CN116606803A - 雷公藤单体在抑制间充质干细胞的促瘤性中的相关应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了雷公藤单体在抑制间充质干细胞的促瘤性中的相关应用，涉及生物医药领域。本发明通过雷公藤单体体外处理MSCs，有效抑制了间充质干细胞MSCs的促瘤性，提高了MSCs的安全性和其对于肿瘤的治疗效果，也扩大了间充质干细胞的适应人群。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及雷公藤单体在抑制间充质干细胞的促瘤性中的相关应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem/stromal cells，MSCs)又称间充质基质细胞，是来源于包括脐带、骨髓和脂肪等多种组织在内的非造血多能性干细胞，具有自我更新、增殖及多向分化能力。由于MSCs来源广泛，容易分离，能快速扩增，且具有独特的免疫调节等特性，这使得其成为移植领域和治疗免疫性疾病的理想选择。目前MSCs的细胞移植、组织修复、造血支持及再生医学研究受人瞩目。临床移植治疗用的间充质干细胞制剂，需要经过组织采集、分离纯化、原代培养、传代扩增、冷冻保存、放行检测等程序。MSCs是当前干细胞治疗领域研究和应用最多的干细胞种类，已经越来越多的引起科学家及临床医生的青睐。
然而，目前体外扩增MSCs也会带来一些生物学安全问题，特别是：促瘤特性。2015年由国家卫计委与国家食品药品监督管理局联合发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》中也指出：目前，普遍认为间充质干细胞“不致瘤”或具有“弱致瘤性”，但研究显示MSCs对已存在的肿瘤有“促瘤性”作用。而且几个专家共识都认为MSCs治疗的患者均需要排除既往有肿瘤病史或现患肿瘤者，或病理检查证实有癌前病变者(间充质干细胞治疗新型冠状病毒专家共识(2021年，北京)；异体间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮专家共识(2022)；细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾专家共识(2015)；干细胞移植规范化治疗肝硬化失代偿的专家共识(2021))。MSCs促瘤特性在一定程度上限制或阻碍了其在临床治疗中的应用范围。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供雷公藤单体在抑制间充质干细胞的促瘤性中的相关应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了雷公藤单体在制备用于抑制间充质干细胞的促瘤性的产品中的应用。
第二方面，本发明实施例提供了雷公藤单体在抑制间充质干细胞的促瘤性中的应用。
第三方面，本发明实施例提供了雷公藤单体在制备用于治疗或辅助治疗目标肿瘤的产品中的应用，所述雷公藤单体为前述实施例所述的雷公藤单体，所述目标肿瘤包括白血病、结肠肿瘤和淋巴瘤中任意一种或多种。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过雷公藤单体体外处理MSCs，有效抑制了间充质干细胞MSCs的促瘤性，提高了MSCs对于肿瘤的治疗效果，同时减少或规避了雷公藤单体进入体内带来的毒性，扩大了间充质干细胞的适应人群。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
目前间充质干细胞临床应用的最大忧虑依然是其安全性，其中促瘤性又是其安全性中的关注重点。本发明发现，利用雷公藤单体体外处理MSCs，能够有效抑制间充质干细胞MSCs的促瘤性，提高MSCs的安全性，扩大间充质干细胞的适用人群。在一定的范围内也具有抑制肿瘤的特性。
一方面，本发明实施例提供了雷公藤单体在制备用于抑制间充质干细胞的促瘤性的产品中的应用。
在一些实施方式中，所述雷公藤单体包括：雷公藤甲素、(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇、雷公藤红素和雷公藤红素丙酯中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述雷公藤单体包括：雷公藤甲素和/或雷公藤红素。
在一些实施方式中，所述间充质干细胞的促瘤性包括：间充质干细胞对白血病、结肠肿瘤和淋巴瘤中任意一种或多种肿瘤的促瘤性。所述结肠肿瘤包括：结肠良性肿瘤和结肠恶性肿瘤(结肠癌)中的任意一种或两种。
在一些实施方式中，所述间充质干细胞的来源选自：脐带、胎盘、骨髓、牙髓、脂肪、羊膜和子宫内膜中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述产品的类型包括：试剂或试剂盒。
另一方面，本发明实施例还提供了雷公藤单体在抑制间充质干细胞的促瘤性中的应用。
在一些实施方式中，所述雷公藤单体为前述任意实施例中所述的雷公藤单体。
在一些实施方式中，所述间充质干细胞的来源选自：脐带、胎盘、骨髓、牙髓、脂肪、羊膜和子宫内膜中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述间充质干细胞的促瘤性包括：间充质干细胞对白血病、结肠肿瘤和淋巴瘤中任意一种或多种肿瘤的促瘤性；
在一些实施方式中，所述抑制间充质干细胞的促瘤性的方法包括：将雷公藤单体与间充质干细胞共培养。
在一些实施方式中，所述共培养的方式可以为：将雷公藤单体和间充质干细胞至于间充质干细胞的培养基中进行培养。间充质干细胞的培养基可以选自现有任意能够用于间充质干细胞培养的培养基，例如，无血清培养基。
在一些实施方式中，所述雷公藤单体的作用浓度为：1～2000ng/ml。该作用浓度具体可以为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、80、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900和2000ng/ml中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，当雷公藤单体为雷公藤甲素或(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇时，雷公藤单体的作用浓度为：1～200ng/ml，具体可以为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、80、100、120、140、150、160、180、200ng/ml中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，当雷公藤单体为雷公藤红素或雷公藤红素丙酯时，雷公藤单体的作用浓度为：100～2000ng/ml，具体可以为100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900和2000ng/ml中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述共培养的条件包括：1min～100h。该时间具体可以为1min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、1h、5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98和100h中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施方式中，所述共培养的温度可以为36～38℃，具体可以为36、36.5、37、37.5、38℃中的任意一种或任意两种之间的范围。
可选地，当雷公藤单体为雷公藤甲素时，所述共培养的时间为1min～60min，具体可以为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min中的任意一种或任意两种之间的范围。
可选地，当雷公藤单体为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇时，所述共培养的时间为24h～72h，具体可以为24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、72h中的任意一种或任意两种之间的范围。
可选地，当雷公藤单体为雷公藤红素时，所述共培养的时间为12h～48h，具体可以为12、15、20、25、30、35、40、45、48h中的任意一种或任意两种之间的范围。
可选地，当雷公藤单体为雷公藤红素丙酯时，所述共培养的时间为72～100h，具体可以为72、75、80、85、90、95、100h中的任意一种或任意两种之间的范围。
另一方面，本发明实施例还提供了雷公藤单体在制备用于治疗或辅助治疗目标肿瘤的产品中的应用，所述雷公藤单体为前述任意实施例所述的雷公藤单体，所述目标肿瘤包括白血病、结肠肿瘤和淋巴瘤中任意一种或多种。
本发明中的“治疗”包括预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。
对于癌症来说，“治疗”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长，繁殖，或转移，或以上的某些组合。对于肿瘤来说，“治疗”包括清除全部或部分的肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或以上的某些组合。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一、实验方法
标本来源
人脐带标本来自北京友谊医院产科足月妊娠产妇，排除胎儿畸形、产妇先天性遗传病及传染病史，且签署知情同意书。供者没有检出人源性特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)、梅毒螺旋体，且6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的检查合格。在手术室无菌条件下采集脐带组织，用生理盐水洗涤脐带组织2～3次，放入采集瓶中，12小时内运输到实验室进行组织处理。
(1)脐带来源MSC的制备：
剪去脐带两头，将脐带血管中的血液捋出，将脐带分成10cm左右的小段，消毒液浸泡3min后，清洗液浸洗2～3次，直至清洗液中无血污。将每根脐带用弯头镊撕去脐带内部两根动脉和一根静脉血管，将脐带胶质清洗2～3次，剪碎至1～2mm3组织块，快速转移组织悬液至T25培养瓶，添加2ml含有10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，将培养瓶转移至置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基，当细胞生长至约80％融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养，获得脐带来源MSC。
(2)雷公藤甲素(Triptolide,TP)预处理MSC：
将MSC用胰酶消化后，PBS洗涤，用包括10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重新调整细胞浓度为1×105/ml。待细胞贴壁后弃掉上清液，分别加入含0ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml TP的新鲜培养基，孵育15分钟。
(3)TP处理MSC对肿瘤细胞增殖的体外实验
采用人白血病细胞株K562和人结肠癌细胞株Colo-205，实验设空白组(无细胞培养基)、肿瘤细胞对照组(肿瘤细胞)、MSC对照组(单纯MSC)、MSC实验组(MSC+肿瘤细胞)、TP+MSC实验组(TP+MSC+肿瘤细胞)。K562细胞浓度分别为1.0×105个/ml；Colo-205细胞浓度分别为1.0×105个/ml，每个浓度设3个平行孔。MSC细胞1.0×105个/ml接种于96孔培养板，24h后经60Co 12.5Gy照射后作为共培养铺层细胞，照射后4h接种肿瘤细胞，继续培养72h后，MTT法检测各组肿瘤细胞的吸光值(A)，并计算肿瘤细胞的增殖指数(proliferation index，PI)。PI＝(A(MSC实验组或者MSC对照组)－A(空白组))/(A(肿瘤细胞对照组)－A(空白组))。将各组PI进行统计分析，比较不同浓度下的肿瘤细胞增殖情况，以PI值在(1.00±0.20)之内为对细胞增殖无影响。
体外细胞试验结果表明，将不同浓度TP处理15分钟的MSC(1.0×105个)与悬浮生长人白血病细胞K562(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，不同浓度TP处理MSC对K562细胞增殖没有影响(表1)。将不同浓度TP处理15分钟的MSC(1.0×105个)与贴壁生长人结肠癌细胞Colo-205(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，不同浓度TP处理MSC对Colo-205细胞增殖没有影响(表1)。
表1、TP处理MSC对K562或者Colo-205细胞增殖指数PI的影响(x±s)
| 组别 | K562 | Colo-205 |
| MSC实验组 | 1.62±0.34 | 1.43±0.38 |
| 5ng/ml TP+MSC实验组 | 1.16±0.32 | 1.12±0.21 |
| 50ng/ml TP+MSC实验组 | 0.96±0.22 | 1.02±0.19 |
| 100ng/ml TP+MSC实验组 | 0.87±0.18 | 0.85±0.19 |
注：PI≤0.80，表示抑制肿瘤细胞增殖；PI≥1.20，表示促进肿瘤细胞增殖；0.80<PI<1.20，表示对肿瘤细胞增殖不受影响。
从上面的结果可以看出：MSC可以促进人白血病细胞K562和人结肠癌Colo-205细胞的增殖，即MSC具有促瘤性。5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml TP处理MSC后，使得MSC失去促瘤性。
(4)TP处理MSC对肿瘤小鼠的体内促瘤实验：
采用实体瘤WiDr和血液系统肿瘤Raji各1株，将对数生长期人结肠癌细胞WiDr细胞或人淋巴瘤细胞Raji浓度用生理盐水调整为5×107个/ml，以BALB/c裸鼠皮下注射WiDr细胞0.2ml及CB-17SCID小鼠皮下注射Raji细胞0.2ml造F0代荷瘤小鼠，待肿瘤生长至400mm3，选择肿瘤生长及健康状况良好的荷瘤动物，无菌条件下取瘤，制备成3mm3左右组织块，分别接种于动物右侧腋窝皮下制备BALB/c裸鼠人结肠癌细胞WiDr肿瘤模型和CB-17SCID小鼠人淋巴瘤细胞Raji肿瘤模型。成模动物随机分为5组：对照组、MSC组、5ng/ml TP+MSC组、50ng/ml TP+MSC组、100ng/ml TP+MSC组，每组7～8只动物，Raji模型另设空白对照组。实验组分别给予尾静脉注射1×106个MSC/只，给药体积为0.5ml，隔14天1次，共2次，对照组给予0.5ml生理盐水。
实验终点后，两个模型试验的动物安乐死后均剥离肿瘤结节，测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积(TV)、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增殖率T/C﹪，肿瘤体积的计算公式为：V＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示长和宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。相对肿瘤增殖率T/C(％)：针对每一种人癌异体移植瘤模型的抗肿瘤活性评价指标。计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV*100％。(TRTV：治疗组RTV；CRTV：对照组RTV)。如果140％>T/C％>40％，为无影响；如果T/C％≤40％或≥140％，且经统计学处理P<0.05为有影响。
由结果可知：WiDr肿瘤模型中第35天，单独MSC组的Vt值显著高于对照组(P<0.01，表2)，且T/C％值>140％；说明MSC对WiDr肿瘤的生长有显著促进作用。5ng/ml TP+MSC实验组和50ng/ml TP+MSC实验组的Vt值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，表2)。100ng/ml TP+MSC实验组的Vt值低于对照组(P<0.05，表2)，但T/C％值>40％。
由结果可知：Raji模型肿瘤中第28天，单独MSC组的Vt值显著高于对照组(P<0.01，表2)，且T/C﹪值>140％；说明MSC对Raji肿瘤的生长有显著促进作用。5ng/ml TP+MSC实验组、50ng/ml TP+MSC实验组和100ng/ml TP+MSC实验组的Vt值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，表2)。
表2、TP处理MSC对WiDr或者Raji模型肿瘤体积Vt的影响(mm3，x±s)
| 组别 | WiDr(35天) | Raji(28天) |
| 对照组 | 876.4±105.6 | 1207.2±374.8 |
| MSC实验组 | 1532.9±364.7** | 2031.1±425.6** |
| 5ng/ml TP+MSC实验组 | 963.1±117.5 | 1324.6±417.7 |
| 50ng/ml TP+MSC实验组 | 825.9±98.4 | 1055.0±285.2 |
| 100ng/ml TP+MSC实验组 | 637.3±102.8* | 899.5±157.3 |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
根据国家食品药品监督管理总局药品审评中心发布《细胞毒类抗肿瘤药物非临床评价的指导原则》的判断标准，判定5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml TP处理MSC后，对WiDr和Raji肿瘤的生长均无促进作用。
实施例2
(1)将实施例1中的人脐带来源MSC更换为人脂肪来源MSC，脂肪来源MSC的分离、培养操作如下：
供者排除先天性遗传病及传染病史，且签署知情同意书。供者没有检出人源性特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)、梅毒螺旋体，且6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的检查合格。由整形医师行脂肪抽吸术，抽取脂肪组织，置于无菌采集袋或瓶中保存，用生理盐水冲洗，剪刀剪碎；加入0.1％胶原酶，37℃消化30min；200目细胞筛过滤，收集有核细胞；接种至完全培养基(IMDM基础培养基+5％人血小板裂解液+2U/ml肝素)；置于37℃、5％ CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，加入新鲜培养基；每隔2～3d进行全量换液；待细胞长至80％融合时，2×103/cm2传代培养。
(2)LLDT-8预处理MSC：
预处理的方式同实施例1的步骤(2)，区别在于：
将实施例1中的雷公藤甲素更换为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(LLDT-8，C20H24O7，MW＝376.39)，溶于DMSO中作为储备液，储存于-30℃备用；
LLDT-8浓度为：5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml；
预处理时间为48小时。
(3)LLDT-8处理MSC对肿瘤细胞增殖的体外实验
实验方法同实施例1中的步骤(3)。
体外细胞试验结果表明，将不同浓度LLDT-8处理72小时的MSC(1.0×105个)与悬浮生长人白血病细胞K562(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，5ng/ml LLDT-8处理MSC对K562细胞增殖没有影响(表3)，但是在10ng/ml LLDT-8和20ng/ml LLDT-8处理MSC抑制K562细胞的增殖。
将不同浓度LLDT-8处理72小时的MSC(1.0×105个)与贴壁生长人结肠癌细胞Colo-205(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，5ng/ml LLDT-8处理MSC对Colo-205细胞增殖没有影响，但是在50ng/ml LLDT-8和100ng/ml LLDT-8处理MSC抑制K562细胞的增殖(表3)。
表3、LLDT-8处理MSC对K562或者Colo-205细胞增殖指数PI的影响(x±s)
注：PI≤0.80，表示抑制肿瘤细胞增殖；PI≥1.20，表示促进肿瘤细胞增殖；0.80<PI<1.20，表示对肿瘤细胞增殖没有影响。
从上面的结果可以看出：MSC可以促进人白血病细胞K562和人结肠癌Colo-205细胞的增殖，即MSC具有促瘤性。5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml LLDT-8处理MSC 48小时后，使得MSC失去促瘤性。且在50ng/ml和100ng/ml LLDT-8处理MSC后，具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
(4)LLDT-8处理MSC对肿瘤小鼠的体内促瘤实验：
实验方法同实施例1中的步骤(4)。
结果可见：WiDr肿瘤模型中第35天，单独MSC组的Vt值高于对照组(P<0.05，表4)，且T/C﹪值>140％；说明脂肪来源MSC对WiDr肿瘤的生长有促进作用。5ng/ml LLDT-8+MSC实验组、50ng/ml LLDT-8+MSC实验组和100ng/ml LLDT-8+MSC实验组的Vt值均低于对照组(P<0.05或者P<0.01，表4)，且50ng/ml LLDT-8+MSC实验组和100ng/ml LLDT-8+MSC实验组的T/C﹪值<40％。
结果可见：Raji模型肿瘤中第28天，单独MSC组的Vt值高于对照组(P<0.05，表4)，且T/C﹪值>140％；说明脂肪来源MSC对Raji肿瘤的生长有显著促进作用。5ng/ml LLDT-8+MSC实验组、50ng/ml LLDT-8+MSC实验组和100ng/ml LLDT-8+MSC实验组的Vt值均低于对照组(P<0.05或者P<0.01，表4)，且50ng/ml LLDT-8+MSC实验组和100ng/ml LLDT-8+MSC实验组的T/C﹪值<40％。
表4、LLDT-8处理MSC对WiDr或者Raji模型肿瘤体积Vt的影响(mm3，x±s)
注：与对照组比较，*P<0.05。
根据国家食品药品监督管理总局药品审评中心发布《细胞毒类抗肿瘤药物非临床评价的指导原则》的判断标准，判定5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml LLDT-8处理MSC后对WiDr和Raji肿瘤的生长均没有促进作用，且在50ng/ml和100ng/ml LLDT-8处理MSC后，使得MSC具有了抑制肿瘤生长的作用。
实施例3
(1)将实施例1中的人脐带来源MSC更换为人骨髓来源MSC，骨髓来源MSC的分离、培养操作如下：
供者排除先天性遗传病及传染病史，且签署知情同意书。供者没有检出人源性特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)、梅毒螺旋体，且6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的检查合格。由经住院医师规范化培训合格的医师行骨髓穿刺术，采取避免骨髓稀释的措施，采集骨髓至含抗凝剂的针管内，即时转移至无菌采集瓶中保存。人骨髓液样本，用无菌磷酸盐缓冲液稀释后，用Ficoll分离液以密度梯度离心法分离单个核细胞。接种至人间充质干细胞无血清培养基(MSC SFM；货号:A1067501)；置于37℃、5％ CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，加入新鲜培养基；每隔2～3d进行全量换液；待细胞长至80％融合时，2×103/cm2传代培养。
(2)CEL预处理MSC：
预处理的方式同实施例1的步骤(2)，区别在于：
将实施例1中的雷公藤甲素更换为雷公藤红素(Celastrol,CEL)；
CEL浓度为：15ng/ml、150ng/ml和1500ng/ml；
预处理时间为24小时。
(3)CEL处理MSC对肿瘤细胞增殖的体外实验
实验方法同实施例1中的步骤(3)。
体外细胞试验结果表明，将不同浓度CEL处理24小时的MSC(1.0×105个)与悬浮生长人白血病细胞K562(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，不同浓度CEL处理MSC对K562细胞增殖没有影响(表5)。将不同浓度CEL处理24小时的MSC(1.0×105个)与贴壁生长人结肠癌细胞Colo-205(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，不同浓度CEL处理MSC对Colo-205细胞增殖没有影响(表5)。
表5、CEL处理MSC对K562或者Colo-205细胞增殖指数PI的影响(x±s)
| 组别 | K562 | Colo-205 |
| MSC实验组 | 1.75±0.42 | 1.64±0.51 |
| 15ng/ml CEL+MSC实验组 | 1.10±0.26 | 1.11±0.24 |
| 150ng/ml CEL+MSC实验组 | 1.08±0.41 | 1.06±0.20 |
| 1500ng/ml CEL+MSC实验组 | 0.88±0.12 | 0.82±0.18 |
注：PI≤0.80，表示抑制肿瘤细胞增殖；PI≥0.80，表示促进肿瘤细胞增殖；0.80<PI<1.20，表示对肿瘤细胞增殖不受影响。
从上面的结果可以看出：MSC可以促进人白血病细胞K562和人结肠癌Colo-205细胞的增殖，即MSC具有促瘤性。15ng/ml、150ng/ml和1500ng/ml CEL处理MSC 24小时后，使得MSC失去促瘤性。
(4)CEL处理MSC对肿瘤小鼠的体内促瘤实验：
实验方法同实施例1中的步骤(4)。
结果可见：WiDr肿瘤模型中第35天，单独MSC组的Vt值显著高于对照组(P<0.01，表6)，且T/C％值>140％；说明骨髓来源MSC对WiDr肿瘤的生长有显著促进作用。15ng/ml CEL+MSC实验组的Vt值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，表6)。150ng/ml CEL+MSC实验组和1500ng/ml CEL+MSC实验组的Vt值低于对照组(P<0.05，表6)，但T/C％值>40％。
结果可见：Raji模型肿瘤中第28天，单独MSC组的Vt值显著高于对照组(P<0.01，表6)，且T/C﹪值>140％；说明骨髓来源MSC对Raji肿瘤的生长有显著促进作用。15ng/ml CEL+MSC实验组和150ng/ml CEL+MSC实验组的Vt值与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，表6)。1500ng/ml CEL+MSC实验组的Vt值低于对照组(P<0.05，表6)，但T/C％值>40％。
表6、CEL处理MSC对WiDr或者Raji模型肿瘤体积Vt的影响(mm3，x±s)
| 组别 | WiDr(35天) | Raji(28天) |
| 对照组 | 1105.5±264.8 | 1148.6±225.7 |
| MSC实验组 | 1593.4±277.4** | 1866.4±276.7** |
| 15ng/ml CEL+MSC实验组 | 1152.6±208.8 | 1227.3±293.5 |
| 150ng/ml CEL+MSC实验组 | 942.4±114.7 | 1054.2±168.7 |
| 1500ng/ml CEL+MSC实验组 | 821.5±66.2* | 712.7±58.2* |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
根据国家食品药品监督管理总局药品审评中心发布《细胞毒类抗肿瘤药物非临床评价的指导原则》的判断标准，判定15ng/ml、150ng/ml和1500ng/ml CEL处理MSC后对WiDr和Raji肿瘤的生长均没有促进作用。
实施例4
(1)将实施例3中的人骨髓来源MSC更换为人牙髓来源MSC，牙髓来源MSC的分离、培养操作如下：
供者排除先天性遗传病及传染病史，且签署知情同意书。供者没有检出人源性特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)、梅毒螺旋体，且6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的检查合格。收集没有牙体和牙髓病变、自然脱落的乳牙，置于无菌采集瓶中，加入样本保存液予以全部浸没保存。牙齿样本，完整剥离牙髓，加入0.1％胶原酶，37℃消化30min；200目细胞筛过滤，收集有核细胞。接种至人间充质干细胞无血清培养基(MSC SFM；货号:A1067501)；置于37℃、5％ CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，加入新鲜培养基；每隔2～3d进行全量换液；待细胞长至80％融合时，2×103/cm2传代培养。
(2)雷公藤红素丙酯预处理MSC：
预处理的方式同实施例3的步骤(2)，区别在于：
将实施例3中的雷公藤红素更换为雷公藤红素丙酯，将雷公藤红素的28位羟基换为－O(CH2)2CH3，得到雷公藤红素丙酯；
雷公藤红素丙酯浓度为：15ng/ml、150ng/ml和1500ng/ml；
预处理时间为96小时。
(3)雷公藤红素丙酯处理MSC对肿瘤细胞增殖的体外实验
实验方法同实施例3中的步骤(3)。
体外细胞试验结果表明，将不同浓度雷公藤红素丙酯处理96小时的MSC(1.0×105个)与悬浮生长人白血病细胞K562(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，15ng/ml雷公藤红素丙酯处理MSC对K562细胞增殖没有影响，但是150ng/ml雷公藤红素丙酯和1500ng/ml雷公藤红素丙酯抑制K562细胞的增殖(表7)。将不同浓度雷公藤红素丙酯处理96小时的MSC(1.0×105个)与贴壁生长人结肠癌细胞Colo-205(1.0×105个)共培养，即其相应细胞比例为1:1时，15ng/ml雷公藤红素丙酯处理MSC对Colo-205细胞增殖没有影响，但是150ng/ml雷公藤红素丙酯和1500ng/ml雷公藤红素丙酯抑制Colo-205细胞的增殖(表7)。
表7、雷公藤红素丙酯处理MSC对K562或者Colo-205细胞增殖指数PI的影响(x±s)
注：PI≤0.80，表示抑制肿瘤细胞增殖；PI≥0.80，表示促进肿瘤细胞增殖；0.80<PI<1.20，表示对肿瘤细胞增殖不受影响。
从上面的结果可以看出：MSC可以促进人白血病细胞K562和人结肠癌Colo-205细胞的增殖，即MSC具有促瘤性。15ng/ml、150ng/ml和1500ng/ml雷公藤红素丙酯处理MSC 96小时后，使得MSC失去促瘤性。且在150ng/ml和1500ng/ml雷公藤红素丙酯处理MSC使得具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
(4)雷公藤红素丙酯处理MSC对肿瘤小鼠的体内促瘤实验：
实验方法同实施例3中的步骤(4)。
结果可见：WiDr肿瘤模型中第35天，单独MSC组的Vt值高于对照组(P<0.05，表8)，且T/C﹪值>140％；说明MSC对WiDr肿瘤的生长有促进作用。150ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组、1500ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组和1500ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组的Vt值均低于对照组(P<0.05或者P<0.01，表8)，且1500ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组的T/C﹪值<40％。
结果可见：Raji模型肿瘤中第28天，单独MSC组的Vt值高于对照组(P<0.05，表8)，且T/C﹪值>140％；说明MSC对Raji肿瘤的生长有显著促进作用。150ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组和1500ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组的Vt值均低于对照组(P<0.05或者P<0.01，表8)，且150ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组和1500ng/ml雷公藤红素丙酯+MSC实验组的T/C﹪值<40％。
表8、雷公藤红素丙酯处理MSC对WiDr或者Raji肿瘤模型Vt的影响(mm3，x±s)
注：与对照组比较，*P<0.05。
根据国家食品药品监督管理总局药品审评中心发布《细胞毒类抗肿瘤药物非临床评价的指导原则》的判断标准，判定15ng/ml、150ng/ml和1500ng/ml雷公藤红素丙酯处理MSC后对WiDr和Raji肿瘤的生长均没有促进作用，且在150ng/ml和1500ng/ml雷公藤红素丙酯处理MSC后，使得MSC具有了抑制肿瘤生长的作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.雷公藤单体在制备用于抑制间充质干细胞的促瘤性的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述雷公藤单体包括：雷公藤甲素、(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇、雷公藤红素和雷公藤红素丙酯中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞的促瘤性包括：间充质干细胞对白血病、结肠肿瘤和淋巴瘤中任意一种或多种肿瘤的促瘤性；
可选地，所述结肠肿瘤包括：结肠良性肿瘤和结肠恶性肿瘤中的任意一种或两种。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞的来源选自：脐带、胎盘、骨髓、牙髓、脂肪、羊膜和子宫内膜中的任意一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品的类型包括：试剂或试剂盒。
6.雷公藤单体在抑制间充质干细胞的促瘤性中的应用，所述雷公藤单体为权利要求1～5任一项中所述的雷公藤单体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞的来源选自：脐带、胎盘、骨髓、牙髓、脂肪、羊膜和子宫内膜中的任意一种或多种；
可选地，所述间充质干细胞的促瘤性包括：间充质干细胞对白血病、结肠肿瘤和淋巴瘤中任意一种或多种肿瘤的促瘤性。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述抑制间充质干细胞的促瘤性的方法包括：将雷公藤单体与间充质干细胞共培养；
可选地，所述雷公藤单体的作用浓度为：1～2000ng/ml；
可选地，当雷公藤单体为雷公藤甲素或(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇时，雷公藤单体的作用浓度为：1～200ng/ml；
可选地，当雷公藤单体为雷公藤红素或雷公藤红素丙酯时，雷公藤单体的作用浓度为：100～2000ng/ml。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述共培养的时间为1min～100h；
可选地，当雷公藤单体为雷公藤甲素时，所述共培养的时间为1min～60min；
可选地，当雷公藤单体为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇时，所述共培养的时间为24h～72h；
可选地，当雷公藤单体为雷公藤红素时，所述共培养的时间为12h～48h；
可选地，当雷公藤单体为雷公藤红素丙酯时，所述共培养的时间为72～100h；
可选地，所述共培养的温度为36～38℃。
10.雷公藤单体在制备用于治疗或辅助治疗目标肿瘤的产品中的应用，其特征在于，所述雷公藤单体为权利要求1～5任一项所述的雷公藤单体，所述目标肿瘤包括白血病、结肠肿瘤和淋巴瘤中任意一种或多种。
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Citations (3)
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| 朱大诚 等: "雷公藤甲素抗肿瘤机制的研究", 中华中医药学刊, vol. 40, no. 12, 31 December 2022 (2022-12-31), pages 8 - 12 * |
| 李建民 等: "雷公藤甲素介导线粒体凋亡途径抗肿瘤研究进展", 医学综述, vol. 26, no. 12, 30 June 2020 (2020-06-30), pages 2354 - 2359 * |
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