽，优选为两者都修饰的修饰肽，或非修饰肽。由于非封闭形式倾向于开始脱氨基反应，因此优选封闭所有自组装肽(例如SEQ ID NO:1)的末端，以提高稳定性。
自组装肽优选不具有人内肽酶的限制性位点。它们也不需要包含细胞的特定识别基序。
在本发明的试剂盒中，所述自组装肽可以是单体形式、组装形式或它们的混合物。在本发明的上下文中，所使用的自组装肽(例如P11-4)可以在低pH下，特别是在低于7.5的pH下进行自组装。自组装肽(SAP)在低于7.5的pH下进行自组装这一术语意味着它们能够在低于7.5的pH下自组装。离子强度也影响所选择的自组装肽的组装状态。优选地，本发明中使用的自组装肽能够在低于7.5的pH和至少生理离子强度下自组装。高离子强度还导致自组装肽的组装(Maude，2011，Soft matter 7:8085-8098；Carrick，2008，Tetrahedron 63:7457–7467)。
本领域技术人员知道如何确定和测量溶液的离子强度。离子强度I通常根据公式I＝1/2∑zi 2bi计算，其中z是价因子，bi是第I个离子的摩尔浓度[mol/kg{H2O}]。求和∑为溶液中所有离子的总和。例如，150mM NaCl溶液的离子强度约为0.15mol/L。这也近似于血液的离子强度。口腔中唾液的离子强度通常低得多，例如约0.04mol/L。在本发明的上下文中，生理范围内的离子强度被认为对应于0.15mol/L的离子强度。
如果需要，自组装肽的浓度以及组合物中存在的分子和离子的类型可以影响机械特征。本发明中使用的包含自组装肽的组合物可以例如包含NaCl和/或其他盐，优选仅包含可溶性盐，以及任选地包含生物学上适用的缓冲液，例如Tris。
在一个实施方案中，在根据本发明的试剂盒中，所述自组装肽主要为单体形式，例如，至少50％、至少70％、至少80％或至少90％的自组装肽以非组装状态存在，例如，以单体状态或低阶聚集体存在。为此，如果肽在7.5或低于7.5的pH下组装，则组合物的pH可以高于肽开始进行自组装的pH(例如，P11-4的pH为7.5)，优选地，高于所述pH 0.1至0.5个pH单位，或高于所述pH 0.5个以上单位。pH可以在所述pH时缓冲以避免快速组装。发明人发现，在存在钙离子(例如浓度为0.01M–0.2M或0.1M-15M的钙离子)的情况下，可以诱导低阶聚集体，所述低阶聚集体通过溶液的不透明颜色表现。
水凝胶在施用后迅速开始聚集和形成，可能是有益的。因此，在缓冲或不缓冲的情况下，所述pH可以比肽开始进行自组装的pH高0.1至0.5个pH单位。在一个实施方案中，所述组合物可包含干燥的肽，例如可根据WO 2014/027012获得的肽。所述肽可以溶解在水中，同时直接形成单体肽的溶液。
在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒包括主要为组装形式的自组装肽(例如，至少50％、至少70％、至少80％或至少90％为组装形式或基本组装形式的自组装肽)，以及缓冲液(在使组装形式稳定的pH下)。组装的自组装肽通常形成水凝胶。
蛋白质组装状态的选择取决于几个因素。主要为单体或低阶聚集体形式的自组装肽改善了肽向脱矿牙釉质中的扩散，并且可能特别有利于治疗亚表面病变或小牙齿病变，例如部分空洞性病变或具有微腔的病变。主要为组装形式的自组装肽可以使肽更快作用，从而改善功能，特别是对于空洞或骨缺损。在自组装肽和试剂盒的其他组分混合后(任选地，在溶解后)，所得溶液的pH和离子强度通常将对自组装肽的组装起决定性作用。然而，靶位点的pH，例如具有酸性pH的龋齿病变，也可能影响组装状态。特别是，在酸性龋齿病变中，自组装肽组装并形成水凝胶。
(i)独立组合物中的钙离子和磷酸离子
在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含b)(i)独立组合物中的钙离子和磷酸根离子，所述钙离子和磷酸根离子如果在水的存在下混合，适于立即形成磷酸钙沉淀物，优选无定形磷酸钙(ACP)，其中所述组合物优选为溶液。
在先前对牙齿病变的快速再矿化的尝试中，如果使用磷酸钙，则通常以磷酸钙颗粒(例如，无定形磷酸钙，ACP)的形式使用，例如，Xiao等人，2017或Tung等人，2004(Compendium CE2 Vol.25Mo.9(Suppl.1))所教导的。然而，ACP是不稳定的，特别是在酸性介质中，或在小于9的pH下，而它在例如CMC/ACP的形式或在磷酸肽(CPP-ACP)的形式下是稳定的有利的。这也有缺点，例如，如Xiao等人所教导的，颗粒可能需要被分解，例如用NaOCl。本发明通过产生磷酸钙(例如原位的ACP)来克服这个问题。磷酸钙沉淀物，通常以ACP的形式，形成上述一定浓度的钙和磷酸盐。
至少在初始时，所形成的磷酸钙优选为ACP，或包含至少50％的ACP。ACP的制备条件如Comes等人(2010，Acta Biomaterialia 6(9):3362-3378)所述。当然，为本发明选择的条件应该是生物相容的，即它们不应该对人类组织如牙齿、牙龈、骨、肌腱和/或肌肉组织造成损伤。通常，这意味着溶剂在人体内是生物相容的或容易降解的，即，通常是水。可选地，可以使用水和乙醇的混合物(优选地为50％的乙醇)。
然而，也可以形成其他磷酸钙，例如，三磷酸钙、钙磷石、焦磷酸盐、磷酸八钙(OCP)、白磷钙石或用于形成羟基磷灰石(HA)的其他磷酸钙前体。HA也可以直接形成，特别是在存在本发明的自组装肽的情况下。
本发明人意外地发现，本发明的自组装肽与钙离子和磷酸根离子的组合，在不存在自组装肽的情况下，将形成ACP或其他非HA晶体，使平衡向形成更有序、结晶形式的磷酸钙转变。特别地，如以下实例所示，可以形成釉质样或HA样磷酸钙晶体，这是特别优选的，特别是在牙齿治疗的情况下。
自组装肽的存在也加速了所述磷酸钙沉淀物的形成，因此它们可以立即形成。在本发明的上下文中，立即被理解为指几秒到大约五分钟的时间，通常在一分钟内。浓度越高，沉淀越快。时间从混合开始，即如果混合进行得很慢，沉淀过程也会发生得更慢。
不同的磷酸钙晶体形式可以彼此区分，例如，基于它们的Ca/P比(Comes等人，2010；Jeffre等人，1993，Marine andFreshwater Research44:609-634)。OCP的C/P约为1.33。ACP的C/P通常为约1.35-1.45。白磷钙石的C/P为约1.5。HA的C/P范围大于1.5，特别是1.6或更大。骨中的HA的C/P可以是如约1.76。
C/P比可以被确定，例如根据本领域已知的方法来确定，优选地，如本文的实例中所教导的。
在一个优选的实施方案中，包含钙离子的组合物是溶液。可选地，或优选地，另外，包含磷酸根离子的组合物是溶液。所述溶液中钙和磷酸盐的浓度如此之高，以至于在混合时，其过饱和，并且磷酸钙(优选为ACP)发生沉淀。在使用时，溶液可以因此彼此接触，这使得磷酸钙沉淀，例如最初的ACP沉淀。
发明人发现，本发明试剂盒中包含钙离子的溶液的合适浓度为，例如，浓度为0.01-0.5M的Ca2+。注意到，这是试剂盒的一种组合物中的浓度，即，在与另一种溶液接触和混合时，最终浓度降低。例如，如果包含钙离子的溶液和包含磷酸根离子的溶液以1:1混合，其中，优选地，溶液中Ca2+和磷酸盐是等摩尔的，混合后钙离子的最终浓度是试剂盒中浓度的一半，即，其可以是0.005-0.25M。然而，Ca2+浓度与磷酸盐浓度的比可以是，例如1:1-2:1，特别是1.5:1至2:1，以获得更高的Ca/P比。使用例如带有混合单元的双腔注射器，可以很容易地将溶液1:1(体积比)混合。然而，为了获得更高的Ca/P比，如果Ca2+和含磷酸盐的溶液是等摩尔的，也可以使用更高量的Ca2+溶液，例如，1∶1至2∶1，特别是1.5∶1至2∶1的Ca2+溶液。这使磷酸钙形成的平衡向HA的形成转变。可选地，可以改变试剂盒溶液中单种离子的浓度，以获得所需的化学计量比，同时保持混合比为1:1。
优选地，本发明的试剂盒包括包含浓度为0.08-0.28M的钙离子的溶液。使用包含浓度为0.1-0.15M，例如0.14-0.15M的钙离子(例如，使用约等摩尔的磷酸盐溶液)的溶液已经获得了特别好的结果。
值得注意的是，溶液的饱和度或过饱和度强烈依赖于pH。如果通过混合两种溶液形成的溶液具有中性或生理pH(例如，pH 7-7.4)，则上述值特别合适。任选地，包含钙离子的溶液的pH为6-7。可选地，将其溶解在水中以获得pH为6-7的溶液可能是合适的。该溶液可以是缓冲溶液。
包含钙离子的组合物包含可溶于水的钙盐，例如CaCl2、Ca(NO3)2、CaCO3或其混合物。所述盐可以被溶解或适合于溶解在溶液中。在一个优选的实施方案中，所述组合物包括CaCl2。
包含钙离子的组合物，例如溶液，可以进一步包含Mg2+和/或Sr2+离子。Ca2+与Mg2+和/或Sr2+的比可以是例如约0.3。
如前所述，包含磷酸盐的组合物可以通过约等摩尔浓度使用。可选地，可以使用比磷酸根离子更多的Ca离子。
例如，本发明的试剂盒可以包括包含浓度为0.01-0.5M的磷酸根离子的溶液。优选地，所述溶液包含浓度为0.08-0.28M的磷酸根离子。使用包含浓度为0.1-0.15M，例如0.14-0.15M的磷酸根离子的溶液已经获得了特别好的结果。
本发明人发现，不同浓度的钙离子和磷酸根离子，例如，以等摩尔量，分别使得形成不同的磷酸钙与自组装肽的组合。然而，即使例如Kirkham等人的用于模拟唾液的再矿化溶液是过饱和磷酸钙溶液，也不能立即形成磷酸钙沉淀或晶体(参见样本β(不含肽)和δ(含肽)。试剂盒中钙离子和磷酸根离子的浓度因此必须更高，例如分别至少0.01M，任选地分别至少0.05M。本发明人发现钙离子和磷酸根离子(在本发明试剂盒的未混合溶液中)的最佳浓度为约0.1-0.15M。在这些条件下，磷酸钙沉淀，如果仍然需要的话，其可以再结晶以形成HA，例如在牙齿或骨病变中。
如果钙离子和磷酸根离子的浓度非常高(例如，在样本II-CaNa或II-CaPaNa中)，磷酸钙立即结晶，但其结构不太有序，并且似乎不受自组装肽的显著影响。在自组装肽存在的情况下，仍然期望重结晶以形成HA，但在本发明的上下文中，钙离子和磷酸根离子的浓度优选低于0.3M或至多0.28M。
包含磷酸盐离子的组合物，即溶液，可以包含溶解或适合于溶解在溶液中的磷酸盐。盐可以是例如Na2HPO4、NaH2PO4、Na3PO4、K2HPO4、KH2PO4、K3PO4或其混合物。Na3PO4碱性很强，而NaH2PO4酸性很强(约pH 5)，Na2HPO4使得pH约为8。在一个优选的实施方案中，包含磷酸根离子的溶液包含Na2HPO4，例如，作为唯一的磷酸盐。包含磷酸根离子的溶液的pH可以为例如6-10，优选地为7-9，任选地为7.4-8。在该pH下，自组装肽，例如SEQ ID NO:1，是单体形式的。pH也可以通过添加其他缓冲剂来改变，可选地通过使用不同磷酸盐的混合物，例如Na2HPO4和NaH2PO4来缓冲。
例如，如果包含钙离子的组合物包含CaCO3，则包含磷酸根离子的组合物可以是正磷酸。
包含钙离子的组合物也可以是适合于溶解在水中以提供包含钙离子溶液的干燥组合物。所述干燥组合物任选地被冻干、空气干燥、真空干燥或喷雾干燥。
类似地，包含磷酸根离子的组合物可以是适合于溶解在水中以提供包含磷酸根离子的溶液的干燥组合物。所述干燥组合物任选地被冻干、空气干燥、真空干燥或喷雾干燥。
然而，应注意的是，不要求组合物(composition)是溶液或组合物(compositions)均是溶液，可选地不要求组合物在施用前溶解。例如，所述组合物可以是干燥组合物(例如口香糖，其在不同部分包含至少一种离子(Ca2+或磷酸盐)或两者均有)，和/或自组装肽。然后可以形成溶液，例如，在咀嚼口香糖时用唾液形成溶液。本发明人已经发现，这也导致磷酸钙的沉淀。为了评估所需的离子量，应根据口腔中形成的唾液调整浓度，例如，唾液流量约为1-5mL/min。
(ii)磷酸钙颗粒
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包括b)磷酸钙颗粒。所述磷酸钙颗粒和自组装肽彼此分开地包含在试剂盒中，优选地包含在独立组合物中，例如，独立容器中，可选地至少包含在组合物的独立部分中(例如，在条纹牙膏中)。
磷酸钙颗粒不是牙科封闭剂的一部分，特别地，不是牙科粘固粉(例如玻璃离子粘固粉)的一部分。包含本发明试剂盒的磷酸钙颗粒的组合物不是适合或打算用于聚合非肽聚合物的组合物，即包含这种聚合物单体或聚合物。优选地，所述组合物也不包含有机溶剂。
优选地，包含本发明试剂盒的磷酸钙颗粒的组合物是磷酸钙颗粒在水中的悬浮液。当然，根据溶解度、温度等，悬浮液中的一些磷酸钙可能会溶解，但大部分磷酸钙不会溶解，而是以颗粒形式存在。
包含本发明试剂盒的磷酸钙颗粒的组合物也可以是适合于通过加水和任选地进行混合来制备磷酸钙颗粒在水中的悬浮液的组合物。如果磷酸钙颗粒悬浮在唾液中，也可以在例如受试者的口腔中形成磷酸钙颗粒的悬浮液。这种适合形成悬浮液的组合物可以是例如干燥的，例如无水组合物，例如粉末。它们也可以被掺入支撑物中或结合到支撑物上，例如口香糖、含片等，在咀嚼或吮吸时可以从支撑物中释放出来，从而在唾液中形成悬浮液。
所述组合物也可以是磷酸钙或是包括磷酸钙的泡沫组合物，因为这样的组合物具有高表面，所述表面允许与溶剂(例如水)良好的接触。例如，诸如咀嚼的机械应力可以使磷酸钙颗粒脱离组合物。
在悬浮液中，颗粒应该是游离的，以与自组装肽形成复合物和/或粘附到它们接触的羟基磷灰石材料(例如牙齿或骨)上。本发明试剂盒中的磷酸钙颗粒可以是任何形式的磷酸钙粒子，例如，以不同的结晶和非结晶形式。
在本发明的上下文中，磷酸钙颗粒可以是磷酸一钙一水合物(MCPM)Ca(H2PO4)2*H2O、无水磷酸二氢钙(MCPA)Ca(H2PO4)2、二水合磷酸二钙(DCPD，透磷钙石相(Brushit))CaHPO4*2H2O、无水磷酸二钙(DCPA，三斜磷钙石相(Monetit))CaHPO4]、磷酸八钙(OCP)Ca8(HPO4)2(PO4)4*5H2O、α-磷酸三钙(α-TCP)α-Ca3(PO4)2、β-磷酸三钙(β-TCP)β-Ca3(PO4)2、无定形磷酸钙(ACP)Cax(PO4)y*nH2O、缺钙型羟基磷灰石(CDHA)Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x(0<x<1)、羟基磷灰石(HA)Ca10(PO4)6(OH)2或磷酸四钙(TTCP)Ca4(PO4)2O)或不同磷酸钙的混合物。在一个实施方案中，所述颗粒或具有50％或更低，例如40％或更低、30％或更低、20％或更低或10％或更低的结晶度，或由无定形、非结晶的磷酸钙组成。
优选地，它们包含ACP，例如，至少50％的ACP。磷酸钙颗粒还可以包含至少80％的ACP。任选地，它们可能基本上由ACP组成。发明人发现这是有利的，因为ACP不是很稳定，并且可以在与自组装肽的有序结构相结合的更有序的HA晶体中再结晶。任选地，磷酸钙颗粒是磷酸钙颗粒的悬浮液的形式，其包含至少50％的ACP，例如至少80％的ACP。
干燥的、特别是包含ACP形式的磷酸钙颗粒的无水组合物(例如作为粉末)，具有ACP在较长时间内稳定的优点。ACP也可以是ACP的稳定形式(例如，用酪蛋白磷酸肽稳定)，即CPP-ACP。可选地，ACP可以是CMC/ACP。
磷酸钙颗粒也可以包括OCP或可选地包括OCP，任选地至少50％的OCP。磷酸钙颗粒也可以包括磷酸三钙(TCP)或可选地包括磷酸三钙(TCP)，任选地至少50％的TCP。TCP可能是β-TCP。
在一个实施方案中，磷酸钙颗粒包括HA，任选地，至少50％的HA。它们也可以由HA颗粒组成。在这种情况下，不需要磷酸钙的再结晶。在某些情况下，例如在提供体积稳定性的骨中，这可能是有利的。
羟基磷灰石可以是取代的羟基磷灰石，例如碳酸羟基磷灰石和碳酸锌羟基磷灰石，或纯磷酸钙，优选为晶体形式。在本发明的上下文中，除非另有提及，否则提及磷酸钙或羟基磷灰石包括提及衍生的磷酸钙或取代羟基磷灰石。当然，磷酸钙或羟基磷灰石也可以仅由CaPO4(当然还有适合于相应晶体形式的结晶水)组成。
羟基磷灰石颗粒可以通过公开的方法获得，例如根据Roveri，Battistelli等人，2009，J.Nanomater.Nanocomposites for EngineeringApplications 1–9，EP 1 762 215A1；US 20050037948 A1；US 20080075675 A1；US 20100247589 A1；US 20100297203A1；WO2007/137606 A1或WO 2013/068020 A1等公开的方法获得。优选地，羟基磷灰石可根据WO2007/137606 A1获得，并且可从德国博登海姆的Budenheim或瑞士的OmyaInternationalAG公司商购获得。
任选地，至少50％的所述磷酸钙颗粒的大小为20nm至50mm，例如1μm至5mm或20nm至小于1μm。优选地，至少80％、至少90％的颗粒、至少95％或100％的颗粒具有各自的大小。矿物颗粒的大小通常通过粒度测定法测量，例如使用光散射粒度分布分析仪(例如LA-950，Horiba，日本京都)。晶体的形式优选为针状，但也可以为杆状或针状。
不同大小的磷酸钙颗粒(例如ACP颗粒)，分别对于不同的目的有利。例如，对于骨再生，μm或mm大小的大颗粒(例如，1μm至50mm或500μm至5mm)可能是有利的，因为它们为需要骨再生的部位增加了额外的稳定性。相反，对于牙齿的再矿化，均匀形成替代牙釉质或牙本质是重要目标。因此，在这种情况下，颗粒的大小应该更小，例如在纳米规格(例如，20nm至小于1μm，任选地，50nm-500nm)。
在另一个实施方案中，磷酸钙颗粒不包含HA。其他磷酸钙重结晶，从而更容易与自组装肽形成新的无缝结构。使用其他磷酸钙也更容易发生骨重塑。
包含自组装肽的组合物
本发明的试剂盒不是单一的同质组合物，而是包括至少两种不同的组合物，任选地，三种或多种组合物。包含独立的钙离子和独立的磷酸根离子本发明试剂盒可以包括，
a)在第一组合物中，自组装肽，以及
b)在第二组合物中，磷酸根离子，以及，
c)在第三种组合物中，钙离子。
这是一种可能性，但不是试剂盒的所有成分都需要在三种不同的组合物中。相反，自组装肽也可以是所述组合物之一与所述离子之一的一部分。如下所述，这可以便于使用并且可以具有另外的优点。
在一个实施方案中，包含自组装肽的组合物也可以包含磷酸根离子，例如，所述自组装肽可以是组合物的一部分，例如，包含磷酸根的溶液，或包含适合形成其溶液的磷酸根离子的干粉。
可选地，并且优选地，包含自组装肽的组合物进一步包含钙离子，例如，所述自组装肽是包含钙离子的组合物(例如溶液)的一部分，可选地是适合形成其溶液的含有钙离子的干粉。如下面的实例所示，令人惊讶的是，在哪种组合物中掺入自组装肽会产生差异。在其他条件相同的情况下，在包含钙离子的溶液中掺入了自组装肽的样本γ-2中，所形成的沉淀物中的Ca/P比为约1.72，即，远高于样本γ-1中的Ca/P比。因此，如果将自组装肽掺入包含钙离子的组合物中，会直接形成HA沉淀。在另一个样本中，沉淀物可以随后再结晶形成HA，但HA不是直接形成的。
在不受该理论约束的情况下，我们认为自组装肽和钙离子可能在加入磷酸盐之前就已经形成了复合物，从而促进了由自组装肽的结构模板化的规则HA晶体的成核(Thomson，2014，Caries Res(48)：411)。这通过包含钙离子和自组装肽的溶液的外观被支持，所述溶液是不透明的而不是透明的。
如果自组装肽包含在溶液中，则其可以以例如0.01-40mg/mL的浓度存在。在包含浓度为0.1-30mg/mL、任选地1-25mg/mL的自组装肽的组合物中发现了特别好的结果。
自组装肽也可以以10-20mg/mL、任选地15-20mg/mL的浓度包含在溶液中。值得注意的是，该浓度是针对试剂盒中包含的溶液进行定义的，即在与其他含离子溶液混合之前。试剂盒的组分彼此接触后形成的溶液中的浓度可以为例如0.005-20mg/mL、0.05-15mg/mL或0.5-12.5mg/mL。
氟化物
本发明的试剂盒可以进一步包含氟离子，其中所述氟离子在溶液中或以可溶性氟化物盐的形式存在。有利的是，氟离子会直接形成HA晶体。在不存在氟化物的情况下，会形成具有较低Ca/P比的磷酸钙。在样本CaPaNaF中，氟离子(以NaF的形式)被掺入包含磷酸盐和自组装肽的溶液中，并使得具有高比或Ca/P大于2的磷酸钙(即HA)直接形成。
可溶性氟化物盐可以是，例如，NaF、NH3F、MgF2、SrF2、Na2PFO3、SnF或其混合物，任选地，NaF。NaF或NH3F通常用于牙齿护理产品，如牙膏。
氟离子可以在独立组合物中，可选地它们可以包含在包含磷酸根离子的组合物中。其中所述组合物任选地进一步包含自组装肽。可选地，它们可以包含在包含钙离子的组合物中，其中所述组合物任选地进一步包含自组装肽。
如下面的实施例所示，令人惊讶的是，自组装肽在哪种组合物中被掺入会产生差异。在其他条件相同时，在自组装肽被掺入含钙离子溶液的样本γ-2中，所形成的沉淀物中的Ca/P比为约1.72，即，它远高于样本γ-1。因此，如果将自组装肽掺入包含钙离子的组合物中，则直接形成HA沉淀。在另一个样本中，所述沉淀可以随后再结晶形成HA，但HA不是直接形成的。
组合物的形式
本发明试剂盒的每个组合物可以是选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、粉末、油泥(putty)、颗粒剂或糖果的组合物。例如，自组装肽可以以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、粉末、油泥、颗粒剂或糖果的组合物的形式提供。钙离子可以以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、粉末、油灰、颗粒剂或糖果的组合物的形式提供。磷酸根离子可以以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、粉末、油灰、颗粒剂或糖果的组合物的形式提供。可选地，磷酸钙(颗粒形式)可以以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、粉末、油灰、颗粒剂或糖果的组合物的形式提供。那些用于咀嚼或吮吸的形式的组合物，例如口香糖、太妃糖、润喉糖、糖果，可选或牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫，用于牙齿治疗，而诸如油泥通常用于骨治疗或盖髓。其他形式的组合物可以用于两种应用。
如上所述，本发明的优选组合物是溶液，例如在水中。本发明的替代优选组合物是干燥的，例如适合溶解的无水粉末，或是磷酸钙颗粒时，易于重悬于水中。
如果提供本发明试剂盒的两种组合物，它们都是溶液或分散体(例如，一种包含自组装肽，另一种包含磷酸钙颗粒；或优选地，一种是包括钙离子的溶液，一种是包含磷酸根离子的溶液，其中一种还包含自组装肽，如上所述)。本发明还提供了双腔注射器，在每个腔中包括本发明试剂盒的一种组合物。混合单元可以固定到双腔注射器上。双腔注射器特别有利于靶向治疗，例如治疗牙齿病变或骨病变。可选地，溶液或悬浮液可以在施用前混合，然后施用于牙齿或骨病变。
本发明还提供了一种注射器，所述注射器包括包含磷酸根离子的溶液和另一个容器中包含钙离子的干燥组合物，其中自组装肽优选是包含钙离子组合物的一部分，使得所述溶液可用于溶解干燥组合物，然后施用混合后的溶液。
单腔或多腔注射器可以有利地用于靶向治疗，例如，用于靶向牙齿病变，例如皮下病变。骨病变也可以作为靶点。
可选地，也可以使用溶液，例如作为漱口水或口腔护理泡沫，例如用于增加牙齿再矿化。例如，这可能对敏感牙齿或牙齿侵蚀的治疗有利。
本发明的试剂盒也可以是固体或半固体组合物。这样的固体或半固体组合物可以例如包括
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽和钙离子，以及
b)在所述组合物的第二部分中的磷酸根离子。
可选地，它们可以包括
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽和磷酸根离子，以及
b)在所述组合物的第二部分中的钙离子，或
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽，以及
b)在所述组合物的第二部分中的磷酸根离子，以及，
c)在所述组合物的第三部分中的钙离子，或
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽，以及
b)在组合物的第二部分中的磷酸钙颗粒。
半固体或固体试剂盒的实例为具有不同层的颗粒剂、糖果、片剂、太妃糖、薄荷糖或润喉糖或口香糖。在咀嚼或吮吸时，这两层可以同等接触唾液，或在施用到骨病变后，这两层可以同等的暴露于体液(如血液或缓冲液/水)，或层的一部分可以包围另一层。
例如，在包括不同部分的这些固体或半固体试剂盒中，组合物的第一部分可以包围第二部分。由于第一部分包括自组装肽，因此自组装肽首先施用于受试者，例如与之接触的牙齿。因此，在不受理论约束的情况下，自组装肽可以与牙齿的HA结构结合，并介导随后形成的磷酸钙与牙齿的有序结合。当然，如果对牙齿或骨施用溶液，也可以选择这种施用顺序。我们认为这对骨再生不太重要，因为这里的体积通常要大得多，良好的混合或同时施用可能更重要。
因此，可选地，组合物的第二部分可以包围第一部分。
如果自组装肽在储存过程中保持单体是有利的，则无水固体或半固体组合物可能特别有用。
在一个实施方案中，所述半固体试剂盒是条纹牙膏。条纹牙膏和在牙膏(或牙胶)中维持基本上独立的不同组合物的方法在本领域是众所周知的。当然，条纹牙膏中不同组合物的颜色可以相同也可以不同。本发明的牙膏可以包括通常用于牙膏的其他组分，例如表面活性剂、清洁剂、活性成分、香料、甜味剂。
如果试剂盒是具有不同部分的半固体或固体组合物，则如果组合物溶解或分散在水性溶液(例如水)中，则组合物的第一部分和第二部分通常适合混合。当然，对于向牙齿施用，所述组合物也可以分散或溶解在唾液中。对于向骨施用，所述组合物可以例如干燥使用，或水合/分散或溶解在体液如血液、水、盐水或其他水性缓冲液中。
医疗用途
本发明的试剂盒可以用于研究目的，但优选用于医药。
主要用于诱导牙齿再矿化或骨再生，优选用于有需要的受试者。所述受试者通常是人类受试者。有利地，与不存在所述钙离子和磷酸根离子相比，存在所述钙离子和磷酸根离子使所述再矿化或再生被加速。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于在受试者的牙齿中或牙齿上诱导矿化或再矿化，优选用于治疗牙齿病变或空洞。牙齿病变可能是龋齿(或龋)病变。它也可能是破碎的牙釉质或牙本质，通常是破碎的牙釉质，或空洞的牙釉质或牙本质。本发明的试剂盒也可以用于填充凹坑和/或裂缝，无论在所述凹坑和裂缝中是否存在病变。进一步的用途是用于治疗牙齿敏感性，其中牙本质小管可以被本发明制成的保护屏障闭塞或阻断。
在一个实施方案中，牙齿病变是亚表皮病变。在这种情况下，自组装肽任选地是单体的，例如干燥的，例如冻干的或空气干燥的或喷雾干燥的形式，以及维持所述肽溶解于水后保持单体状态的缓冲液，如本领域已知的和本文参考的。所述试剂盒优选独立地包含钙离子和磷酸根离子，因为小的有核晶体比钙颗粒更容易进入皮下病变。包含自组装肽(以及任选地，钙离子或磷酸根离子(优选钙离子))的组合物可以例如首先施用，包含另一种离子的组合物在第一种离子施用后不久(优选在至多10分钟内，优选至多5分钟内)施用。然而，也可以混合(例如，使用双腔注射器)并同时施用。
在一个实施方案中，所述牙齿病变是空洞性病变。在该实施方案中，由沉淀的磷酸钙或磷酸钙颗粒提供的实践上的瞬时稳定性是特别重要的。仅使用自组装肽，即使形成水凝胶，它通常在再矿化之前被从大的空洞性病变中冲走。因此，本发明提供的再矿化的加速是非常有益的。为了进一步稳定包含自组装肽和磷酸钙的结构，优选形成HA，可以对交联肽进行紫外线处理。试剂盒独立地包含钙和磷酸盐，或优选地包含磷酸钙颗粒，有利地，其大小为20nm-5000nm，任选地为100-1000nm。
此外，本发明的试剂盒或其混合组合物可用于填充空洞的底部，其中另一种牙科密封剂覆盖空洞作为与唾液接触的顶层，所述另一种牙科密封剂例如，牙科粘固粉，如玻璃离子粘固粉，或包含能够聚合的组分的牙科密封剂，例如选自丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的酸性聚合物、离聚物、giomer、和任何其他合适的聚合物和/或其单体形式。在顶层的保护下，自组装肽和磷酸钙的组合可以形成与牙釉质和/或牙本质非常相似的再矿化替代牙齿材料。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒用于盖髓。这里，通过将本发明试剂盒的组分组合而形成的材料可以通过在牙髓上放置磷酸钙的生物相容性保护层来保护牙髓免受其上使用的牙科密封剂的通常毒性作用。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒因此与其他组分分开地进一步包括牙科密封剂，例如玻璃离聚物水泥，或牙科密封剂，其包括能够聚合的组分，例如选自丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的酸性聚合物、离聚物、胶聚物、和任何其他合适的聚合物和/或其单体形式。
本发明的试剂盒也可用于治疗或预防龋齿，其中所述治疗区域包括受试者的多个牙齿，优选所有牙齿，而与活动性龋齿的诊断无关。组合物如漱口水、牙膏或上述定义的其他固体或半固体组合物特别适合于这种用途。
本发明的试剂盒也可以用于治疗牙齿敏感性。在这里，试剂盒的成分可以进入皮下病变并不重要。相反，它们旨在在牙齿上形成保护层或在牙本质小管内形成沉淀物。这可能特别有帮助，例如，在牙齿敏感的情况下，但它也可以保护牙齿免受未来的酸刺激，从而防止龋齿或牙齿侵蚀。预防是指减少发病率。在该实施方案中，因此优选以组装形式提供自组装肽，可选地以组合物适合于在混合时诱导自组装肽的形式组装。所述试剂盒独立地包含钙和磷酸盐，或磷酸钙颗粒，其大小优选为20nm-5000nm，任选地为100-1000nm。
通常，如果在牙齿再矿化的情况下使用磷酸钙颗粒，它们通常大小为20nm-5000nm，任选地，大小为100-1000nm，以形成均匀的基质。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒用于在受试者的骨中，特别是在骨病变中诱导再生。与仅施用自组装肽相比，本发明的组合能够为骨，特别是病变提供立即增加的稳定性。这对于骨病变的治疗具有非常重要的意义。自组装肽进一步引导所施加的磷酸钙形成HA。它们还为细胞迁移提供了模板。
骨缺损或骨病变可以例如由肿瘤或创伤引起。所述试剂盒还可用于牙槽嵴的增强或重建治疗，用于填充牙周缺损，或用于在根切除术、根尖切除术、囊切除术后填充缺损，用于填充拔牙之后的齿槽以增强牙槽嵴的保存，用于提升上颌窦底，用于填充牙周缺损或植入物周围缺损。它也可以应用于骨科适应症，如关节植入物(如髋关节植入物)或脊柱融合。
为了填充牙周缺损，本发明的试剂盒可以与用于引导组织、再生(GTR)和引导骨再生(GBR)的产品结合使用。为了用于填充植入物周围的缺损，它优选与用于引导骨再生(GBR)的产品结合使用。
在骨再生的情况下，试剂盒优选包括大小为1μm-50mm，任选地为100-5000μm或1-2mm的磷酸钙颗粒。这种磷酸钙颗粒为骨病变提供了特别的稳定性。此外，在本文中，优选使用自组装肽的组装形式。
本发明还提供了一种治疗方法，包括将本文所述的本发明试剂盒的组分施用于有需要的受试者的牙齿或骨，通常施用于牙齿或骨病变。任选地，所述方法包括首先施用包含自组装肽的组合物。可选地，第二次施用包含自组装肽的组合物。可选地，试剂盒的组分基本上同时施用，如果病变具有相对较大的大小，例如用于填充空洞性病变、用于盖髓或用于治疗骨缺损，则通常是这种情况。
总之，例如，与仅施用自组装肽或仅施用磷酸钙相比，本发明的试剂盒和方法有利地加速了牙齿再矿化或骨再生，因此可用于本文的目的。
以下实施方式、实施例和附图进一步举例说明了本发明，这些实施方案、实施例和附图旨在说明但不限制本发明。本文引用的所有参考文献均完全并入本文。
在本发明的上下文中，“一个”旨在包括复数，即“一颗牙齿”也指多颗牙齿，例如受试者的所有牙齿。约意味着+/-10％。
实施方案
本发明提供了例如以下实施方案；
1.一种试剂盒，包括，
a)自组装肽，所述自组装肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少70％、优选80％一致性的氨基酸序列，以及
b)(i)独立组合物中的钙离子和磷酸根离子，所述钙离子和磷酸根离子如果在水的存在下混合，适于立即形成磷酸钙沉淀物，其中所述组合物优选为溶液，或
(ii)磷酸钙颗粒，优选为包含至少50％ACP的磷酸钙颗粒悬浮液。
2.根据实施方案1所述的试剂盒，其包含b)独立组合物中的钙离子和磷酸根离子，所述钙离子和磷酸根离子如果在水的存在下混合，适于立即形成磷酸钙沉淀物，优选形成无定形磷酸钙(ACP)。
3.根据实施方案1或2中任一项所述的试剂盒，其中包含钙离子的组合物是溶液。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的试剂盒，其中包含磷酸根离子的组合物是溶液。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的组合物是适合于溶解在水中以提供包含钙离子溶液的干燥组合物，其中，所述干燥组合物任选地被冻干、空气干燥或喷雾干燥。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的试剂盒，其中所述包含磷酸根离子的组合物是适合于溶解在水中以提供包含磷酸根的溶液的干燥组合物，其中，所述干燥组合物任选地被冻干、空气干燥或喷雾干燥。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的试剂盒，其中所述溶液是水性溶液，其中所述溶液的溶剂优选为水。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的试剂盒，其中所述溶液包括乙醇作为溶剂。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的试剂盒，其中所述溶液的溶剂是水和乙醇的混合物。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的溶液包含浓度为0.01-0.5M的Ca2+。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的溶液包含浓度为0.08-0.28M的Ca2+。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的溶液包含浓度为0.1-0.15M，例如0.14-0.15M的Ca2+。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的溶液包含选自CaCl2、Ca(NO3)2、CaCO3或其混合物的盐，其中，所述盐溶解或适合于溶解在所述溶液中。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的溶液包含CaCl2。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的溶液进一步包含Mg2+和/或Sr2+，其中Ca2+与Mg2+和/或Sr2+的比率为约0.3。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的试剂盒，其中所述包含钙离子的溶液的pH值为6-7。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的试剂盒，其中包含磷酸根离子的溶液包含浓度为0.01-0.5M的磷酸根。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的试剂盒，其中包含磷酸根离子的溶液包含浓度为0.08-0.28M的磷酸根。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的试剂盒，其中包含磷酸根离子的溶液包含浓度为0.1-0.15M，例如0.14-0.15M的磷酸根。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的试剂盒，其中所述包含磷酸根离子的溶液包含选自Na2HPO4、NaH2PO4、Na3PO4、K2HPO4、KH2PO4、K3PO4或其混合物的盐，其中所述盐溶解或适合于溶解在所述溶液中。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的试剂盒，其中所述包含磷酸根离子的溶液包含Na2HPO4。
22.根据实施方案1-21中任一项所述的试剂盒，其中所述包含磷酸根离子的溶液的pH为6-10，优选地为7-9，任选地为7.4-8。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的试剂盒，其中自组装肽是包含钙离子的组合物的一部分，其中所述组合物优选是溶液。
24.根据实施方案1-22中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽是包含磷酸根离子的所述组合物的一部分，其中所述组合物优选为溶液。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽以0.01-40mg/mL的浓度包含在所述溶液中。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽以0.1-30mg/mL，任选地1-25mg/mL的浓度包含在所述溶液中。
27.根据实施方案1-26中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽以10-20mg/mL、任选地15-20mg/mL的浓度包含在所述溶液中。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的试剂盒，其种所述试剂盒进一步包含氟离子，其中所述氟离子在溶液中或以可溶性氟化物盐的形式存在。
29.根据实施方案28所述的试剂盒，其中所述可溶性氟化物盐选自包括NaF、NH3F、MgF2、SrF2或其混合物，任选地为NaF。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的试剂盒，其中所述包含磷酸根离子的组合物包含氟离子，其中所述组合物任选地进一步包含自组装肽。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的试剂盒，包括b)磷酸钙颗粒。
32.根据实施方案31所述的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒包含ACP，优选地，至少50％的ACP。
33.根据实施方案31-32中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒包含至少80％的ACP，任选地，基本上由ACP组成。
34.根据实施方案32-33中任一项所述的试剂盒，其中所述ACP是CPP-ACP。
35.根据实施方案31-34中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒包含OCP，任选地,至少50％的OCP。
36.根据实施方案31-35中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒包含OCP，任选地,至少50％的OCP。
37.根据实施方案31-36中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒包含TCP，任选地,至少50％的TCP。
38.根据实施方案31-37中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒包含HA，任选地，至少50％的HA，例如，由HA组成。
39.根据实施方案31-38中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒在水性悬浮液中，任选地，在ACP的水性悬浮液中。
40.根据实施方案31-39中任一项所述的试剂盒，其中至少50％的所述颗粒大小为20nm至50mm，任选地为20nm至小于1μm。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的试剂盒，其中至少50％的所述颗粒的大小为1μm至50mm，任选地为0.5-5mm。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少80％的序列一致性。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，优选地，其中其由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽为单体形式、组装形式或其混合物。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的试剂盒，其中至少50％的自组装肽是单体形式，任选地，至少80％的自组装肽是单体形式，例如，基本上所有的自组装多肽是单体形式。
46.根据实施方案1-44中任一项所述的试剂盒，其中至少50％的自组装肽为组装形式，任选地，至少80％的自组装肽是单体形式，例如，基本上所有的自组装多肽是单体形式。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂或糖果、油泥、粉末或颗粒剂的组合物的形式提供。
48.根据实施方案1-30或41-47中任一项所述的试剂盒，其中所述钙离子以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、糖果、油泥、粉末或颗粒剂的组合物的形式提供。
49.根据实施方案1-30或41-48中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸根离子以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、糖果、油泥、粉末或颗粒剂的组合物的形式提供。
50.根据实施方案1或31-47中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酸钙以选自干燥组合物、冻干组合物、无水组合物、水性溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂、糖果、油泥、粉末或颗粒剂的组合物的形式提供。
51.根据实施方案1-30或41-49中任一项所述的试剂盒，
a)在所述第一组合物中的自组装肽，和
b)在所述第二组合物中的磷酸根离子，以及
c)在所述第三种组合物中的钙离子。
52.根据实施方案1-23或25-30或41-49中任一项所述的试剂盒，其为固体或半固体组合物，包括，
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽和钙离子，和
b)在所述组合物的第二部分中的磷酸根离子。
53.根据实施方案1-22或24-30或41-49中任一项所述的试剂盒，其为固体或半固体组合物，包括，
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽和磷酸根离子，和
b)在所述组合物的第二部分中的钙离子。
54.根据实施方案1-30或41-49中任一项所述的试剂盒，其为固体或半固体组合物，包括，
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽，和
b)在所述组合物的第二部分中的磷酸根离子，以及
c)在所述组合物的第三部分中的钙离子。
55.根据实施方案1或31-47或50中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含彼此分开的自组装肽和磷酸钙颗粒，优选在独立组合物中。
56.根据实施方案1或31-47或50或55中任一项的试剂盒，其中所述磷酸钙颗粒不是牙科密封剂的一部分，特别是不是牙科粘固粉的一部分。
57.根据实施方案1或31-47或50或55-56中任一项的试剂盒，其为固体或半固体组合物，包括
a)在所述组合物的第一部分中的自组装肽，以及
b)在所述组合物的第二部分中的磷酸钙颗粒。
58.根据实施方案51-54或57中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物的第一部分围绕所述第二部分。
59.根据实施方案51-54或57中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物的第二部分围绕所述第一部分。
60.根据实施方案51-54或57中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物是条纹牙膏。
61.根据实施方案51-54或57中任一项所述的试剂盒，其中当将所述组合物溶解或分散在水中，所述组合物的第一部分和第二部分适于混合。
62.根据实施方案1-61中任一项所述试剂盒用于医药。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒用于诱导牙齿再矿化或骨再生，优选用于有需要的受试者。
64.根据实施方案63所述的试剂盒，其中与不存在钙离子和磷酸根离子相比，所述试剂盒加速再矿化或再生。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的试剂盒，用于在受试者的牙齿中或牙齿上诱导再矿化，优选用于治疗牙齿病变。
66.根据实施方案65所述的试剂盒，其中所述牙齿病变是龋齿病变。
67.根据实施方案65-66中任一项所述的试剂盒，其中所述牙齿病变是皮下病变，其中自组装肽任选地是干燥的，例如冻干的形式。
68.根据实施方案65-66中任一项所述的试剂盒，其中所述牙齿病变是空洞性病变。
69.根据实施方案65-66中任一项所述的试剂盒，其中，所述牙齿病变是破损的牙釉质或牙本质，优选为破损的牙釉质。
70.根据实施方案65-66或68中任一项所述的试剂盒用于盖髓。
71.根据实施方案65所述的试剂盒，用于填充凹坑和/或裂缝。
72.根据实施方案65所述的试剂盒，用于治疗牙齿敏感性。
73.根据实施方案65-68或72所述的试剂盒，其中所述治疗区域包括受试者的多个牙齿、优选地所有牙齿，而与活动性龋齿的诊断无关。
74.根据实施方案65-73所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括大小为20nm-5000nm的磷酸钙颗粒，任选地为100-1000nm的磷酸钙颗粒。
75.根据实施方案1-62中任一项所述的试剂盒用于诱导受试者的骨再生。
76.根据实施方案75所述的试剂盒用于治疗骨缺损，任选地，为肿瘤或创伤引起的骨缺损。
77.根据实施方案75所述的试剂盒用于牙槽嵴的增强或重建治疗。
78.根据实施方案75所述的试剂盒用于填充牙周缺损。
79.根据实施方案75所述的试剂盒用于填充牙根切除术、根尖切除术、囊切除术后的缺损或填充拔牙齿槽以加强对牙槽嵴的保护。
80.根据实施方案75所述的试剂盒用于提升上颌窦底。
81.根据实施方案75所述的试剂盒用于填充牙周缺损。
82.根据实施方案75所述的试剂盒用于填充植入物周围缺损。
83.根据实施方案75所述的试剂盒用于固定植入物(例如关节植入物或支架)。
84.根据实施方案75所述的试剂盒用于脊柱融合。
85.根据实施方案75-84所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括大小为1μm-50mm的磷酸钙颗粒，任选地为100-1000μm的磷酸钙颗粒。
86.根据实施方案1-84所述的试剂盒用于加速牙齿再矿化或骨再生。
87.一种治疗方法，包括将实施方案1-85中任一项所述的试剂盒的成分施用于有需要的受试者的牙齿或骨骼。
88.根据实施方案87所述的方法，其中第一步施用包含自组装肽的组合物。
89.根据实施方案87所述的方法，其中第二步施用包含自组装肽的组合物。
90.根据实施方案87所述的方法，其中所述试剂盒的成分基本上同时施用。
附图说明
图1是总结实施例1的条件和结果的表。n.a.：不适用
图2示出了实施例1的实验中形成的晶体的SEM图像，或如果没有晶体形成，干溶液的SEM图像。A：HA(对照)、B：ACP(对照)、C：CaNa、D：CaPaNa、E：CaPaNAaF、F：α、G：β、H：γ-1、I：γ-2、J：δ。
a/b)指定的不同比例
c)混合后形成的溶液照片
d)如果适用，通过数字放大镜观察形成的晶体显微镜图像。
具体实施方式
实施例
实施例1
存在或不存在自组装肽P11-4(Bachem，E104)和/或NaF的情况下，制备不同浓度的CaCl2(二水氯化钙，pH 6)和Na2HPO4(二水磷酸氢二钠，pH 8)的独立溶液。如果需要，用NaOH将pH值校正至8。根据Kirkham等人2007年制备的再矿化溶液(也称为人工唾液)，由1.5mMCa(NO3)2、0.9mM KH2PO4、130mM KCl、60mM Tris(pH 7.4)组成。所有盐均从Sigma-Aldrich获得。
如图1所示，将独立的组合物转移到双室注射器(SulzerMixpac)的腔室，混合单位，静态混合器，例如1:1，添加DN2、棕色(SulzerMixpac)，并挤出组合物。如果未另行规定，浓度与注射器中的浓度有关。挤出后，浓度分别为规定浓度的一半，因为每种溶液均1:1稀释了。
此外，所有组合物包括足够高浓度的钙和磷酸盐，至少0.01M，即高于再矿化缓冲液，磷酸钙晶体基本上立即沉淀。通过SEM(图2)和分析Ca/P比(图1)分析了从SigmaAldrich获得的晶体，并进行了比较，HA和ACP有助于评估形成的磷酸钙形式。Ca/P比为1.6或更高，视为HA(例如，Jeffre等人，1993)。
下面提供了每个实验的准备和结果的更多细节。
实施例1A-SCaNa/CaPaNa/CaPaNaF：
制备0.36M CaCl2(二水氯化钙，SigmaAldrich，pH 6)和0.4MNa2HPO4(二水磷酸氢二钠，SigmaAldrich，pH 8)的新鲜溶液。
CaNa：CaCl2溶液和Na2HPO4溶液分别转移至配备有静态混合器(1:1)的双室注射器系统的一个腔室。这两种溶液通过混合器转移，产生混合液体(pH 6-7)，其中立即形成沉淀物。SEM示出了球形沉淀物，其中所述颗粒是典型的ACP(参见ACP对照)。所述SEM进一步示出了干燥过程产生的典型NaCl晶体。
CaPaNa：将所述自组装肽P11-4添加到Na2HPO4溶液中。将150mg自组装肽P11-4称重至5mL艾本德管中，并加入3mLNa2HPO4溶液(0.4M)。用NaOH(1N)将pH调节至pH＝8。对溶液进行超声处理(30s)，产生浓度为30mg/mL的澄清且透明的溶液。该溶液包括自组装肽p11-4和Na2HPO4以及CaCl2溶液，其每一个均转移至双室注射器系统的腔室。两种溶液1:1通过混合器转移，产生混合液体(pH 6-7)，其中立即形成沉淀物。SEM示出了典型的ACP球形沉淀物颗粒。
将自组装肽P11-4添加到Na2HPO4溶液中，形成具有0.65的低Ca/P比的磷酸钙，表明比没有自组装肽的晶体特性更差。所述溶液似乎在Ca2+和PO43-离子中高度超饱和，立即发生沉淀，添加自组装肽纤维无法控制/催化更有序晶体的形成。自组装肽上的重结晶可能进一步导致HA的形成。
CaPaNaF：含有30mg*mL-1自组装肽P11-4的Na2HPO4溶液(0.108M Ca2+和0.12M磷酸盐)富含NaF(1450ppm氟化钠；即典型商用牙膏的氟化物浓度)，以评估氟化物离子对晶体生长的影响。将所得Na2HPO4/自组装肽P11-4/氟化物和CaCl2溶液(0.108M)转移至双室注射器系统并1:1混合。pH值为6-7，最终P11-4浓度为15mg/mL的液体，立即显示出3D效果。立即形成与HA相似的晶体样结构。Ca/P比>2。因此，在(1450ppm)处添加氟化物有利于HA形成，尽管自组装肽P11-4掺入了CaCl2溶液，所述自组装肽仍是有利的。
实施例1B-“希腊”系列
研究自组装肽P11-4和离子浓度的影响。
制备0.14M CaCl2(pH＝6-7；二水合氯化钙)和0.14M Na2HPO4(pH＝8；二水合磷酸氢二钠)的新鲜溶液和再矿化缓冲液。
α：在不存在自组装肽的情况下，将0.14M CaCl2溶液和0.14M Na2HPO4溶液分别转移到配备有静态混合器(1:1)的双室注射器系统中。将两种溶液转移到混合器中，立即混合得到pH中性液体。扁平的方形晶体立即形成。SEM上可见的晶体似乎是NaCl立方晶体。在立方NaCl晶体之间，可以看到磷酸钙沉淀物的球体，外观类似于ACP。所述Ca/P比值为1.26，也类似于ACP。
β：新鲜制备双浓缩再矿化缓冲液/人工唾液溶液，并立即转移到双室注射器的一个腔室中，而在另一个桶中，转移的是普通水。将两种溶液通过混合器转移，立即混合得到pH中性液体。在接下来的12小时内没有沉淀或晶体形成。
δ：制备双浓缩再矿化缓冲液/人工唾液溶液用于实验β。然而，将以20mg/mL溶解在水中(用1NNaOH将pH调节至pH＝8)、并超声处理30秒、形成为均匀、透明溶液的自组装肽P11-4，置于双室注射器的另一个腔室中，而不是水中。这两种溶液通过混合器转移，立即混合得到pH中性液体。在接下来的12小时内没有沉淀或晶体形成。在记录过程中，SEM图片上看到的晶体仅溶液干燥时形成。
γ-1：将自组装肽P11-4(20mg/mL)添加到0.14M磷酸钠溶液(用1N NaOH调节至pH＝8)中，超声处理30秒，形成透明溶液。将0.14M CaCl2溶液和0.14M Na2HPO4溶液分别转移到双室注射器中并1:1混合。这形成了pH中性的混合液体，其中立即形成具有交错或网状形态的沉淀物，具有可见晶体。Ca/P比值仍与Ca/P比值＝1.1相似。在SEM图像上，似乎形成了自组装肽p11-4纤维，磷酸钙沉淀在其周围。
γ-2：实验同γ-1，但20mg/mL的所述自组装肽P11-4被添加到0.14M CaCl2溶液中(用1N Na OH调节pH至8)，超声30s后溶液仍呈白色不透明。将所述溶液分别转移到双腔注射器中，1：1混合。这形成了pH中性的混合液体，其中立即形成具有交错或网状形态的沉淀，具有可见晶体。
然而，将自组装肽P11-4肽添加到0.14M CaCl2溶液中，浓度为20mg/mL(pH值用1NNaOH调节至pH＝8)，即使在超声处理30秒后，也会产生白色/不透明溶液。溶液分别转移到双室注射器中，并以1:1混合。这导致pH中性混合液体，其中立即形成具有交错或网络状形态的沉淀物，具有可见晶体。
令人惊讶的是，当自组装肽P11-4加入CaCl2溶液中时，形成的沉淀物的Ca/P比值增加至Ca/P比值＝1.7，清楚地表明形成了磷灰石结构。SEM图片示出了自组装肽P11-4纤维周围的细针型晶体。
总之，当Ca2+和PO43-离子的浓度在生理盐浓度范围内时，例如约0.05-0.15M，添加自组装肽P11-4会使得自组装肽纤维周围的产生磷酸钙沉淀。沉淀的钙磷酸晶体形式取决于自组装肽P11-4的存在、Ca2+与PO43-离子的浓度以及氟化物的存在，以及在混合之前包含自组装肽P11-4的溶液。
如果钙和磷酸盐离子的浓度高，例如0.36M，则在不存在和存在自组装肽P11-4的情况下，沉淀均倾向于无定形，表明Ca2+和PO43-超饱和度太高以至于沉淀反应快于结晶成核(换句话说，钙磷酸盐晶体在自组装肽原纤表面的模板化太慢而无法竞争)。
在Ca2+和PO43-离子的生理盐浓度范围内(0.14M，或在所得溶液中，0.07M)，所述沉淀反应和成核以及二级晶体生长似乎与磷酸钙的形成竞争。如果自组装肽包含在含有磷酸盐的溶液中，则形成ACP，表明在沉淀之前不存在Ca2+离子的模板化或预定位。然而，当自组装肽包含在含有Ca2+的溶液中时，形成羟基磷灰石。在不受理论约束的情况下，这可能表明钙离子是预定位的，可能是通过与自组装肽的低阶聚集体结合，使得HA和二级晶体生长的快速核化，主导ACP的沉淀。
有趣的是，向系统中添加氟离子使得HA形成，即使Na2HPO4溶液中包含自组装肽。似乎氟离子的存在有利于HA晶体的成核。
显微镜评估样本制备
将样本干燥(12小时；40℃)，冲洗(如有可能)并再次干燥。收集形成的沉淀物用于扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线光谱仪(EDX)分析。
样本单独放置在配备有碳带的样本架上，并喷撒上金(30s)。涂层的平均厚度为3-4nm。喷撒后，将样本转移至SEM(SEM Supra40 VP；10kV；WD＝～8mm，Zeiss)并进行视觉评估。
使用安装在SEM上的EDX束分析原子成分。标准放大倍数为1000X。
Ca/P的计算
EDX：通过使用软件(ThermoScientific NSS，3.3版)对Ca和P峰进行关键评估来确定元素比值的百分比。出于计算目的，在计算中扣除Au(来自金涂层)，以避免高估P值。计算如下：
(元素wt(Ca)/元素wt(P))＝Ca/P比值。
序列表
<110> 克里登蒂斯股份公司
<120> 用自组装肽和无定形磷酸钙加速牙齿再矿化和骨再生
<130> 12845 P 6575 WO
<160> 7
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<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P11-4
<400> 1
Gln Gln Arg Phe Glu Trp Glu Phe Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P11-2
<400> 2
Gln Gln Arg Phe Gln Trp Gln Phe Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P11-29
<400> 3
Gln Gln Glu Phe Glu Trp Glu Phe Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P11-13
<400> 4
Glu Gln Glu Phe Glu Trp Glu Phe Glu Gln Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P11-8
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> 鸟氨酸
<400> 5
Gln Gln Arg Phe Xaa Trp Xaa Phe Glu Gln Gln
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P11-14
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> 鸟氨酸
<400> 6
Gln Gln Xaa Phe Xaa Trp Xaa Phe Xaa Gln Gln
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 鸟氨酸
<220>
<223> P11-28
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> 鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> 鸟氨酸
<400> 7
Xaa Gln Xaa Phe Xaa Trp Xaa Phe Xaa Gln Xaa
1 5 10

Claims (16)

1.一种试剂盒，包括，
a)自组装肽，所述自组装肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少70％一致性的氨基酸序列，以及
b)(i)独立组合物中的钙离子和磷酸根离子，所述钙离子和磷酸根离子如果在水的存在下混合，适于立即形成磷酸钙沉淀物，其中所述组合物优选为溶液，或
(ii)磷酸钙颗粒，优选为包含至少50％ACP的磷酸钙颗粒悬浮液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，用于在需要的受试者至少一个区域诱导牙齿再矿化或骨再生。
3.根据前述权利要求中任一项所述试剂盒，包括
(b)独立组合物中的钙和磷酸盐离子，所述钙离子和磷酸根离子如果在水的存在下混合，适于立即形成磷酸钙沉淀物ACP，其中所述组合物优选为溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述溶液包括浓度为0.01-0.5M的Ca2+离子，例如0.1-0.15M的Ca2+离子，其中所述溶液优选包括CaCl2。
5.根据权利要求3或4中任一项所述的试剂盒，其中所述溶液包括浓度为诸如0.1-0.15M的0.01-0.5M的磷酸盐离子，其中所述溶液优选包括Na2HPO4。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽是包含钙离子的组合物的一部分，其中所述组合物优选为溶液。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽是包含磷酸盐离子的组合物的一部分，其中所述组合物优选为溶液。
8.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，还包括氟离子。
9.根据权利要求1-2或8中任一项所述的试剂盒，包括
(b)磷酸钙颗粒，优选包括至少50％的ACP，任选地包括ACP水悬浮液。
10.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽包括氨基酸序列SEQID NO:1，其中所述自组装肽任选地由所述氨基酸序列组成。
11.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述自组装肽以选自干组合物、冻干组合物、水基溶液、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂或糖果的组合物的形式提供。
12.根据权利要求1-2或8-11中任一项所述的试剂盒，其中所述组合物包含磷酸钙颗粒，所述磷酸钙颗粒以选自干燥粉末、水基悬浮液、无水产品、牙膏、牙齿凝胶、漱口水、口腔喷雾、口腔护理泡沫、口香糖、太妃糖、润喉糖、片剂或糖果的形式提供。
13.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒为固体或半固体组合物，包括，
a)第一部分中，自组装肽，以及
(b)第二部分中，任选地，所述第二部分被所述第一部分、所述磷酸根离子或所述磷酸钙颗粒包围。
14.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒用于医药。
15.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，用于诱导受试者牙齿内或牙齿上的再矿化，优选用于治疗牙齿病变。
16.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒用于诱导受试者骨骼再生，
优选用于治疗骨缺损，任选地由肿瘤或创伤引起的骨缺损，牙槽脊的增强或重建治疗，填充牙周缺损，根切除术、根尖切除术、囊切除术后填充缺损，填充拔牙之后的齿槽以增强牙槽嵴的保存，提升上颌窦底，填充牙周缺损，填充植入物周围缺损或用于骨科适应症。
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