CN116559460A - 自闭症检测的生物标志物、检测试剂盒及检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了对自闭症严重程度进行检测的生物标志物，即血清中的β‑甲氨基‑L‑丙氨酸(BMAA)的水平，由此自闭症严重程度的分级评定将不依靠主观经验判断，极大提高了诊断准确率；本发明还提供了用于检测血清中的β‑甲氨基‑L‑丙氨酸(BMAA)水平的试剂组合在制备用于检测自闭症的试剂盒及其用途；用于检测自闭症患者的生物样品以确定患者自闭症严重程度的系统，通过此系统，可对自闭症严重程度进行分级评定。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及自闭症检测的生物标志物、检测试剂盒及检测系统。
背景技术
自闭症(autism)，又称自闭症或孤独性障碍(autisticdisorder)等，是广泛性发育障碍(pervasivedevelopmentaldisorder，PDD)的代表性疾病。《DSM-IV-TR》将PDD分为5种：孤独性障碍、Retts综合症、童年瓦解性障碍、阿斯伯格综合征和未特定的PDD。其中，孤独性障碍与阿斯伯格综合征较为常见。自闭症的患病率报道不一，一般认为约为儿童人口的2～5/万人，男女比例约为3～4∶1，男孩比女孩多3～4倍。
20世纪80年代，关于自闭症的研究进入全新阶段。人们开始抛弃所谓″父母抚养方式不当″的病因假说，从生物学领域探索自闭症的病因，并在临床症状的识别和临床诊断方面将自闭症与精神分裂症彻底分开。Kolvin的研究表明，自闭症同成年精神病性障碍，尤其是成年精神分裂症没有关系。1980年出版的《DSM-III》首次将童年自闭症视为一种广泛性发育障碍。之后，随着对自闭症研究的深入，逐步认识到自闭症是一种在一定遗传因素作用下，受多种环境因子刺激导致的弥漫性中枢神经系统发育障碍性疾病。在此认识的基础上，开展了从分子遗传到神经免疫、功能影像、神经解剖和神经化学等多方面的研究，人们试图从这些研究中找到自闭症的致病原因。仍没有任何一种假说能从根本上完美地解释自闭症的病因。自闭症的诊断目前较为普遍的方法是采用儿童自闭症评定量表来进行诊断。该表是1980年由E.Schopler、R.J.Reichler和B.R.Renner所编制的。儿童自闭症评定量表是根据儿童的表现，对儿童的人际关系、模仿(词和动作)、情感反应、躯体应用能力、与非生命物体的关系、对环境变化的适应、视觉反应、听觉反应、近处感觉反应、焦虑反应、语言交流、非语言交流、活动水平、智力功能和总的印象等十五个方面进行评分。评分标准如下：总分低于30分：无自闭症；30-60分：有自闭症；其中30-37分：为轻到中度自闭症；37-60分：重度自闭症。
用儿童自闭症评定量表诊断自闭症，这种方法主要依靠主观经验判断，会影响诊断的准确率，对自闭症严重程度的分级评定造成影响。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种自闭症检测的生物标志物，其特征在于，包括血清中的β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平。本发明的目的之一在于提供所述的自闭症检测的生物标志物在检测自闭症患者的生物样品的系统中的应用。
本发明的目的之一在于提供一种检测血清中的β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平的试剂组合在制备用于检测自闭症的试剂盒中的用途。
优选的，所述检测血清中的β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平的试剂组合包括ELISA检测试剂；
所述ELISA检测试剂包括山羊抗兔抗体的磷酸盐缓冲液；冻干BMAA校准品/标准品；
兔抗BMAA的抗体溶液；HRP标记的BMAA溶液；洗涤液；TMB显色液；终止液。
优选的，所述用于检测自闭症的试剂盒的使用包括以下步骤：
获取来自受测个体血液样品；
将血液样品进行离心获取血清；
将血清进行ELISA检测，并根据ELISA检测的结果受测个体血清中所含β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平确定自闭症的严重程度。
优选的，所述将血液样品进行离心获取血清包括如下步骤：受测个体采静脉血3ml，然后3000rpm离心5分钟，取上清为血清样品；
所述将血清进行ELISA检测，并根据ELISA检测的结果受测个体血清中所含β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平确定自闭症的严重程度包括如下步骤：
步骤一：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
步骤二：将冻干的BMAA校准品/标准品用纯化水溶解，稀释BMAA校准品/标准品的浓度分别为0ppb、5ppb、25ppb、100ppb、250ppb、500ppb。
步骤三：在包被好的ELISA板孔中加入下述溶液：100μlBMAA参考品/标准溶液或100μl血清样品溶液，50μlBMAA-HRP结合液，50μl兔抗BMAA的抗体溶液。每个BMAA参考品/标准溶液或样品至少做2个重复孔；
步骤四：混匀30秒后，室温下避光孵育90分钟；
步骤五：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
步骤六：于终止反应后15分钟内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值；
步骤七：绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品BMAA的浓度；
步骤八：根据样品的BMAA的浓度，进行自闭症严重程度的分级评定。本发明的目的之一在于提供一种诊断自闭症的试剂盒，包括适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。
优选的，所述适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂包括ELISA检测试剂；
所述ELISA检测试剂包括山羊抗兔抗体的磷酸盐缓冲液；冻干BMAA校准品/标准品；
兔抗BMAA的抗体溶液；HRP标记的BMAA溶液；洗涤液；TMB显色液；终止液。
优选的，所述用于诊断自闭症的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
获取来自受测个体血液样品；
将血液样品进行离心获取血清；
将血清进行ELISA检测，并根据ELISA检测的结果患者血清中所含β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平确定患者自闭症的严重程度。
优选的，所述将血液样品进行离心获取血清包括如下步骤：采静脉血3ml，然后3000rpm离心5分钟，取上清为血清样品。
所述将血清进行ELISA检测，并根据ELISA检测的结果患者血清中所含β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平确定患者自闭症的严重程度包括如下步骤：
步骤一：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
步骤二：将冻干的BMAA校准品/标准品用纯化水溶解，稀释BMAA校准品/标准品的浓度分别为0ppb、5ppb、25ppb、100ppb、250ppb、500ppb；
步骤三：在包被好的ELISA板孔中加入下述溶液：100μlBMAA参考品/标准溶液或100μl样品溶液，50μlBMAA-HRP结合液，50μlBMAA抗体溶液。每个BMAA参考品/标准溶液或样品至少做2个重复孔；
步骤四：混匀30秒后，室温下避光孵育90分钟；
步骤五：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
步骤六：于终止反应后15分钟内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值；
步骤七：绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品BMAA的浓度；
步骤八：根据样品的BMAA的浓度，进行自闭症严重程度的分级评定。本发明的目的之一在于提供一种检测自闭症患者的生物样品以确定患者自闭症严重程度的系统，包括：
血液处理装置，所述血液处理装置用于将取自受测个体的待测样品进行离心处理从而获取血清；
ELISA检测装置，所述ELISA检测装置与所述血液处理装置相连，用于检测血清经ELISA检测试剂处理后的酶标值；以及分析装置，所述分析装置与所述ELISA检测装置相连，基于酶标值对其所含的生物标志物进行浓度分析，根据分析结果判断待测样品的受测个体自闭症严重程度。
优选的，所述血液处理装置操作步骤包括：采静脉血3ml，然后3000rpm离心5分钟，取上清为血清样品。
所述ELISA检测装置和分析装置操作步骤包括：
步骤一：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
步骤二：将冻干的BMAA校准品/标准品用纯化水溶解，稀释BMAA校准品/标准品的浓度分别为0、5、25、100、250、500(ppb)。
步骤三：在包被好的ELISA板孔中加入下述溶液：100μlBMAA参考品/标准溶液或100μl样品溶液，50μlBMAA-HRP结合液，50μlBMAA抗体溶液。每个BMAA参考品/标准溶液或样品至少做2个重复孔。
步骤四：混匀30秒后，室温下避光孵育90分钟。
步骤五：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
步骤六：于终止反应后15分钟内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值。
步骤七：绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品BMAA的浓度。
步骤八：根据样品的BMAA的浓度，进行自闭症严重程度的分级评定。
任何可检测生物指标，可以包含基因标志物，物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物(KO/OG标志物)，其具有非常广泛的用途，可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。
除此之外，在本发明中，检测出BMAA或测定BMAA水平的制剂是抗体，通过使用将抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，可以检测出相应BMAA或测定BMAA水平。作为用于此的分析方法，有蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELlSA，enzymelinkedimmunosorbentasay)、放射免疫分析(RIA：Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、欧氏(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitationassay)、补体结合分析法(ComplementFixationAssay)、荧光活化细胞分选器(FACS，Fluorescenceactivatedcellsorter)、蛋白芯片(proteinchip)等，上述方法只是对抗体-抗原免疫反应的说明，本发明不限于上述方法。
本发明具有以下有益效果：
在进行自闭症与肠道微生物相关性的研究过程中，本发明人发现，肠道微生物中存在的原核生物Cyanobacteria与自闭症的发生存在显著的相关性，这表明原核生物Cyanobacteria与自闭症的发生有密切的关系。而β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)是原核生物Cyanobacteria分泌的一种神经毒素，本发明发现β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)的浓度与自闭症严重程度有显著相关性，且BMAA浓度越高，自闭症越严重。说明BMAA可能是导致自闭症发生的重要原因。本发明将血清中的BMAA含量作为自闭症严重程度分级的检测标志物，通过检测BMAA的浓度来确定自闭症的严重程度，改变了目前采用的依靠自闭症评定量表诊断自闭症，确定自闭症严重程度的方法，克服了自闭症严重程度分级的诊断较大程度的依赖于主观经验判断的缺陷，极大提高了诊断准确率。
本发明提供的试剂盒检测时间只需要3小时左右，而且只需要对自闭症患者进行静脉采血。本发明的ELISA检测试剂盒较现有自闭症检测技术具有客观、简便、快捷等特点，减少了自闭症患者的参与时间，也极大的减少了医护人员的工作难度。
再者，相较于依靠自闭症评定量表诊断自闭症，确定自闭症严重程度的方法，本发明检测BMAA的浓度灵敏度高，即使BMAA浓度发生轻微的变化也能检测的出来，因此将来会有非常广泛的用途，比如在临床上对自闭症治疗疗效的评价，自闭症患者病情的动态监测等。
附图说明
图1是本发明ELISA试剂盒进行自闭症严重程度检测和分级评定的ROC曲线分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了评估血清中BMAA的浓度能否作为自闭症严重程度的评价因子，本发明通过收集自闭症患者的血液样本，进行ELISA实验检测自闭症患者血清中BMAA的浓度，并根据浓度评定患者自闭症严重程度的分级情况，再与医生通过儿童自闭症评定量表的诊断结果进行比较，发现二者结果一致性达到了90％，说明本发明提供的ELISA试剂盒可以替代儿童自闭症评定量表用于自闭症严重程度的分级评价。
实施例1
本实施例运用ELISA检测分析自闭症患者的血液样本，继而进行统计分析，从而确定可以将BMAA的浓度作为是否患有自闭症及病情严重程度分级评定的生物标志物。具体步骤如下：
1.样品来源
样本来源及入选标准如下：
诊断为自闭症的患者。排除标准：①患有其他精神疾病(如精神分裂症)和其他神经发育障碍疾病；②患有遗传代谢性疾病；③患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史；
本研究分两期：一期进行本发明与自闭症评定量表诊断结果一致性的比较研究，第二期进行本发明与自闭症评定量表诊断方法的灵敏度的比较研究。
一期研究共收集10例自闭症患儿，男9例，女1例；年龄3～7岁；
二期研究收集9例患儿，其中6例自闭症患儿和3例发育迟缓患儿，自闭症患儿男6例，女0例；年龄3～7岁。3例发育迟缓患儿，男1例，女2例；年龄3～7岁。
血液采集与获取上清：
用一次性采血管采集静脉血约3ml，然后用离心机3000rpm离心5分钟，收集上清液为血清样品。
ELISA检测：
反应板包被：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
加入参考品/标准溶液：包被好的酶标板孔中依次加入100μl稀释好的BMAA校准品/标准品，浓度分别为0ppb、5ppb、25ppb、100ppb、250ppb、500ppb。每个浓度做至少两个平行孔。
加入血清样品：其他包被好的酶标板孔中依次加入100μl各个血清样品。
加入结合液：每孔加入50μlBMAA-HRP结合液。
加入抗体溶液：每孔加入50μlBMAA抗体溶液。
孵育：混匀30秒后，室温下避光孵育90分钟。
洗板：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。
显色和反应终止：洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
检测：于终止反应后15分钟内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值。
计算样品的BMAA浓度：绘制标准品450nm处吸光度与BMAA浓度的标准曲线，并根据自闭症严重程度的分级评定：根据样品的BMAA浓度确定血清供试者自闭症严重程度。
试剂盒检测BMAA浓度与自闭症严重程度评价标准：BMAA浓度≤101ppb，自闭症严重程度为轻度到中度；BMAA浓度>101ppb，自闭症严重程度为重度。
上述各步骤涉及到的试剂的配制方法如下：
PBS：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)2.9g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCI)0.2g，加水至1000mL。
含0.2％吐温-20的PBS：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)2.9g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCI)0.2g，吐温-202mL，加水至1000mL。
统计分析
4.1.本发明与自闭症评定量表诊断结果一致性分析用本发明试剂盒和自闭症评定量表诊断10份患者样本，结果如表1所示
表1分别用本发明ELISA试剂盒和自闭症评定量表诊断10份患者样本。
两种自闭症严重程度的评价方法只有1例出现了不一致，用本发明ELISA试剂盒检测自闭症的严重程度与目前普遍采用的自闭症评定量表诊断结果达到了90％的一致性。4.2.本发明与自闭症评定量表诊断的灵敏度分析用本发明试剂盒和自闭症评定量表诊断9份献血者样本如表2所示
表2分别用本发明的ELISA试剂盒和自闭症评定量表诊断9份血液样本
对自闭症患者的检测，两种自闭症严重程度的评价方法只有1例出现了不一致；另外，有3例采用的自闭症评定量表诊断结果医生认为是发育迟缓，不是自闭症，但是通过本发明的试剂盒检测，可以判定其自闭症的严重程度。可见本发明试剂盒的灵敏度是强于目前普遍采用的自闭症评定量表的。3名发育迟缓的患儿目前也在进行自闭症的康复训练，可见病情与自闭症是有很多相似性的。但是如果因为被评价为发育迟缓，可能会导致家长的不重视，从而延迟了对病情的干预和治疗。从这点来说，本发明具有更高的灵敏度是非常重要的。
Claims (7)
1.一种自闭症检测的生物标志物，其特征在于，包括血清中的β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平。
2.如权利要求1所述的自闭症检测的生物标志物在检测自闭症患者的生物样品的系统中的应用。
3.一种诊断自闭症的试剂盒，其特征在于，包括适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。
4.如权利要求3所述的诊断自闭症的试剂盒，其特征在于，所述适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂包括ELISA检测试剂；所述ELISA检测试剂包括山羊抗兔抗体的磷酸盐缓冲液；冻干BMAA校准品/标准品；兔抗BMAA的抗体溶液；HRP标记的BMAA溶液；洗涤液；TMB显色液；终止液。
5.如权利要求4所述的诊断自闭症的试剂盒，其特征在于，所述用于诊断自闭症的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
获取来自受测个体血液样品；
将血液样品进行离心获取血清；
将血清进行ELISA检测，并根据ELISA检测的结果患者血清中所含β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平确定患者自闭症的严重程度。
6.如权利要求5所述的诊断自闭症的试剂盒，其特征在于，所述将血液样品进行离心获取血清包括如下步骤：采静脉血3ml，然后3000rpm离心5分钟，取上清为血清样品。
所述将血清进行ELISA检测，并根据ELISA检测的结果患者血清中所含β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)水平确定患者自闭症的严重程度包括如下步骤：
步骤一：在ELISA反应板中加入含1μg/ml山羊抗兔抗体的PBS，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的PBS洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的ELISA板；
步骤二：将冻干的BMAA校准品/标准品用纯化水溶解，稀释BMAA校准品/标准品的浓度分别为0ppb、5ppb、25ppb、100ppb、250ppb、500ppb；
步骤三：在包被好的ELISA板孔中加入下述溶液：100μl BMAA参考品/标准溶液或100μl样品溶液，50μl BMAA-HRP结合液，50μl BMAA抗体溶液。每个BMAA参考品/标准溶液或样品至少做2个重复孔；
步骤四：混匀30秒后，室温下避光孵育90分钟；
步骤五：倒掉孔中内容物，每个板孔至少用250μl含0.2％吐温-20的PBS进行洗涤，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔均加入TMB显色液150μl显色，混匀30秒后置于室温避光保温30min，然后每孔加入100μl终止液终止反应；
步骤六：于终止反应后15分钟内，将反应板置于酶标仪中，读取OD450值；
步骤七：绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品BMAA的浓度；
步骤八：根据样品的BMAA的浓度，进行自闭症严重程度的分级评定。
7.一种检测自闭症患者的生物样品以确定患者自闭症严重程度的系统，其特征在于，包括：血液处理装置，所述血液处理装置用于将取自受测个体的待测样品进行离心处理从而获取血清；
ELISA检测装置，所述ELISA检测装置与所述血液处理装置相连，用于检测血清经ELISA检测试剂处理后的酶标值；
以及分析装置，所述分析装置与所述ELISA检测装置相连，基于酶标值对其所含的生物标志物进行浓度分析，根据分析结果判断待测样品的受测个体自闭症严重程度。
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