CN116606856A - 一种水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR及其应用。该水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的绿色组织特异性启动子pOsPTHR特异性强，在水稻种子中表达量很低，可以根据需要表现型特征进行应用。含本发明启动子的转基因水稻可以特异性地表达外源基因，并有效降低外源基因导入对水稻胚乳的影响，可用于提高作物种子品质、改良作物性状以及培育转基因植物新品种等方面。

Description

一种水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR及其应用
技术领域
本申请涉及分子技术和植物基因工程领域，具体而言，涉及一种水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR及其应用。
背景技术
水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食，通过转基因手段将外源DNA序列，包括抗虫、抗除草剂等功能基因通过分子手段连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，达到植物性状改良的目的，部分功能基因不需要在种子中表达，可以通过特异性启动子来控制基因的表达量。启动子类型的选择包括基因的表达时间和部位，植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5’端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始，在转录调控中起关键作用。
根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型启动子，比如CaMV35S启动子和玉米Ubiquitin 1启动子，水稻的Actin1启动子等，然而在利用这些启动子诱导目的基因在水稻中表达时，往往会由于表达的时间、空间或者在不同组织中的表达不能很好的控制，或者这些启动子在某组织中表达量高影响生长发育等原因，使得利用组成型启动子改良作物时会遇到障碍。 特异性启动子可以在特定的条件、部位或者时段集中表达。随着转基因农作物在全球的大面积推广，启动子在转基因中的重要性得到广泛的共识。因此在组织特异启动子的研究领域中，特异性启动子是人们比较关注的, 这对水稻进行分子改良或生产具有特殊用途的新水稻品种等方面有重要的意义。但是目前人们所发现的特异性启动子的遗传资源并不是十分丰富，限制了人们对不同性状改良能力的提升应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有启动子活性的DNA分子，使目的基因能够在绿色组织中高效特异表达。
为了实现上述目的，本发明提供了一种水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR，其核苷酸序列选自下述a)-c)任一项所述的序列：
(a) 序列表中SEQ ID NO：1所示的序列或其互补序列；
(b)与a)限定的序列具有75％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；
(c)在严格条件下与a)或b)限定的序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
上述所述严格条件是在2×SSC，0 .1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次 5min 0 .5×SSC，0 .1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。
为实现上述目的，本发明还提供了一种嵌合基因，所述嵌合基因包含目的基因，以及与目的基因序列可操作地连接的、前述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR。
本发明还提供了一种表达盒、重组表达载体或者宿主菌，所述表达盒、重组表达载体或宿主菌包含前述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR或嵌合基因。
本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。公认地，由于本发明启动子区域核苷酸序列已经确定，从本发明具体启动子区域上游的 5’翻译区内进一步分离和鉴定调节元件属于现有技术。因此，本发明启动子区域进一步包括上游调节元件，它赋予与本发明启动子序列可操作地连接的任何异源核苷酸序列组织特异性表达，优选是在光合组织中特异性表达，更优选地在叶肉组织中特异性表达。
本发明中术语“基因”是指在适宜的调控区域(例如植物可表达性启动子区域 )控制下在细胞内含有被转录成RNA分子(例如mRNA)的DNA区域 (“转录的DNA区域”) 的任何DNA片段。基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。因此，基因可能含有几种可操作性连接的DNA片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸化位点的 3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表现。组成简单生命最少要265到350个基因。
本发明分离的启动子序列的特征是提供目的异源核苷酸序列的绿色组织特异性表达。
绿色组织通常为在植物体中可以进行光合作用或潜在光合作用的部分，例如绿色叶片、绿色叶鞘、果壳等，绿色组织通过光合作用利用无机物生产有机物(淀粉)并且贮存能量，以使植物体获得生长发育必需的养分。本发明中所述水稻绿色组织为水稻的叶、茎、根和/或颖壳。本发明中术语“绿色组织特异性”是指为特定目的，目的异源核苷酸序列在植物绿色组织细胞中的高度特异性表达。换言之，目的异源核苷酸序列主要在植物的绿色组织中表达，植物的非绿色组织中的DNA转录物水平是无法检测到的或是非常低的(每微克总RNA低于约0.2皮克)。
本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用功能上等价的启动子，这些功能等价启动子能在严格条件下与含有上述核苷酸序列的水稻启动子区域杂交。
在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，与来自被选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段(如基因组文库或cDNA文库)群体中存在的其它对应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探测的基团如32P 或其它任何可探测标记物标记，如地高辛、生物素等。因此，例如，通过标记根据本发明序列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA 和基因组文库的方法为本领域已知并公开于Sambrook 等人(1989)分子克隆：实验室手册(1第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性 (异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。
典型地，严格条件是在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na+离子，典型地大约0.01至 1.0MNa+离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10至50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针 (如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在 30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS的缓中溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中 37℃杂交，在 0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％至1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。
特别典型地是杂交后洗涤的参数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于 DNA-DNA 杂交体，Tm 可以从 Meinkoth 和 Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程估算：Tm＝81.5℃ +16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中 M 是单价阳离子的摩尔浓度，％ GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％ form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是 50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约 1℃；因此，Tm 杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥ 90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3 或 4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9 或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度 (Tm)11、12、13、14、15 或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使 Tm 低于45℃ (水溶液)或 32℃ (甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993) 生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章 (Elsevier，New York) ；和Ausubel 等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。见Sambrook 等人(1989)分子克隆：实验室手册 (第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，New York)
因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40％-50％同源，大约60％、65％或70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40％ -50％、大约60％、65％或 70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。
这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的DNA分子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。上述75％或75％以上同源性，可为80％、85％、90％、95％以上的同源性。
还可以构建人工启动子，其包含 SEQ ID NO ：1所示的核苷酸序列的 5’调控区域的决定启动子的绿色组织特异性的内部序列。所述人工启动子可能包含能在植物中表达的另一启动子的“核心启动子”或“TATA 盒区域”，例如 WO 93/19188 中所述的 CaMV 35S“TATA 盒区域”。含有所述人工启动子的启动子区域的适用性可以通过它们与目的异源核苷酸序列的适当融合以及目的异源核苷酸序列在适宜组织、适当发育阶段的表达的检测进行鉴定。
B1)含有所述DNA分子的表达盒；
B2)含有所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有所述DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有所述DNA分子的转基因植物细胞系；
B9)含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有所述DNA分子的转基因植物组织；
B13)含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；
B14)含有B2)所述重组载体的转基因植物组织；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B16)含有所述DNA分子的转基因植物器官；
B17)含有B1)所述表达盒的转基因植物器官；
B18)含有B2)所述重组载体的转基因植物器官；
B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，所述表达盒可由所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR、所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GFP基因。
所述重组载体中，由所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在植物表达载体的多克隆位点插入所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR得到的重组质粒。所述目的基因具体为GFP基因。
本发明所涉及的设计方案为，一种水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR，通过生物信息学的方法初步确定，在水稻自交系中扩增该启动子，通过在水稻中验证在愈伤中特异性表达的启动子，具有序列表中SEQ ID NO：1所示的序列。
本发明所述的启动子序列及其片段，当组装进DNA结构使启动子序列与目的异源核苷酸序列可操作地连接时，用于遗传性操控任何植物。所述“可操作地连接”是指本发明的启动子序列与第二个序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和调节对应于第二个序列的 DNA 序列的转录。一般地，可操作地连接是指被连接的核酸序列是连续的，必要时相邻地结合两个蛋白编码区，并在同一个阅读框内。以此方式，启动子核苷酸序列与目的异源核苷酸序列构成所述嵌合基因在表达盒中一起提供，以在目的植物中表达。这种表达盒提供了大量限制性位点以插入目的异源核苷酸序列，所述目的异源核苷酸序列将受到包含本发明启动子序列的调节区的转录调节。表达盒可另外含有至少一个将共转化进生物体的附加基因。可选择地，附加基因可以在多个表达盒上被提供。
表达盒可另外含有可选择的标记基因（报告基因）。一般地，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因(如编码新霉素磷酸转移酶II(NPT))、磷酸甘露糖异构酶(PMI) 的基因和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和 2，4- 二氯苯氧乙酸酯 (2，4-D)。
表达盒包括沿 5’-3’方向转录的本发明的启动子序列、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、和在植物中起作用的转录和翻译终止区。目的异源核苷酸序列可以是天然的或对植物宿主外源的或异源的。可选择地，目的异源核苷酸序列可以是天然序列或选择性合成序列。“外源”是指在导入转录起始区的天然植物中不存在所述的导入转录起始区。例如，嵌合基因包含本发明的启动子序列，本发明的启动子序列可操作地与不同于本发明的启动子序列的编码序列连接。
终止区可来源于本发明的启动子序列，也可来源于可操作连接的目的异源核苷酸列，或可来源于另外的来源。传统的终止区可从土壤农杆菌的Ti质粒获得，如肉碱合成酶和胭脂碱合成酶(NOS)终止区。
在表达盒制备中，可以操控不同的DNA片段以提供适当方向的DNA序列，并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合DNA片段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，如转变和转换。
在适合的情况下，目的异源核苷酸序列可被优化以增加在转化植物中的表达量。即可用植物优选的密码子合成基因以改善表达。
本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的G-C含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中已知的基因表达水平进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mRNA 二级结构。
在表达盒或重组载体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)；马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒 (TEV)前导序列、玉米矮小花叶病毒(MDMV)前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP) ；来自紫花苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列；烟草花叶病毒(TMV)前导序列；和玉米萎黄病斑点病毒(MCMV) 前导序列。还可以使用其它已知的改进转录效率的元件，例如内含子等。
本发明的启动子序列可用来启动与目的异源核苷酸序列的信使RNA(mRNA) 至少部分互补的反义结构的转录。构建反义核苷酸序列以与相应的mRNA杂交。只要反义序列长到可与相应的mRNA杂交并干扰其表达，就可进行反义序列的修饰。以此方式，可以使用与相应的反义序列具有70％，优选的80％，更优选的85％序列同一性的反义结构。此外，反义核苷酸序列的一部分可被用来破坏靶基因的表达。一般可使用至少 50 个核苷酸、100个核苷酸、200 个核苷酸或更多个核苷酸的序列。
本发明的启动子序列被用于目的异源核苷酸序列的组织特异性表达。“异源核苷酸序列”是指非天然地与启动子序列一起存在的序列。虽然所述核苷酸序列与启动子序列是异源的，但对植物宿主可能是同源的或天然的或异源的或外源的。可操作地与本发明的启动子连接的异源核苷酸序列可编码目的蛋白质。这种异源核苷酸序列的实例包括但不限于，编码赋予以下抗性多肽的核苷酸序列：非生物应激如干旱、温度、盐度、臭氧和除草剂，或生物应激如病原体侵袭，包括昆虫、病毒、细菌、真菌和线虫类，并防止产生这些生物体伴随的疾病。
本发明的启动子序列和方法可用于任何目的异源核苷酸序列在植物宿主中的表达调节，以改变植物的表现型。各种目的表现型改变包括但不限于，改变植物的脂肪酸成分、改变植物的氨基酸含量、改变植物病原体防御机制等。上述改变可以通过提供异源产物的表达或增加植物内源性产物的表达而得到。可选择地，上述改变可以通过减少植物中一个或多个内源性产物的表达而得到，特别是酶或辅助因子。上述改变将导致转化植物的表现型改变。
已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获可保证得到所需表现型特征表达的种子。
本发明还提供一种前述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR在培育转基因植物中的应用。
具体的，所述应用为将待表达外源基因连接于前述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR下游，构建重组表达载体，通过重组表达载体将外源基因转入植物中，筛选得到在绿色组织中特异性表达所述外源基因的转基因植物。
本发明还提供一种上述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR在水稻基因功能研究和基因表达调控中的应用。
进一步的，所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR的下游还含有报告基因。本发明的一个具体实施例中，选择GFP作为目的基因和报告基因。
另外，可以将本发明的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR与标记序列可操作的连接以确定标记序列的活性，所述的标记序列通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如 ：四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。
可以采用任何一种的植物转化方法将本发明所构建的重组表达载体转化到受体植物的细胞、组织中，得到转化体 ；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代 ；所述的转化方法包括 ：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti 质粒、Ri 质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等。
本发明的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR特异性强，在水稻种子中表达量很低，可以根据需要表现型特征进行应用。含本发明启动子的转基因水稻可以特异性地表达外源基因，并有效降低外源基因导入对水稻胚乳的影响，可用于提高作物种子品质、改良作物性状以及培育转基因植物新品种等方面。
附图说明
图1为本发明组织特异性启动子pOsPTHR重组克隆载体LP07-T构建流程图；
图2为本发明组织特异性启动子pOsPTHR重组表达载体LP093构建流程图；
图3为本发明组织特异性启动子（pOsPTHR）转基因水稻不同组织GFP相对表达量；
图4为本发明组织特异性启动子（pOsPTHR）转基因水稻不同组织蛋白WesternBlotting图，其中1为根；2为茎；3为叶；4为颖壳；5为种子；
图5为本发明组织对照启动子(pOsActin1)转基因水稻不同组织蛋白WesternBlotting 图，其中1为根；2为茎；3为叶；4为颖壳；5为种子。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所用引物测序均由上海生工广州合成部合成； PCR试剂盒、连接试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司，方法均参照试剂盒说明书进行；载体构建过程中的核酸内切酶购于NEB公司,普通PCR Taq酶Mix购于诺唯赞公司。
实施例1、水稻组织特异性启动子pOsPTHR的克隆及序列分析
（1）DNA提取方法
采用Qiagen植物DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit提取基因组DNA，具体步骤如下：
取适量叶片放入研钵，液氮研磨；
取100 mg的研磨样品于2.0 mL离心管中，加入400 μL试剂LP1和4 μL试剂RNAase，涡旋震荡混匀，65℃孵育15 min,期间不时震荡混匀；
向离心管中加入130 μL试剂LP3，涡旋震荡混匀后置于冰上5 min，14000 rpm离心5 min；
将上清液转移到紫色柱子中，14000 rpm离心2 min；
收集上清液转移到新的离心管中，加入1.5倍体积的试剂GW1，颠倒混匀，将混匀后的液体转移到白色柱子中，12000 rpm离心1 min，弃废液，重复此步骤直至混合液全部离心；
将白色柱子置于一个新的收集管中，向柱子中加入500 μL试剂GW2，12000 rpm离心1 min，弃废液；
重复上一步骤，14000 rpm离心2 min，取出白色柱子，静止8-10 min晾干柱子； 将晾干的柱子置于新的1.5 mL离心管中，加入50-150 μL溶液TE进行溶解，静止5 min，12000rpm离心1 min。
（2）在Rice Expression Databaseh(http://expression.ic4r.org/)下载水稻表达谱数据库，建立水稻表达谱本地数据库，根据表达量大小及不同组织，选“leaf”表达量高，水稻种子不表达的基因进行Blast(blast-search),选取基因LOC_Os6h05440上游2000bp的序列进行合成并扩增，将启动子命名为pOsPTHR，上游加 HindIII(AAGCTT) 酶切位点，下游加 AvrII(CCTAGG) 酶切位点，将步骤（1）提取的 DNA 稀释 10 倍后作为 PCR 扩增模板进行PCR扩增。
引物(5’-3’)序列如下：
引物1： 5‘- CCAAGCTTACTTTCTTGAACGAGGCTTATTTGCT-3’（SEQ ID NO:2）
引物2： 5’- CCCTAGGAAAAGTTGAAAGTTTGTGCGTAGG -3’（SEQ ID NO:3）
PCR 反应体系为 ：
2*Mix: 20μL
10uM引物1： 0.8μL；
10uM引物2： 0.8μL；
水稻基因组DNA： 10pg；
ddH2O： up to 40μL。
PCR 反应条件为：
反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化2000bp的目的片段，将其克隆到载体pEASY-T5(全式金生物技术有限公司)，再转化到 Trans5α 化学感受态细胞(全式金生物技术有限公司)中，PCR筛选阳性克隆，进行测序，获得的序列经过测序与基因LOC_Os6h05440上游2000bp的序列完全一致，测序结果表明pOsPTHR具有序列表中SEQ ID No：1的DNA序列，序列表中的SEQ ID No：1由2000个碱基组成，将含有pOsPTHR DNA序列的重组质粒载体命名为LP08-T（图1）。
实施例2、启动子的功能验证
一、水稻PTHR基因启动子pOsPTHR表达载体LP094的建立
用限制性内切酶HindIII和AvrII酶切重组克隆载体LP08-T的pOsPTHR启动子序列片段插到表达载体隆平生物LP-BB3表达载体的HindIII和AvrII位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体LP094，其载体构建图如图2所示，具体是：HYG：潮霉素抗性基因，在该基因上游有一p35s启动子，终止子为t35s；pOsPTHR：启动子pOsPTHR；GFP：Green fluorescent protein基因，即GFP荧光蛋白；tNOS：终止子。
将重组表达载体LP094用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组表达载体LP094)，42℃水浴30秒 ；37℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶HindIII和AvrII酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体LP094在HindIII和AvrII位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即pOsPTHR启动子序列。
将重组表达载体转化农杆菌，对己经构建正确的重组表达载体LP094用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶HindIII和AvrII进行酶切验证，结果表明重组表达载体LP094结构完全正确。
二、转基因水稻植株的获得及分析
(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养与继代培养
去壳的水稻成熟种子先用ddH2O洗4-5次，再用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用含有1/1000吐温的20%次氯酸钠浸泡30分钟，期间不停的摇晃，从而进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗3-4次，再将成熟种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在愈伤诱导培养基上，28℃弱光培养。约10-15天后，将愈伤组织转入继代培养基上，在相同条件下继代培养。每两周继代培养一次，继代两次后挑选继代培养5-7天，将色泽淡黄的愈伤组织用于共培养。
(2)用于转化水稻的农杆菌菌液的准备：将含有重组表达载体LP094的农杆菌接种于YEP液体培养基(含有100μg/mL Kan 和50μg/mL利福平)中，28℃振荡培养至 OD600=0.6-1.0 ；室温下5000rpm 离心5分钟收集菌体，随后将其悬浮于液体共培养基中，调整菌体浓度至OD600=0.4，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
(3) 农杆菌侵染水稻愈伤组织
挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入25 mL无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液以保证有足够的菌液与材料接触，28℃、150 rpm摇床上培养20-30分钟。之后倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，22℃暗培养2-3天。
(4) 抑菌处理
用ddH2O清洗愈伤组织 3-4 次至清洗液清亮，弃去清洗液，用无菌滤纸吸干，转入含有头孢霉素(500mg/L)和羧苄青霉素(200mg/L)的溶液中振荡灭菌半个小时以上，用无菌滤纸吸干，转至铺两层无菌滤纸的培养皿中干燥处理24-72小时;将愈伤组织转移至加有头孢霉素(500mg/L)和潮霉素(50mg/L)筛选培养基上，28℃光照培养约30天。
(5) 抗性愈伤组织的分化
从筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的潮霉素抗性愈伤转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先28℃暗培养3天，然后转至30℃全光照条件下培养，一般经过15-20天左右，有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。
(6) 生根、壮苗和移栽
抗性愈伤组织分化出的小苗高度大于3cm 时，移到生根培养基上，培养2-3周。选择高15cm 以上、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，晴天需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)。待转基因小苗生长健壮后移入田中生长。
三、转基因水稻的鉴定
提取的转基因水稻总 DNA 为模板，用抗性筛选基因潮霉素的上游引物和下游引物配对扩增模板，可以初步鉴定转基因植株。
用于检测潮霉素抗性基因的引物(5’-3’)序列 ：
引物 3(上游引物)：5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’（SEQ ID NO:4）
引物 4(下游引物)：5’-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’（SEQ ID NO:5）；
潮霉素基因拷贝数的鉴定：
分别取潮霉素基因检测为阳性的水稻转基因植株和作为阴性对照的转化受体品种水稻约 100mg，用 Qiagen 的 DNeasy Plant Maxi Kit 提取其基因组 DNA，通过Taqman 探针荧光定量 PCR 方法检测潮霉素基因的拷贝数。同时以转化受体品种水稻作为负对照，使用ABI QuantStudio5 Q5 ABI QuantStudio5 Q5实时荧光定量PCR仪进行检测。
用 NanoDrop 2000(Thermo Scientific) 测定上述样品的基因组 DNA 浓度，根据所测浓度将浓度调整100ng/μL。
采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以转化受体品种水稻植株的样品作为负对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量 PCR 引物和探针序列分别为：
潮霉素基因引物及探针(5’-3’)：
HYG-qF: 5’-CGGATTTCGGCTCCAACA- 3’（SEQ ID NO:6）
HYG-qR: 5’-GCCTCGCTCCAGTCAATGAC-3’ （SEQ ID NO:7）
HYG-qP: 5’-FAM-TCCTGACGGACAATGGCCGCAT-BHQ1-3’ （SEQ ID NO:8）
水稻内参引物及探针(5’-3’)：
PLD-qF: 5’- TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT- 3’ （SEQ ID NO:9）
PLD-qR: 5’-CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC- 3’ （SEQ ID NO:10）
PLD-qP: 5’-VIC- TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1-3’ （SEQ ID NO:11）
GFP基因引物及探针(5’-3’)：
GFP-qF: 5’-CTGCTGCCCGACAACCA- 3’ （SEQ ID NO:12）
GFP-qR: 5’-GACCATGTGATCGCGCTTCT- 3’ （SEQ ID NO:13）
GFP-qP: 5’-FAM-ACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGA -BHQ1-3’ （SEQ ID NO:14）
PCR反应体系：
2×AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μl
Primer1 (10 µM) 0.4 μl
Primer2 (10 µM) 0.4 μl
TaqMan Probe (10 µM) 0.2 μl
50 × ROX Reference Dye 1 0.4 μl
Template DNA 100ng xμl
ddH2O Up to 20 μl
PCR反应条件：
利用QuantStudioTmDesign&Analysis软件 (Applied Biosystems)及CopyCallerRsoftware version 2.1 分析数据。
实验结果表明，水稻品种的pOsPTHR基因启动子序列与GFP基因已经整合到水稻植株的染色体中，而且可以从阳性植物中挑选出GFP及HYG均为单拷贝的植株，为下一步分析GFP表达量提供数据。
启动子转录水平上的组织特异性检测
分别取GFP及HYG均为单拷贝转基因阳性植株抽穗期的根、茎、叶、颖壳和成熟期的种子，利用Trizol法提取各组织的RNA，再通过诺唯赞公司生产的反转录试剂盒将其反转成cDNA。根据报告基因GFP的序列设计RT-qPCR引物(GFP-F和GFP-R)，以各组织的RNA反转录产物为模板，以水稻GAPDH基因为内参(引物为GAPDH-F和GAPDH-R)，使用SYBR Green I嵌合荧光法进行RT-qPCR，所得的结果以公式2-△△CT来计算各组织的基因表达情况。
候选启动子的组织特异性表达模式分析引物(5’-3’)：
GAPDH-F：CTGCAACTCAGAAGACCGTTG（SEQ ID NO:15）
GAPDH-R：CCTGTTGTCACCCTGGAAGTC（SEQ ID NO:16）
GFP-F：AAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATC（SEQ ID NO:17）
GFP-R：CCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATA（SEQ ID NO:18）
反转录第一步反应体系：
4×gDNA wiper Mix 4 μl
Oligo(dT)23VN(50 μM) 1 μl
Random hexamers(50 ng/μl) 1 μl
RNA 2 ng
Rnase-free ddH2O up to 16 μl；
反应条件：
42 ℃，2 min。
反转录第二步反应体系：
第一步混合液16 μl
10×RT Mix2 μl
HiScript Ⅱ Enzyme Mix2 μl；
反应条件：
50 ℃，15min；85 ℃，2 min。
qPCR反应体系：
2×ChaamQ Universal SYBR qPCR Master Mix5 μl
Primer 10.2 μl
primer20.2 μl
cDNA2 μl
ddH2OTo10 μl
总体积10 μl
qPCR反应条件：
以组成型启动子pActin1代替本发明实施例中的组织特异性启动子pOsPTHR，构建对照启动子（pActin1）转基因水稻。
检测对照启动子（pActin1）转基因水稻和本发明组织特异性启动子（pOsPTHR）转基因水稻不同组织GFP相对表达量并进行Western杂交试验，结果如图3-5所示。
从图中可以看出，在对照启动子pActin1的转基因植株的各种组织中均检测到了GFP基因的表达，在本发明组织特异性启动子（pOsPTHR）转基因水稻的绿色组织（根、茎、叶、颖壳）中均检测到GFP基因的表达，而只在种子中检测到极少 GFP基因的表达，从而证明pOsPTHR在水稻绿色组织中特异性表达。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR，其特征在于，所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR的核苷酸选自下述a)-c)任一项的序列：
(a) 序列表中SEQ ID NO：1所示的序列或其互补序列；
(b)与a)限定的序列具有75％以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；
(c)在严格条件下与a)或b)限定的序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR，其特征在于，所述水稻绿色组织为水稻的叶、茎、根和/或颖壳。
3.一种嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因包含目的基因，以及与目的基因序列可操作地连接的、权利要求1或2所述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR。
4.一种表达盒、重组表达载体或者宿主菌，其特征在于，所述表达盒、重组表达载体或宿主菌包含权利要求1或2所述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR，或包含权利要求3所述的嵌合基因。
5.权利要求1或2所述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR在培育转基因植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将待表达目的基因连接于权利要求1所述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR下游，构建重组表达载体，通过重组表达载体将目的基因转入植物中，筛选得到在绿色组织中特异性表达所述目的基因的转基因植物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR的下游还含有报告基因。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述目的基因或所述报告基因为GFP。
9.权利要求1或2所述的水稻绿色组织特异性启动子pOsPTHR在水稻基因功能研究和基因表达调控中的应用。
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