CN113984920B - 检测β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的物质在制备脑性瘫痪辅助诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测β‑氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的物质在制备脑性瘫痪辅助诊断试剂盒中的应用。本发明首先以具有早产暴露史的痉挛型脑瘫患儿(脑瘫组)和具有早产暴露史的正常对照儿童(正常对照组)为研究对象，发现血浆中的β‑氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量在脑瘫组和正常对照组中的浓度存在明显差异，然后经过机器学习的筛选，确定血浆中的β‑氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸可用作对脑瘫患儿和健康儿童进行判别诊断的潜在标志物组合，为脑瘫的早期筛查、辅助诊断和研究干预措施提供基础数据支持。

Description

检测β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的物质在制备脑性瘫痪辅助诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的物质在制备脑性瘫痪辅助诊断试剂盒中的应用。

背景技术

脑性瘫痪(简称脑瘫)是指因脑部发育不良(早期脑损伤以及发育缺陷)引起的一系列非进行性运动功能障碍和姿势异常综合症。作为运动障碍为主要临床体征的致残性疾病，全球脑瘫的发生率大约为2～3.5/1000个活产儿，无论是发达国家，还是发展中国家，近几十年来其发病率均保持相对稳定且没有明显的下降。脑瘫在发达国家的发病率大约在1.5‰～2.5‰之间，在中国其发病率将近2.5‰，每年新增脑瘫患儿约4到5万人，约有30万的0～6岁之间学前儿童罹患脑瘫。

脑瘫发病风险因素分为产前因素、产时因素和产后因素，这些风险因素可以作为独立风险因素，也可以通过多种风险因素联合作用。其中，早产儿比足月儿脑瘫患病率更高，根据孕周的大小差异，患病率从5‰到92‰不等。

脑瘫的临床表型是一组临床症状，存在很强异质性，其诊断依据是基于临床症状，常存在一定的主观偏差，且容易与其他脑发育不良或者类似表型的疾病存在混淆。在患儿早期由于症状不明显或不典型也会无法及时诊断，从而错失早期治疗的机会。已有研究表明，脑瘫患者在脑部检查及脑电图、功能测试、遗传多态性等方面存在异常，但是尚无法满足用于临床诊断的要求。确诊是临床干预的基础，早确诊才能早干预。由于脑瘫患儿不能在早期得到发现和治疗，从而严重影响康复效果和患儿预后，导致终身残疾，对家庭、个人都是沉重的负担。因此，了解与脑瘫相关的代谢过程，寻找其相关生物标志物，可为脑瘫的早期筛查、辅助诊断和研究干预措施提供基础数据支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何诊断或辅助诊断脑性瘫痪。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了M1的新用途；所述M1包括检测β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量的物质。

本发明提供了M1在制备诊断或辅助诊断早产儿罹患脑瘫的产品中的应用。

本发明还提供了M1在制备筛选或辅助筛选早产儿中的脑瘫患儿的产品中的应用。

本发明还提供了M1在制备判别或辅助判别早产儿为脑瘫患儿还是健康儿童的产品中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种诊断或辅助诊断早产儿罹患脑瘫的产品或筛选或辅助筛选早产儿中的脑瘫患儿的产品或判别或辅助判别早产儿为脑瘫患儿还是健康儿童的产品。

本发明提供的诊断或辅助诊断早产儿罹患脑瘫的产品或筛选或辅助筛选早产儿中的脑瘫患儿的产品或判别或辅助判别早产儿为脑瘫患儿还是健康儿童的产品包括上述M1。

上述任一所述应用或产品中，所述M1中，所述检测β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量的物质由检测β-氨基异丁酸含量的物质、检测色氨酸含量的物质和检测牛磺酸含量的物质组成；

所述检测β-氨基异丁酸含量的物质为检测β-氨基异丁酸含量所需的试剂和/或仪器；所述检测色氨酸含量的物质为检测色氨酸含量所需的试剂和/或仪器；所述检测牛磺酸含量的物质为检测牛磺酸含量所需的试剂和/或仪器。

进一步的，所述检测β-氨基异丁酸含量的物质为检测血浆中β-氨基异丁酸含量所需的试剂和/或仪器；所述检测色氨酸含量的物质为检测血浆中色氨酸含量所需的试剂和/或仪器；所述检测牛磺酸含量的物质为检测血浆中牛磺酸含量所需的试剂和/或仪器。

更进一步的，所述仪器为日本Hitachi公司的氨基酸分析仪(型号：L-8900)。

上述任一所述应用或产品中，所述M1还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于根据早产儿血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量确定所述早产儿是否患有脑瘫或是否为脑瘫患儿。

进一步的，所述数据处理装置由数据输入模块、数据记录模块、数据计算模块和结论输出模块组成；

所述数据输入模块用于输入早产儿血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量数值；

所述数据记录模块用于存储早产儿血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量数值；

所述数据计算模块用于接收从所述数据记录模块输出的早产儿血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量数值，然后按照式-Ⅰ计算早产儿的P值；

P＝1/(1+e^{-(8.295-0.3848*BAIBA-0.1120*Trp+0.0108*Tau)})   式-Ⅰ；

其中，BAIBA、Trp和Tau分别代表早产儿血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的浓度(nmol/mL)；

所述结论输出模块用于显示结论，当早产儿的P值大于等于0.603时，则提示该早产儿为脑瘫患儿，当早产儿的P值小于0.603时，则提示该早产儿为健康儿童。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸作为标志物的新用途。

本发明提供了β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸作为标志物在制备诊断或辅助诊断早产儿罹患脑瘫的产品中的应用。

本发明还提供了β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸作为标志物在制备筛选或辅助筛选早产儿中的脑瘫患儿的产品中的应用。

本发明还提供了β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸作为标志物在制备判别或辅助判别早产儿为脑瘫患儿还是健康儿童的产品中的应用。

上述任一所述应用或产品中，所述脑瘫为痉挛性脑瘫。

上述任一所述应用或产品中，所述产品为试剂盒。

本发明首先以具有早产暴露史的痉挛型脑瘫患儿(脑瘫组)和具有早产暴露史的正常对照儿童(正常对照组)为研究对象，发现血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量在脑瘫组和正常对照组中的浓度存在明显差异，然后经过机器学习的筛选，确定血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸可用作对脑瘫患儿和健康儿童进行判别诊断的潜在标志物组合，为脑瘫的早期筛查、辅助诊断和研究干预措施提供基础数据支持。

附图说明

图1为质控样本中各氨基酸峰面积的相对标准偏差。其中，橙色标识的是样本中检出的33种氨基酸，绿色标识的是样本中添加的内标物质(茶氨酸)。

图2为β-氨基异丁酸BAIBA、色氨酸Trp、牛磺酸Tau在早产儿脑瘫组和正常组的分布图。其中，CP和HC分别代表具有早产暴露史的脑瘫患儿组和正常对照组，***代表P＜0.001，**代表P＜0.01，*代表P＜0.05。

图3为机器学习筛选在早产儿中与脑瘫相关的氨基酸标志物。

图4为具有早产暴露史的脑瘫患儿和健康儿童的氨基酸组合判别诊断ROC曲线图。

具体实施方式

下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中所涉及的名词解释：

相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，又叫做标准偏差系数、变异系数等，由标准偏差除以相应的平均值乘100％所得值，可在检验检测工作中分析结果的精密度。

受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线是以假阳性率(1-特异度，即误诊率)为横坐标，以灵敏度(真阳性率)为纵坐标绘制的曲线，其曲线下面积(AUC)可以判断诊断试验效能的高低，在AUC＞0.5的情况下，AUC越接近1，说明诊断效果越好。

置信区间(Confidence Interval，CI)：置信区间是指由样本统计量所构造的总体参数的估计区间。在统计学中，一个概率样本的置信区间(Confidence interval)是对这个样本的某个总体参数的区间估计。置信区间展现的是这个参数的真实值有一定概率落在测量结果的周围的程度，其给出的是被测量参数的测量值的可信程度，即前面所要求的“一个概率”。

实施例1、检测β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的物质在制备脑性瘫痪诊断试剂盒中的应用

一、实验材料

实验材料为来自如下脑瘫组和对照组病例的血浆样本：

脑瘫组(CP)：具有早产暴露史的痉挛型脑瘫患儿29例；

对照组(HC)：具有早产暴露史的正常对照儿童20例。

其中，脑瘫组的血浆样本来源于医院脑康科就诊住院的具有早产暴露史的痉挛型脑瘫患儿，对照组的血浆样本来源于同时期在该医院保健科随访的与病例组人口学特征匹配的具有早产暴露史的正常对照儿童。所有脑瘫患者的临床诊断均由临床专科医生按照2014年全国小儿脑瘫康复学术会议公布的诊断标准完成，排除标准是相关先天颅脑畸形、代谢性脑病、遗传性脑病等；对照组选择的是无神经系统疾病的正常对照。研究通过了伦理委员会的伦理审查，同时按照受试者知情同意的原则，所有参与的研究对象的监护人均在收集样本前对研究内容签署了相关知情同意书并填写了相关调查问卷。

二、实验方法

对步骤一的血浆样本中的氨基酸水平进行靶向代谢组学检测，所用仪器为日本Hitachi公司的氨基酸分析仪(型号：L-8900)，具体方法如下：

1、本次研究的脑瘫组样本收集均是对上述研究对象在确诊后清晨完成抽取，在无菌操作下抽取2mL外周静脉血，置于真空的肝素抗凝管中；对照组样本用相同方法在清晨抽取，均符合代谢组学采样要求。

2、采集完成的外周血先静置沉淀后以3000rpm水平离心10min，吸取上层黄色的液体分装于不同离心管中，将处理得到的血浆样本编号后冻存于－80℃冰箱内。

3、前期配制43种游离氨基酸的混合标准溶液，380μg/mL有机提取液(0.1mol/LHCL·ISTD：10％TCA＝1：2)和5％的璜基水杨酸溶液(含100μg/mL茶氨酸)。

4、待血浆样本解冻融化，振荡混匀30s，并以15000rpm离心1min，保证EP管中的血浆沉到管底。

5、取50μL血浆样本，加入相同体积的有机提取液，以去除蛋白质、脂类和色素。

6、加入10μL的含有内标的璜基水杨酸溶液，调整pH值1.7～2.2。

7、在室温条件下，以15000rpm离心20min，吸取上清液加入含有内衬管的进样瓶中，盖上塑料盖并旋紧，上机实验，其实验条件见表1。

表1为氨基酸分析仪实验条件

8、将样品中的各氨基酸组分与标准品的氨基酸进行比较，通过其出峰的保留时间和峰面积进行准确的定性和定量分析，查看总离子流色谱图中氨基酸的出峰情况，并导出相应数值，比如各样本中氨基酸的保留时间、峰面积以及浓度(nmol/mL)。

9、计算样本中各氨基酸组分的实际含量，其氨基酸实际含量＝系统检测值*(血浆样量+提取液量)/提取液量。

10、选用9个质控样本(在所有样本中等间隔上机检测)和各样本中内标的检测值求得各组数据的相对标准偏差，评估本次实验数据的稳定性和准确性，各质控样本的相对标准偏差均小于30％，则表示符合临床样本的检测要求，也说明物质检测的稳定性和重复性较好。

11、通过R语言，将四分位数±1.5IQR以外的异常值用各组的均值替代以完成数据的清洗。在组间对比的单因素分析中，通过非参数检验中的Wilcoxon秩和检验衡量两组间不同氨基酸在统计学上的差异。在差异代谢物的变化幅度上，通过两组平均值相除(脑瘫组/对照组)计算得到其变异倍数比值(Fold Change，FC)。

12、在生物标志物的筛选上，为评估该算法的模型性能，通过机器学习将脑瘫组和对照组内的样本随机分为训练集和验证集(按比例70％和30％)，基于Lasso回归模型进行五折交叉验证计算单个代谢物的ROC对应的AUC值，以及通过特征缩减，计算筛选后的氨基酸组合模型的ROC对应的AUC值。为了避免抽样偏差，将分割过程重复5次，取得AUC值的平均值，并得出其95％的置信区间。

三、实验结果

1、质量控制

对本实验设置质控样本中所检出的氨基酸进行统计分析，以评估实验过程操作无误和机器运行的稳定性，确保后续分析的数据可靠。利用质控样本中各氨基酸峰面积计算其相对标准偏差，按照保留时间呈现在图1中，所有质控样本中内标茶氨酸的峰面积平均值为14614351.67±439762.67，对应RSD为3.01％，检出的33个氨基酸的RSD值如图1所示，整体处于较低的水平，远远小于代谢组学研究对临床样本要求的RSD＜30％，显示本发明实验可靠且稳定，个别相对误差较高的为体内含量极少，检出峰面积本来就较低的氨基酸。

2、β-氨基异丁酸(BAIBA)、色氨酸(Trp)、牛磺酸(Tau)在均具有早产暴露史的脑瘫组和正常对照组的检测结果

基于具有早产暴露史的脑瘫患儿(29例)和具有早产暴露史的对照儿童(20例)比较时，β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量存在明显差异。

β-氨基异丁酸在早产儿脑瘫组中的浓度平均值为5.28nmol/mL，在早产儿对照组中的浓度平均值为8.13nmol/mL，在脑瘫组中浓度较对照组低且差异最为显著(P＝5.6E-04，FC＝0.65)；

色氨酸在早产儿脑瘫组中的浓度平均值为57.72nmol/mL，在早产儿对照组中的浓度平均值为72.40nmol/mL，在脑瘫组中浓度较对照组低且差异较显著(P＝6.6E-04，FC＝0.80)；

牛磺酸在早产儿脑瘫组中的浓度平均值为212.60nmol/mL，在早产儿对照组中的浓度平均值为142.66nmol/mL，在脑瘫组中浓度较对照组高且差异显著(P＝3.7E-02，FC＝1.49)。

上述结果汇总于表2，表2按照氨基酸保留时间从小到大的顺序展示了牛磺酸、β-氨基异丁酸和色氨酸的基本信息，包含其在两组之间的平均浓度，以及对应的通过单变量统计分析得出的P值和FC值。

表2为三种氨基酸在脑瘫组和对照组样本中的平均浓度和差异信息

3、机器学习筛选标志物

在脑瘫组和对照组内进行交互验证和标志物筛选时，经筛选后纳入组合集合的标志物分别是：β-氨基异丁酸(BAIBA)、色氨酸(Trp)、牛磺酸(Tau)。在训练集(机器学习随机筛选的早产儿脑瘫组和早产儿对照组的各组70％样本)中各自的ROC曲线见图3-B左侧图，其对应AUC值分别是0.8377、0.8247、0.7143。在验证集(机器学习随机筛选的早产儿脑瘫组和早产儿对照组的各组30％样本)中各自的ROC曲线见图3-B右侧图，其对应AUC值分别是0.7704、0.7407、0.5926。

在脑瘫组和对照组进行比较时，血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的联合使用判别诊断脑瘫患儿在训练集和验证集中的分布情况见图3-A，经对模型中标志物组合后的ROC曲线，其训练集的曲线下面积AUC值为0.9286，95％置信区间为(0.8184-1.000)，经内部交叉验证后验证集的AUC值为0.8741，95％置信区间为(0.7322-1.000)，经组合后其分类效力大幅提升，且两个集合的验证性稳定，见图3-C。

由上述结果可知，经过机器学习的筛选，血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸可用作对脑瘫患儿和健康儿童进行判别诊断的潜在标志物组合。

上述结果汇总于表3，表3展示了血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸联合应用于对脑瘫患儿和健康儿童进行辅助诊断的效果。

表3为β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸联合辅助诊断脑瘫患儿和健康儿童效果的比较

由上述可知，血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸、牛磺酸的组合可以作为脑瘫患儿和健康儿童进行辅助诊断的潜在标志物组合。

在实际应用中，对早产儿为脑瘫患儿还是健康儿童进行判别诊断时，共同判断β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的组合标准依据多元logistic回归计算结果，按照如下计算公式进行计算：P＝1/(1+e^{-(8.295-0.3848*BAIBA-0.1120*Trp+0.0108*Tau)})，其中，BAIBA、Trp和Tau分别代表早产儿血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸的浓度(nmol/mL)。当P大于等于0.603时，则提示该早产儿为脑瘫患儿，当P小于0.603时，则提示该早产儿为健康儿童。

上述判别诊断的浓度阈值为三个氨基酸组合ROC曲线的AUC最大值对应的阈值，其特异度为0.850，敏感度为0.828，见图4。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.M1在制备辅助诊断早产儿罹患脑瘫的产品中的应用；所述M1包括检测血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量的物质。

2.M1在制备辅助筛选早产儿中的脑瘫患儿的产品中的应用；所述M1包括检测血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量的物质。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测血浆中β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量的物质由检测β-氨基异丁酸含量的物质、检测色氨酸含量的物质和检测牛磺酸含量的物质组成；

所述检测β-氨基异丁酸含量的物质为检测β-氨基异丁酸含量所需的试剂和/或仪器；所述检测色氨酸含量的物质为检测色氨酸含量所需的试剂和/或仪器；所述检测牛磺酸含量的物质为检测牛磺酸含量所需的试剂和/或仪器。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述M1还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于根据早产儿血浆中的β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸含量确定所述早产儿是否患有脑瘫。

5.β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸作为血浆标志物在制备辅助诊断早产儿罹患脑瘫的产品中的应用；

或，β-氨基异丁酸、色氨酸和牛磺酸作为血浆标志物在制备辅助筛选早产儿中的脑瘫患儿的产品中的应用。

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