CN116602944A - 益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用，属于医药技术领域。益智酮甲和益智醇均具有降低一氧化氮(NO)含量、炎症因子(PEG2、TNF‑α、IL‑1β和IL‑6)含量、炎症相关的酶(iNOS和COX‑2)的mRNA的表达量以及有效减低MAPK信号通路蛋白(ERK、JNK和p38)的磷酸化的表达量的作用，能有效地减轻了由LPS诱导产生的细胞炎症，且益智醇的作用效果更佳。本发明不仅为预防或辅助治疗炎症提供了新的手段，而且提高了益智仁的药用开发价值，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用。
背景技术
炎症是血管系统的活体组织对外界致炎因子(生物性因子、化学性因子、物理性因子等)所发生的防御反应。长期的慢性炎症水平或者炎症调控不当时会造成人体内免疫系统的异常，进而导致多种疾病的发生，因此抑制体内慢性炎症已成为预防多种疾病关键途径之一。
目前用于抗炎的药物主要有甾体类和非甾体类，甾体类抗炎药物主要是糖皮质激素类，包括地塞米松、氢化可的松等，对许多炎症具有良好的效果，但也伴随着如肌肉萎缩，伤口难愈合等明显的副作用，而且长期使用会有耐药性，代谢紊乱等不良问题，因此在临床上只有在极特别情况下才会使用。而常用的非甾体类抗炎药物有阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、布洛芬等，可通过抑制前列腺素合成、减少缓激肽等作用发挥较好的抗炎作用。但是其副作用也较为显著，长期使用会使胃肠道受到损伤，并引发肝损伤、肾损伤等一系列不良反应。可见，这两类药物对炎症确实有一定的疗效，但长期使用副作用大，因此亟需研发有效、低毒、安全的炎症预防或治疗的功能性产品。
益智仁是我国的“四大南药之一”，也是我国卫健委首批公布的药食同源中药之一。作为中药，临床上主要用于治疗肾虚遗尿、小便频数、腹中冷痛等症状。而作为食品，益智仁具有开胃、健脾、增加食欲、帮助消化等功效，且具有较高的安全性。现代药理研究也表明，除传统的功效外，益智仁还具有神经保护、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多方面药理活性，因此其在食品、保健品等领域具有很高的开发利用价值和广泛的应用前景。目前，国内外学者已对益智仁的化学成分进行深入研究，发现益智仁含有多种活性成分，如萜类、甾醇类、黄酮类、二苯基庚烷类等。其中，二苯基庚烷类化合物是一类具有1,7-二苯基庚烷母核的天然化合物的总称，其结构可分为线性二苯基
庚烷类化合物和环状二苯基庚烷类化合物，目前确立的天然的线性二苯基庚烷类化合物有67种。益智酮甲(YakuchinoneA)和益智醇(Oxyphyllacinol)均属于线性二苯基庚烷类化合物，然而目前对益智酮甲和益智醇在预防或治疗炎症方面的研究未见报导，且这两种物质的抗炎活性也未见研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用，通过与益智酮甲的比较，益智醇具有更高的抗炎活性，丰富了抗炎治疗策略，同时扩展了益智醇在医药领域的用途。
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用。
优选的，所述炎症为诱导型炎症；
所述诱导型炎症为脂多糖诱导的炎症。
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备降低细胞中一氧化氮含量或炎症因子含量的制剂中的应用。
优选的，所述炎症因子包括以下至少一种：前列腺素E2、肿瘤坏死因子、白介素-1β和白介素-6。
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备抑制细胞中环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶活性的制剂中的应用。
优选的，所述抑制细胞中环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶活性的方法包括下调环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶的mRNA的表达量。
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备抑制细胞中MAPK信号通路蛋白的制剂中的应用，所述抑制MAPK信号通路蛋白的方法包括ERK、JNK和p38这三种蛋白的磷酸化(p-ERK、p-JNK和p-p38)表达量。
优选的，所述细胞包括RAW264.7巨噬细胞。
优选的，所述益智醇具有如式I所示的结构；
所述益智酮甲具有如式II所示的结构；
本发明提供了一种预防和/或治疗炎症的药物，包括益智醇、益智酮甲和药学上可接受的辅料。
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用。本发明首次公开益智酮甲和益智醇具有抗炎活性，且揭示两者的抗炎机制。本发明通过检测益智酮甲和益智酮作用于LPS诱导的巨噬细胞后细胞中一氧化氮、炎症因子与炎症相关酶的mRNA表达量，来判断抗炎活性的效果，结果表明益智酮甲和益智醇都能够有效地降低一氧化氮含量、降低炎症因子的含量以及下调与炎症相关酶对应的基因的mRNA表达量。此外，本发明通过蛋白质印迹法(Western Blot)探索益智酮甲和益智醇的抗炎机制，结果表明这两种物质均能有效地降低MAPK信号通路蛋白(ERK、JNK和p38)这三种蛋白的磷酸化(p-ERK、p-JNK和p-p38)表达量，从而可得出益智酮甲和益智醇的抗炎作用效果是通过抑制MAPK信号通路而起作用。可见，炎症指标的变化结果证明，益智醇或益智酮甲具有良好的抗炎活性，不仅为预防或辅助治疗炎症提供了新的手段，也提高了益智仁的药用开发价值，具有重要意义。
附图说明
图1是不同浓度的益智酮甲对RAW264.7巨噬细胞的活力影响结果；
图2是不同浓度的益智醇对RAW264.7巨噬细胞的活力影响结果；
图3是益智酮甲和益智醇对NO含量的影响；
图4-图7是益智酮甲和益智醇对炎症因子(PEG2、TNF-α、IL-1β和IL-6)的影响结果；
图8是益智酮甲和益智醇减少与炎症相关的酶iNOS的mRNA的表达结果；
图9是益智酮甲和益智醇减少与炎症相关的酶COX-2的mRNA的表达结果。
图10是益智酮甲和益智醇降低MAPK信号通路蛋白(ERK、JNK和p38)的磷酸化(p-ERK、p-JNK和p-p38)表达量的结果。
具体实施方式
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用。
在本发明中，所述益智酮甲和益智醇均属于二苯基庚烷类化合物，是存在于植物益智的成熟果实益智仁中的天然活性物质。所述益智醇优选具有如式I所示的结构；
所述益智酮甲优选具有如式II所示的结构；
本发明对益智酮甲和益智醇没有特殊限制，采用本领域所熟知的益智酮甲和益智醇的获得途径即可。在本发明实施例中，所述益智酮甲和益智醇购自济南名可生物科技有限公司，纯度99％以上。
在本发明中，所述炎症优选为诱导型炎症。所述诱导型炎症为脂多糖(LPS)诱导的炎症。
在本发明中，通过检测表征细胞炎症水平的重要指标(一氧化氮含量、炎症因子的含量和炎症相关的酶的表达量)的变化情况，本发明得到益智酮甲和益智醇都能通过降低一氧化氮含量(NO)、降低炎症因子(PEG2、TNF-α、IL-1β和IL-6)的含量和下调炎症相关的酶(iNOS和COX-2)的mRNA的表达量，有效地减轻了由LPS诱导产生的细胞炎症。通过检测MAPK抗炎机制路线相关蛋白的表达情况，本发明得到益智酮甲和益智醇均能降低MAPK信号通路蛋白(ERK、JNK和p38)的磷酸化水平。因此，益智酮甲和益智醇可用以预防或辅助治疗诱发性炎症。此外，益智醇作用浓度为5μM时降低NO含量的作用效果与益智酮甲作用浓度为7.5μM没有显著性差异，6.25μM的益智醇降低炎症因子含量、炎症相关酶的mRNA表达量以及MAPK信号通路蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化的表达量的作用效果与12.5μM益智酮甲的作用效果相当，得到益智醇的抗炎作用效果更好的结论。
本发明提供了益智醇或益智酮甲在制备降低细胞中一氧化氮含量、炎症因子含量、环氧化酶-2、一氧化氮合酶活性和/或MAPK信号通路蛋白(ERK、JNK和p38)磷酸化的表达量的制剂中的应用。
在本发明中，所述炎症因子优选包括以下至少一种：前列腺素E2、肿瘤坏死因子、白介素-1β和白介素-6。所述抑制细胞中环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶活性的方法优选包括下调环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶的mRNA的表达量。所述抑制细胞中MAPK信号通路蛋白的方法优选包括降低ERK、JNK和p38这三种蛋白的磷酸化的表达量。所述细胞优选包括RAW264.7巨噬细胞。
在本发明中，益智醇或益智酮甲在降低细胞中一氧化氮含量、炎症因子含量、环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶的mRNA的表达量以及MAPK信号通路蛋白(ERK、JNK和p38)磷酸化的表达量方面均呈现浓度依赖性，高剂量作用降低效果更加明显。所述益智醇的作用浓度优选为1～10μM，更优选为3～6.5μM，进一步优选为5～6.25μM。所述益智酮甲的作用浓度优选为1～25μM，进一步优选为2～15μM，更优选为7.5～12.5μM。本发明对所述制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制备方法即可。
鉴于益智醇、益智酮甲均有具有抗炎活性和良好的细胞安全性，本发明提供了一种预防和/或治疗炎症的药物，包括益智醇、益智酮甲和药学上可接受的辅料。
本发明对所述辅料的种类没有特殊限制，根据本领域所熟知的药物的剂型选择辅料种类。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
益智酮甲(Yakuchinone A)和益智醇(Oxyphyllacinol)对巨噬细胞(RAW264.7)最佳浓度的筛选实验
1、具体操作如下：
将生长良好的RAW264.7细胞，接种于孔板中，铺板培养24h后，吸走旧培养基，按以下分组进行加样：
空白组：只加培养基；
Control组：正常细胞对照组；
益智酮甲剂量组(5组)：10、25、50、75和100μM；
益智醇剂量组(5组)：10、25、50、75和100μM；
加完样后，继续放在细胞培养箱里面培养24h后，吸去旧的培养基，用CCK-8试剂盒进行细胞活力检测。
实验结果：
如图1所示：益智酮甲在0～10μM浓度范围对细胞没有明显毒性作用；在10～25μM浓度范围对细胞有较小的毒性作用；为了减小物质对细胞的影响，选择2.5、7.5和12.5μM进行后续实验。
如图2所示：益智醇在0～10μM浓度范围对细胞具有较小的毒性作用，最终选择3.75、5和6.25μM进行后续实验。
实施例2
益智醇和益智酮甲降低脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的巨噬细胞(RAW264.7)的NO含量。
1、具体操作如下：
将生长良好的RAW264.7细胞，接种于孔板中，铺板培养24h后，吸走旧培养基，其中本次实验采用的建模药物脂多糖(LPS)的浓度为(1μg/mL)，并按以下分组进行加样。
空白组：只加培养基；
Control组：正常细胞对照组；
炎症模型组：LPS(1μg/mL)；
益智酮甲低剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(2.5μM)；
益智酮甲中剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(7.5μM)；
益智酮甲高剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(12.5μM)；
益智醇低剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(3.75μM)；
益智醇中剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(5μM)；
益智醇高剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(6.25μM)
加样完成之后，继续放于培养箱内培养24h。培养结束后，用无菌管收集细胞培养上清。2000～3000rpm、4℃离心20分钟，仔细收集上清，用一氧化氮(NO)检测试剂盒检测上清液中亚硝酸盐(Nitrite)的量，从而得到NO的含量。
NO在炎症和免疫应答中起着关键的调节作用，NO能够影响炎症反应的进程，过量的NO诱导细胞因子产生、引发炎症反应及氧化应激损伤。NO含量是检测细胞炎症水平的一个重要指标。实验结束后，将各组NO检测结果进行对比。
2、实验结果：
NO含量结果如图3所示，细胞经LPS诱导产生炎症后，NO水平显著高于正常细胞组，说明成功诱导得到产生炎症反应的巨噬细胞。益智酮甲和益智醇的低中高剂量组相比于LPS诱导的炎症模型组，均能降低NO水平，尤其以高剂量的最为显著，且从图中也可以看出，益智醇作用浓度为5μM时降低NO含量的作用效果与益智酮甲作用浓度为7.5μM没有显著性差异，因此，结果表明益智酮甲和益智醇均可以改善巨噬细胞由LPS诱导所产生的炎症症状，出于效果和经济效益考虑，益智醇是更好的选择。
实施例3
益智酮甲和益智醇降低脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的巨噬细胞(RAW264.7)的炎症因子的含量。
1、具体操作如下：
将生长良好的RAW264.7细胞，接种于孔板中，铺板培养24h后，吸走旧培养基，按以下分组加样：
空白组:只加培养基；
Control组：正常细胞对照组；
炎症模型组：LPS(1μg/mL)；
益智酮甲低剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(2.5μM)；
益智酮甲中剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(7.5μM)；
益智酮甲高剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(12.5μM)；
益智醇低剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(3.75μM)；
益智醇中剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(5μM)；
益智醇高剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(6.25μM)；
加完对应药物之后，继续放于培养箱内培养24h。培养结束后，用无菌管收集细胞培养上清。2000～3000rpm、4℃离心20分钟，仔细收集上清，用ELISA试剂盒检测上清液的炎症因子，检测的炎症因子包括前列腺素E2(PEG2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)。
炎症反应释放多种促炎介质，其中包括炎症因子。炎症因子含量是检测细胞炎症水平的一个重要指标。实验结束后，将各组炎症因子检测结果进行对比。
2、实验结果：
ELISA结果如图4-图7所示，与Control正常细胞对照组相比，LPS诱导的炎症模型组的细胞经LPS诱导产生炎症后，炎症因子(PEG2、TNF-α、IL-1β和IL-6)水平显著高于正常细胞组，这说明本实验成功诱导得到具有炎症反应的巨噬细胞。益智酮甲和益智醇的低中高剂量组相比于LPS诱导的炎症模型组，以上四种炎症因子的含量分别均明显降低，且具有浓度依赖性。也可以很明显的看出，6.25μM的益智醇降低炎症因子的作用效果与12.5μM益智酮甲的作用效果相当。因此，结果表明益智酮甲和益智醇均可以改善巨噬细胞由LPS诱导所产生的炎症反应，且益智醇的抗炎作用效果更好。
实施例4
益智酮甲和益智醇减少与炎症相关的酶(iNOS和COX-2)的mRNA的表达量。
具体操作如下：
将生长良好的RAW264.7细胞，接种于孔板中，铺板培养24h后，吸走旧培养基，按以下分组加样：
Control组：正常细胞对照组；
炎症模型组：LPS(1μg/mL)；
益智酮甲低剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(2.5μM)；
益智酮甲中剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(7.5μM)；
益智酮甲高剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(12.5μM)；
益智醇低剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(3.75μM)；
益智醇中剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(5μM)；
益智醇高剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(6.25μM)；
加完对应药物之后，继续放于培养箱内培养24h。培养结束后，提取各组细胞的RNA用于qPCR检测。
qPCR检测方法：
1.原理：先用随机引物将RNA反转录成cDNA，然后设计特异性的引物和SYBR greenI荧光染料进行荧光定量PCR检测。SYBR Green I是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料，其与双链DNA结合后，荧光大大增强。随着扩增循环数的增加，荧光信号不断积累，因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
2.引物设计
根据NCBI所公布的基因登录号设计内参和目的基因引物见表1。
表1qPCR检测用引物
3.RNA的提取
1)对于细胞样本，直接加入1ml的RNAiso，用枪头吹打混匀。
2)向上述步骤的匀浆裂解液中加入氯仿(样品液+RNAiso体积量的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5分钟。12,000×g、4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机层。
3)吸取上清液移至新的离心管中(切勿吸出白色中间层)。向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。12,000×g、4℃离心10分钟，试管底部会出现RNA沉淀。
4)弃上清，加入1ml的75％乙醇，使用Vortex振荡清洗沉淀后，7500×g、4℃离心5分钟，弃上清。
5)室温干燥沉淀。沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。
6)用超微量分光光度计测定RNA的质量和浓度。
4.荧光定量PCR步骤
4.1.cDNA合成反应
将RNA按照下列体系进行反转录，体系见表2。
表2反转录反应体系
| 成分 | 成分 |
| 5×gDNA digester Buffer | 2μL |
| 总RNA | 10pg-5μg* |
| mRNA | 10pg-500ng* |
| 无RNase的ddH2O | 补充至15μL |
反转录体系在42℃下反应2min。得到的反应液进行第二链合成，反应体系见表3。
表3第二链合成反应体系
反应条件见表4。反应产物在-20℃保存。
表4第二链合成反应条件
2.qPCR扩增
(1)反应体系见表5。
表5 qPCR反应体系
| Hieff UNICON Univeral Blue Qpcr SYBR Green Master Mix | 5μL |
| 正向引物和反向引物(各10Um) | 0.4/0.4μL |
| 模板DNA/cDNA | 1μL |
| 无RNase的dH2O | 补充至10μL |
(2)反应条件见表6。
表6qPCR反应条件
qPCR扩增结果分析方法
试验结束后，得到qPCR扩增图、溶解曲线图、标准曲线图和相关读数，qPCR数据分析采用2-ΔΔCt法进行处理分析。
正常情况下，细胞中的环氧化酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的含量较低。当LPS刺激细胞，会引起iNOS和COX-2过量表达。iNOS升高，导致促炎介质NO升高，过量的NO诱导细胞因子产生、引发炎症反应及氧化应激损伤。COX-2过量表达会促进PGE2的合成，促进炎症反应的发生。因此，降低环氧化酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的含量，有助于减轻炎症症状的产生，因此这两种酶的mRNA的表达量检测也是一个很重要的指标。实验结束后，将各组检测结果进行对比。
2、实验结果
如图8和图9所示，与正常细胞对照组比较，LPS诱导的炎症模型组的COX-2和iNOS的mRNA相对表达量增加；与LPS诱导的炎症模型组比较，益智酮甲和益智醇组的COX-2和iNOS的mRNA的表达量均降低，且具有一定的浓度依赖性。由上述结果可知，6.25μM的益智醇在降低与炎症相关酶的mRNA表达量的作用效果与12.5μM益智酮甲的作用效果相当。因此，结果表明益智酮甲和益智醇均可以减少与炎症相关的酶(iNOS和COX-2)的mRNA的表达而发挥抗炎作用，且益智醇的作用效果更佳。
实施例5
益智酮甲和益智醇抑制MAPK信号通路蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化(p-ERK、p-JNK和p-p38)的表达量而发挥抗炎作用,内参蛋白选择β-actin。
1、具体操作如下：
将生长良好的RAW264.7细胞，接种于孔板中，铺板培养24h后，吸走旧培养基，按以下分组加样：
Control组：正常细胞对照组；
炎症模型组：LPS(1μg/mL)；
益智酮甲低剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(2.5μM)；
益智酮甲中剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(7.5μM)；
益智酮甲高剂量组：LPS(1μg/mL)+YakuchinoneA(12.5μM)；
益智醇低剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(3.75μM)；
益智醇中剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(5μM)；
益智醇高剂量组：LPS(1μg/mL)+Oxyphyllacinol(6.25μM)；
加完对应药物之后，放于培养箱内培养24h。培养结束后，进行Western Blot检测。
2、Western Blot基本原理
蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用辣根过氧化物酶标记的二抗。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗起免疫反应，再与辣根过氧化物酶或同位素标记的二抗起免疫反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
3、Western Blot操作步骤
(1)总蛋白提取
通常每106个细胞加0.1mL细胞裂解液。冰上放置数分钟，用枪头轻轻吹打，使细胞充分裂解。再轻轻倾斜培养皿使裂解产物流向瓶皿的一边或一角，然后将其转移到1.5mL离心管，剧烈振荡30s。12000rpm，4℃离心15min，吸取上清，即可进行后续的电泳、Western或免疫沉淀操作。
(2)利用BCA试剂盒测定各组细胞蛋白浓度。
(3)SDS－PAGE电泳:电泳时加样顺序如下：LPS+Oxyphyllacinol(6.25μM)；LPS+Oxyphyllacinol(5μM)；LPS+Oxyphyllacinol(3.75μM)；正常细胞对照组；LPS(1μg/mL)炎症模型组；LPS+YakuchinoneA(2.5μM)；LPS+YakuchinoneA(7.5μM)；LPS+YakuchinoneA(12.5μM)。80V跑过浓缩胶后转换电压至120V，待溴酚蓝跑至胶板底部刚好没有跑出即可。
(4)电泳结束后，进行转膜和封闭，最后用化学发光成像系统进行曝光拍摄Western Blot条带。
(5)用Image软件对WesternBlot条带进行分析，得到数据。
MAPK信号通路基于磷酸化的信号传导方式，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质及细胞应激等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号通路是一种三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK，这三种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。MAPK通路3个主要分支是ERK、JNK和p38，其中ERK主要参与调控细胞增值分化等；JNK主要参与细胞的应激反应；p38主要介导炎症、凋亡等。通过检测MAPK信号通路这三种蛋白的磷酸化表达量，可以揭示了益智酮甲和益智醇调控炎症的作用机理。
4、实验结果
如图10所示，与正常细胞对照组比较，LPS诱导的炎症模型组的p-ERK/β-actin、p-JNK/β-actin和p-p38/β-actin表达量增加；与LPS诱导的炎症模型组比较，益智酮甲和益智醇组的p-ERK/β-actin、p-JNK/β-actin和p-p38/β-actin相对表达量均降低，且具有一定的浓度依赖性。由上述结果可知，6.25μM的益智醇在降低p-ERK/β-actin、p-JNK/β-actin和p-p38/β-actin表达量的作用效果与12.5μM益智酮甲的作用效果相当。因此，结果表明益智酮甲和益智醇均可以减少MAPK信号通路蛋白ERK、JNK和p38磷酸化(p-ERK、p-JNK和p-p38)的表达量而发挥抗炎作用，且益智醇的作用效果更佳。
综上所述，益智酮甲和益智醇分别都能通过降低一氧化氮含量(NO)、炎症因子(PEG2、TNF-α、IL-1β和IL-6)的含量、炎症相关酶(iNOS和COX-2)的mRNA的表达量以及抑制MAPK信号通路蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化表达量，来减轻了由LPS诱导产生的细胞炎症。因此，益智酮甲和益智醇可用以预防或辅助治疗诱发性炎症，可应用于功能性食品、保健品和药品等产品中。但在考虑药物作用效果和经济效益的情况下，益智醇优于益智酮甲。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.益智醇或益智酮甲在制备预防或辅助治疗炎症的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述炎症为诱导型炎症；
所述诱导型炎症为脂多糖诱导的炎症。
3.益智醇或益智酮甲在制备降低细胞中一氧化氮含量或炎症因子含量的制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述炎症因子包括以下至少一种：前列腺素E2、肿瘤坏死因子、白介素-1β和白介素-6。
5.益智醇或益智酮甲在制备抑制细胞中环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶活性的制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述抑制细胞中环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶活性的方法包括下调环氧化酶-2和/或一氧化氮合酶的mRNA的表达量。
7.益智醇或益智酮甲在制备降低细胞中MAPK信号通路蛋白的表达量的制剂中的应用，所述降低MAPK信号通路蛋白的表达量的方法包括降低ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化的表达量。
8.根据权利要求3～7中任意一项所述应用，其特征在于，所述细胞包括RAW264.7巨噬细胞。
9.根据权利要求1～7中任意一项所述应用，其特征在于，所述益智醇具有如式I所示的结构；
所述益智酮甲具有如式II所示的结构；
10.一种预防和/或治疗炎症的药物，其特征在于，包括益智醇、益智酮甲和药学上可接受的辅料。
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