CN116590417A - Dhx33蛋白作为子宫内膜癌诊断标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗诊断技术领域，提供了DHX33蛋白作为子宫内膜癌诊断标志物的应用。本发明公开了检测DHX33蛋白含量或活性的系统或检测DHX33蛋白基因含量或表达量的系统在制备筛查或辅助诊断子宫内膜癌产品中的应用。本发明通过试验证明DHX33蛋白在子宫内膜癌组织样本中高表达，可作为子宫内膜癌的诊断标志物。
Description
技术领域
本发明涉及医疗诊断技术领域，具体地提供了DHX33蛋白作为子宫内膜癌诊断标志物的应用。
背景技术
子宫内膜癌是子宫内膜上的恶性肿瘤，通常发病于绝经期妇女，是目前最常见的妇科三大恶性肿瘤之一。在目前的妇科恶性肿瘤中，子宫内膜癌排在第三，位列卵巢癌和宫颈癌之后，占女性全身恶性肿瘤7％，占女性生殖系统恶性肿瘤20％-30％，近年发病率在世界范围内呈上升趋势，是死亡率较高的恶性肿瘤。
当前，子宫内膜癌尚无特异敏感的标志物。对于有子宫外病变的患者，部分可出现CA125、HE4异常，但炎症或放射损伤等因素也会引起CA125异常升高，而有些患者(如阴道孤立转移)的CA125可能并不升高，所以在缺乏具体临床表现时，CA125并不能准确预测肿瘤生长情况。HE4也缺乏特异性，相比之下，其对于卵巢癌表现的敏感度更高，因此仅对于子宫内膜癌诊断及术后病情监测有参考价值。
临床上，结合患者临床表现和辅助检查，当高度怀疑子宫内膜病变时，通常会进行子宫内膜癌活检以明确诊断。而活检方法主要为诊断性刮宫，即分别从子宫颈管和宫腔等可疑部位获得组织以便了解宫腔和子宫颈管的情况，排除子宫外病变。对子宫外转移活体组织或手术切除组织样本进行病理学检查是确诊子宫内膜癌的“金标准”，通过免疫组织化学检查，能详细得知肿瘤的病理学类型及分化程度等特征。
目前，手术是子宫内膜癌的主要治疗方式，或根据有无高危因素选择放疗和(或)化疗进行辅助治疗。然而，由于肿瘤的侵袭性和易转移等特征，肿瘤细胞向正常组织侵润，累犯正常器官，早期诊断就显得尤为重要。因此，开发和探索临床子宫内膜癌早期诊断的肿瘤标志物，能让子宫内膜癌患者大大提高治疗效果，对于临床子宫内膜癌的诊治具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供DHX33蛋白的新用途，具体而言，提供了DHX33蛋白在诊断或者辅助诊断子宫内膜癌中的应用。该应用具有操作简便、灵敏度高、结果可靠准确的特点。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明涉及DHX33蛋白在筛查或者辅助诊断子宫内膜癌中的应用。
本发明采用免疫组织化学技术，利用DHX33抗原抗体结合的高度特异性检测在子宫内膜癌组织、邻近正常组织及正常组织内DHX33蛋白的表达量是否存在显著性差异，从而发现在子宫内膜癌组织样本中，DHX33蛋白明显存在过量表达的现象。相比之下，子宫内膜癌旁良性组织样本和正常子宫内膜组织对照组组织样本中DHX33蛋白的表达水平较低，提示DHX33蛋白可能作为子宫内膜癌早期诊断的标志物。
第二方面，本发明涉及DHX33蛋白在制备筛查或辅助诊断子宫内膜癌的产品中的应用。
第三方面，本发明涉及检测DHX33蛋白含量或活性的系统或检测DHX33蛋白基因含量或表达量的系统在制备筛查或辅助诊断子宫内膜癌产品中的应用。
本发明首次公开了DHX33蛋白在子宫内膜癌中高度表达，并与肿瘤的恶化程度呈正相关。
在具体的实施方案中，所述检测DHX33蛋白含量或活性的系统包括检测DHX33蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器；
所述检测DHX33蛋白基因含量或表达量的系统包含检测DHX33蛋白基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。
在具体的实施方案中，所述检测DHX33蛋白含量或活性所需的试剂为特异性识别DHX33蛋白的蛋白或者多肽及其修饰物。
在具体的实施方案中，所述检测DHX33蛋白含量或活性所需的试剂为特异性识别DHX33蛋白的抗体或抗体片段。
在具体的实施方案中，检测DHX33蛋白基因含量或表达量所需的试剂包含扩增DHX33蛋白基因的或其片段的引物。
在具体的实施方案中，所述检测所采用的样本为来自受试者的组织，包括但不限于疑似子宫内膜癌患者的原发病理组织或者其转移性肿瘤组织，例如石蜡包埋病理组织、冰冻组织或者组织活检物等。
在具体的实施方案中，所述产品包括系统，所述系统包括试剂和/或仪器，所述试剂包括芯片、制剂或试剂盒。
在具体的实施方案中，所述试剂盒为ELISA试剂盒或免疫组化试剂盒等。
第四方面，本发明提供了一种子宫内膜癌筛查或辅助诊断产品，包含前文所述的检测DHX33蛋白含量或活性的系统或检测DHX33蛋白基因含量或表达量的系统。
其中，所述检测所采用的样本为来自受试者的组织，包括但不限于疑似子宫内膜癌患者的组织，例如患者的原发病理组织或者其转移性肿瘤组织，更具体如石蜡包埋病理组织、冰冻组织或者组织活检物等。
以DHX33蛋白作为标志物的系统在制备筛查或辅助诊断子宫内膜癌产品中的应用也属于本发明的保护范围。
第五方面，本发明还提供了一种筛查或辅助诊断子宫内膜癌的方法，包括：通过检测待测样本中DHX33蛋白的含量或表达量，根据所述含量或表达量进行诊断或辅助诊断。
其中，待测样本为来自受试者的组织，包括但不限于疑似子宫内膜癌患者的组织，例如如患者的原发病理组织或者其转移性肿瘤组织，更具体如石蜡包埋组织、冰冻组织或者组织活检物等。
第六方面，本发明提供了DHX33蛋白的抗体在制备筛查或辅助诊断子宫内膜癌的产品中的应用。
需要指出，文中的“DHX33”和“DHX33蛋白”可以互换使用。
本发明与现有技术相比具有明显的有益效果。借由上述技术方案，本发明至少具有下列有益技术效果：
本发明首次公开了DHX33蛋白在子宫内膜癌中高度表达，并与肿瘤的恶化程度呈正相关。
本发明的标志物DHX33蛋白，目前在小规模样本中即可证实适合作为子宫内膜癌的诊断标志物。
本发明证明了DHX33蛋白可作为新的子宫内膜癌标志物，为开发诊断或者辅助诊断子宫内膜癌的标志物产品提供新的手段。
附图说明
图1为人子宫内膜癌组织芯片样本一中10例代表性的子宫内膜癌组织的DHX33蛋白免疫组织化学分析结果。
图2为样本一代表性的10例与图1对应的癌旁正常组织免疫组化分析的DHX33蛋白表达情况。
图3为人子宫内膜癌组织芯片样本一的整体阵列平面图。
图4为人子宫内膜癌组织芯片样本一组织芯片完成DHX33蛋白免疫组织化学分析后的总体染色图，图中标记了瘤旁正常、肿瘤组织。
图5为代表性的样本一放大的子宫内膜癌组织的DHX33蛋白表达情况。
图6为代表性的样本一放大的一例与图5对应的子宫内膜癌患者癌旁正常组织的DHX33蛋白表达情况。
图7为子宫内膜癌组织芯片样本一中对正常组织和癌症组织统计分析比较的DHX33蛋白表达差异。
图8为用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析近30例子宫内膜癌组织及其对应的近30例癌旁正常组织中DHX33蛋白表达量作为诊断子宫内膜癌的特异性及敏感性尺度。
图9为代表性的10例人子宫内膜癌组织样本二中正常子宫内膜组织的DHX33蛋白免疫组织化学染色结果。
图10为子宫内膜癌组织芯片样本二中10例代表性的腺癌肿瘤样本的DHX33蛋白染色结果。
图11为子宫内膜癌组织芯片样本二整个组织芯片免疫组化后的宏观图，标记了肿瘤、正常组织。
图12为代表性的样本二放大的一例子宫内膜癌患者肿瘤组织的DHX33蛋白表达情况。
图13为代表性的样本二放大的一例子宫内膜正常组织的DHX33蛋白表达情况。
图14为子宫内膜癌组织芯片样本二中对肿瘤样本和正常子宫内膜组织中统计分析比较的DHX33蛋白表达差异。
图15为用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析子宫内膜癌组织芯片样本二中所有子宫内膜癌组织及正常组织中DHX33蛋白表达量，作为诊断子宫内膜癌的特异性及敏感性尺度。
图16为代表性的一例卵巢癌组织的DHX33蛋白表达情况。
图17为样本三人卵巢癌组织芯片病例位点的列阵排布图。
图18所示的ROC曲线表明卵巢癌与正常组织比较的DHX33蛋白表达无显著差异。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
下述实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
材料和方法
一、实施病例样本的收集
研究所用到的人子宫内膜癌组织芯片样本一来自上海芯超生物科技有限公司，组织芯片编号XT15-033，系手术中切除的子宫内膜癌组织，共含肿瘤组织34例(肿瘤I期17例，肿瘤II期6例，肿瘤III期9例，肿瘤IV期2例)，包含癌旁与原癌病理组织共60位点(癌体34位点，癌旁26位点)。获取的样本为封蜡组织芯片。
研究所用到的人子宫内膜癌样本二来自武汉天德生物科技有限公司，组织芯片编号ENC1021，系手术中切除的子宫内膜癌组织。整体组织芯片共102位点(正常组织5位点，未分化癌组织2位点，腺鳞癌组织4位点。腺癌组织91位点)。整体组织子芯片共含肿瘤组织95例(肿瘤I期16例，肿瘤I-II期22例，肿瘤II期23例，肿瘤II-III期9例，肿瘤III期21例，腺鳞癌4例)。获取的样本为封蜡组织芯片。
研究所用的样本三为人卵巢癌组织芯片，购买于上海曾予生物科技有限公司，组织芯片编号ZL-OVA961。共有96例组织位点，其中浆液性腺癌49例；交界性粘液性肿瘤伴粘膜内癌5例；鳞状细胞癌1例；内膜样癌14例；透明细胞癌9例；粘液性腺癌4例；胃癌卵巢转移3例；肠癌卵巢转移3例；正常卵巢8例。获取的样本为封蜡组织芯片。
二、方法
1.使用DHX33蛋白的抗体对组织芯片进行免疫组化分析
1)将组织芯片放在60℃干燥箱中烘烤1h使石蜡充分融化；
2)将组织切片放入脱蜡杯中，倒入环保脱蜡液浸没所有组织位点，在摇床中低速摇晃脱蜡1h；
3)分别加入100％、95％、75％、50％、25％的梯度乙醇浸泡，使组织芯片水化；
4)加入纯水浸泡10min，修复抗原；
5)加入Tris-EDTA浸泡，放入蒸锅中蒸40min，随后等待冷却至室温，目的是暴露抗原位点；
6)取出组织芯片擦干水分后放在保湿盒上，用免疫组化标记笔圈出组织位置，加入过氧化氢浸泡10min，以去除內源酶；
7)用5％FBS-PBS封闭液对组织芯片进行非特异性抗原位点封闭，室温孵育1h；
8)用5％FBS-PBS对DHX33蛋白的一抗anti-DHX33(Santa Cruz Biotechnology,Inc)进行1:20稀释，用稀释后的抗体覆盖组织芯片，再将组织芯片放回保湿盒上，置于4℃冰箱过夜；
9)次日将保湿盒从冰箱中取出，回收组织芯片上的抗体，用5％FBS-PBS洗涤组织芯片5次；
10)滴入鼠兔二抗覆盖组织芯片，湿盒内孵育30min；用PBS缓冲液将二抗洗去；
11)按1:50对DAB显色试剂进行稀释，滴加到组织芯片中，染色3min后用纯水洗净；
12)滴入苏木素染色液，染色2min，用PBS缓冲液清洗；
13)将组织芯片擦干，滴加胶水后，注意避免气泡使用盖玻片封片；
14)显微镜下观察，对每个组织位点捕获4倍视野和10倍视野各一张，对免疫组化的结果进行阳性分级。
上述实验方法中所使用的一抗为anti-DHX33，购买于基因生物技术国际贸易(上海)有限公司广州分公司代理的Santa Cruz Biotechnology,Inc公司产品；鼠兔二抗(MaxVision TM HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit(产品编号KIT-5010))购买于福州迈新生物技术开发有限公司；DAB显色试剂(DAKO EnVision)购自丹麦DAKO公司；环保脱蜡液购买于北京索莱宝科技有限公司。乙醇为AR级乙醇，购买于深圳铭科科技有限公司，使用时ddH2O进行梯度稀释。Tris(10mM)-EDTA(1mM)缓冲液(pH9.0)为实验室配制。3％H2O2从普通药店中购买。封闭液为深圳市瑞鑫生物科技有限公司购买的进口血清与PBS配制为5％FBS-PBS。苏木素HE染色试剂盒购买于北京索莱宝科技有限公司。
实施例1通过免疫组织化学分析DHX33蛋白在人子宫内膜癌组织中的表达
使用上述方法对人子宫内膜癌样本一进行免疫组化分析。
在实验条件及拍照条件一致的前提下，捕获已封片的组织芯片上每一位点的4倍照片，对每一位点评定阳性等级和得分。
评分原则：依据病理切片中DHX33蛋白染色强度和阳性表达占比评定阳性等级和得分。评分有两部分构成：DHX33蛋白表达强阳性为3分，蛋白表达中等为2分，DHX33蛋白表达弱阳性为1分；总体阳性比率占比大于50％为3分，阳性比率在25％-50％之间为2分，阳性比率小于25％为1分。总体评分为DHX33蛋白阳性得分与阳性比率得分之和。设定1-3分为阴性，4-6分为阳性。
结果如图1-6及表1所示，表1给出了样本一所有病例的肿瘤病人病理信息、肿瘤详情以及DHX33蛋白阳性表达等级及得分统计表：人子宫内膜癌组织芯片样本一中临床I期的肿瘤组织及配对癌旁共34位点，有11例得分为4分，1例得分为5分，7例得分为6分(表1)。总体阳性表达率高达56％。具体而言，人子宫内膜癌组织芯片样本一中临床III、IV期的肿瘤组织及配对癌旁共11例，其中DHX33蛋白表达阳性等级为4分的有4例，5分的有1例，6分的有4例，DHX33蛋白阳性比率升高至82％。以上结果表明DHX33蛋白表达与肿瘤的发展阶段具有密切关联。
图1-4显示大多肿瘤组织为DHX33蛋白阳性表达，而所有的肿瘤旁正常组织和子宫内膜正常组织都是DHX33蛋白阴性。其中，图1-2对比的是代表性的10例肿瘤及瘤旁正常组织的DHX33蛋白免疫组织化学分析结果，正常组织不表达DHX33蛋白，而肿瘤组织显示强阳性DHX33蛋白表达。图3-4为整体组织的芯片的阵列和DHX33蛋白染色图。
图5显示了一位54岁女性临床病例样本的免疫组织化学结果。该病例的病理分型为子宫内膜样腺癌临床一期，侵润浅肌层。在免疫组织化学检查中，使用DHX33蛋白作为一抗，封片后显示出阳性。如图6所示该患者的周边癌旁正常组织免疫组化结果中，未观察到明显的DHX33蛋白表达，免疫结果存在显著差异。说明DHX33蛋白对子宫内膜癌的诊断具有高度敏感性，提示DHX33蛋白可以作为子宫内膜癌的诊断标志物。
表1人子宫内膜癌组织芯片样本一所有病例的肿瘤病人病理信息、肿瘤详情以及DHX33蛋白阳性表达等级及得分统计表
实施例2验证DHX33蛋白可以作为子宫内膜癌的诊断标志物
基于人子宫内膜癌组织芯片样本一的研究，提示DHX33蛋白可以作为子宫内膜癌的一个标志物，而且其表达与肿瘤发展密切关联。为了验证DHX33蛋白可以作为子宫内膜癌的诊断标志物，进一步获取大量子宫内膜癌组织(样本二)，进行验证。
通过相同的免疫组化方法，使用样本二对前面的结果进行验证。免疫组化后显微镜检的阳性分级结果基本验证了前述的实验结果。具体而言，图9-10给出了10例正常组织和癌症组织的DHX33蛋白表达，发现DHX33蛋白在正常组织中为阴性，而在癌症组织中多是DHX33蛋白阳性表达。宏观的整体芯片染色结果如图11所示，在白色背景下，显示大多肿瘤组织为DHX33蛋白阳性表达，而所有正常组织都为DHX33蛋白表达阴性。图12-13给出了一例代表性的放大的DHX33蛋白染色的阴性和阳性结果。汇总总体组织的DHX33蛋白表达分数和病例的病理信息(表2)，包括肿瘤详情以及DHX33蛋白的表达强度等级，发现在III期病例中，DHX33蛋白阳性的表达比率接近40％，而DHX33蛋白在I期或者I-II期病例中总体阳性比率在20％左右，表明DHX33蛋白表达与肿瘤的发展阶段具有密切关联。
表2子宫内膜癌组织芯片样本二所有病例的肿瘤病人病理信息、肿瘤详情以及DHX33的表达强度分数
实施例3通过免疫组织化学分析DHX33蛋白在卵巢癌组织中的表达
为了进一步探究DHX33蛋白的特异识别性，验证DHX33蛋白诊断子宫内膜癌的价值，我们用人多种卵巢癌做了进一步的验证。
使用与前面分析相同的染色方法分析，结果发现DHX33蛋白在卵巢癌组织中表达大多为阴性。对人卵巢癌组织芯片样本三进行DHX33蛋白的免疫组化分析及阳性等级评分，发现DHX33蛋白在卵巢癌中的表达并不敏感，且表达量与肿瘤分期并无相关。汇总所有卵巢癌病例结果，发现DHX33蛋白在近100例人卵巢癌中的阳性表达率很低(图16-17)。
具体而言，图16为样本三人卵巢癌组织芯片中一位54岁女性临床病例样本的免疫组织化学结果，从芯片信息中可知该患者为卵巢双侧高级别浆液性癌，癌细胞已转移肝脏及结肠，恶化程度较高，但未在该位点观察到DHX33蛋白的表达，说明DHX33蛋白具有特异表达性，能够特异性识别子宫内膜癌。图17为病理芯片样本三的DHX33蛋白免疫组化染色的整体平面图及位点阵列信息，在白色背景下，直观显示大多癌症组织为DHX33蛋白阴性表达。
汇总该组织芯片所有卵巢癌病例结果，下文的表3展示了病例肿瘤详情以及DHX33蛋白的表达强度等级，发现DHX33蛋白在近100例人卵巢癌中的阳性表达率很低，而且DHX33蛋白的表达水平与卵巢癌肿瘤分期无相关性。
表3人卵巢癌组织芯片样本三组织芯片病例的肿瘤详情以及DHX33的表达强度分数
实施例4采用ROC曲线分析DHX33蛋白对子宫内膜癌的诊断价值
根据人子宫内膜癌和人卵巢癌组织芯片的免疫组化评分，将肿瘤组织中DHX33蛋白的表达水平分为阳性组和阴性组。使用GraphPad Prism8软件分析，计算出阴性组和阳性组的ROC曲线，计算出AUC值与p值。
ROC曲线说明：以特异性为横坐标、以灵敏性为纵坐标，绘制出受试者工作特征曲线(ROC曲线)，曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。通过比较子宫内膜癌与卵巢癌的AUC，进而判断DHX33蛋白表达量对两种肿瘤中对肿瘤组织识别性的准确度。
本发明首先分析了样本一中正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中DHX33蛋白表达分数的统计学差异，可以看到二组样本具有显著的统计学差异，p小于0.0001(图7)，样本一子宫内膜癌组织中AUC面积等于0.848，p值小于0.0001(图8)，说明DHX33蛋白表达可以准确诊断子宫内膜癌。
本发明进一步使用样本二对前面的筛选结果进行了验证。图14对子宫内膜癌和正常组织中DHX33蛋白的表达强度进行了统计分析，可以看到有显著差异。在样本二中，AUC可以达到0.709，p小于0.001，验证了上述观点，说明DHX33蛋白作为肿瘤标志物，可以进行子宫内膜癌的诊断。
与之对比，人卵巢癌组织的分析结果则完全不同，如图18所示，DHX33蛋白在卵巢癌正常组织与肿瘤组织中的表达情况相差不大，AUC＝0.5909，p＝0.3962，说明DHX33蛋白对人卵巢癌无诊断价值，无法准确区分人卵巢癌肿瘤组织与正常组织。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换均落入本发明权利要求书请求保护的范围内。
Claims (9)
1.检测DHX33蛋白含量或活性的系统或检测DHX33蛋白基因含量或表达量的系统在制备筛查或辅助诊断子宫内膜癌产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测DHX33蛋白含量或活性的系统包括检测DHX33蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器；
所述检测DHX33蛋白基因含量或表达量的系统包含检测DHX33蛋白基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测DHX33蛋白含量或活性所需的试剂为特异识别DHX33蛋白的蛋白质或者多肽或者其修饰物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测DHX33蛋白含量或活性所需的试剂为特异识别DHX33蛋白的抗体或抗体片段或者其修饰物。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测DHX33蛋白基因含量或表达量所需的试剂包含扩增DHX33蛋白基因或其片段的引物。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述检测所采用的样本为来自受试者的组织，优选石蜡包埋组织、冰冻组织或者组织活检物。
7.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述产品包括系统，所述系统包括试剂和/或仪器，所述试剂包括芯片、制剂或试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒或免疫组化试剂盒。
9.DHX33蛋白的抗体在制备筛查或辅助诊断子宫内膜癌的产品中的应用。
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