CN116555161A - 一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质及其制备方法、可皮下移植的胰岛 - Google Patents

Abstract

本申请涉及胰岛移植的技术领域，具体公开了一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质及其制备方法、可皮下移植的胰岛。胰岛存活基质包括以下组分：培养液80‑110ml/l，L‑谷氨酰胺200‑260mg/l，胰岛素样生长因子‑1 2‑8mg/l，血管内皮生长因子2‑8mg/l，保护剂8‑15mg/l，胶原蛋白2000‑3000mg/l，pH缓冲剂1.2‑2.5mg/l，整合素亚基1‑3.5mg/l，整合素亚基是整合素α亚基和整合素β亚基的混合物；可皮下移植的胰岛包括上述胰岛存活基质。本申请的可皮下移植的胰岛在移植后具有存活寿命长、功能稳定发挥的优点。

Description

一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质及其制备方法、可皮 下移植的胰岛

技术领域

本申请涉及胰岛移植的技术领域，更具体地说，它涉及一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质及其制备方法、可皮下移植的胰岛。

背景技术

同种异体胰岛移植可根治I型糖尿病和终末期II型糖尿病，2000年以后国际上40个胰岛移植中心已经有2000例左右患者接受该疗法治疗。2017年初我国国家卫计委出台《同种胰岛移植技术管理规范》及《临床应用质量控制指标》，将该技术正式纳入临床诊疗项目。胰岛来自脑死亡者(同种异体)捐赠的胰腺，在实验室中经由消化和纯化分离出内分泌腺，即胰岛。临床胰岛移植部位为肝脏内移植，推荐剂量为5000当量胰岛/千克体重，在经验丰富的移植中心移植5年后外源性胰岛素脱离患者的比例可超过50％。然而，通过肝脏内移植常常会出现出血、门静脉血栓形成以及炎症等并发症，进而导致胰岛移植物坏死，最终导致胰岛移植失败。

随着研究的不断深入，研究人员们发现皮下组织可作为胰岛移植的替代移植部位，该部位移植手术简单、不良反应少且轻微，并能够在需要时简单、完全地切除胰岛移植物。

但是，将胰岛移植至皮下组织时，由于新生血管的缺乏和由此产生的营养素、氧气等的缺乏常导致绝大多数胰岛细胞在很短的时间内死亡；这在很大程度上限制了移植胰岛的功能和寿命。因此提供一种胰岛存活基质，将胰岛存活基质和胰岛混合后再进行皮下移植是解决该问题的一种思路。

目前也有针对胰岛细胞的培养液，例如公布号为CN 111733134 A的申请文件公开了一种用于胰腺癌细胞的新型培养液，其组分为：1640培养基85～95％，白蛋白2～4％，生长因子0.8～1.2％，类固醇激素0.8～1.2％，脂肪酸1.5～2.5％，维生素0.5～1.5％，微量矿质元素1.5～2.5％。直接将该类培养液用于和胰岛混合后进行皮下组织培养时，依然存在胰岛细胞在短期内大量死亡且难以发挥其功能的问题。

发明内容

为了改善胰岛移植至皮下组织时胰岛寿命短和功能发挥受限的问题，本申请提供一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质及其制备方法、可皮下移植的胰岛。

第一方面，本申请提供一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质，采用如下的技术方案：

一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质，所述胰岛存活基质包括以下组分：培养液80-110ml/l，L-谷氨酰胺200-260mg/l，胰岛素样生长因子-1 2-8mg/l，血管内皮生长因子2-8mg/l，保护剂8-15mg/l，胶原蛋白2000-3000mg/l，pH缓冲剂1.2-2.5mg/l，整合素亚基1-3.5mg/l；所述整合素亚基是整合素α亚基和整合素β亚基的混合物。

整合素是位于细胞表面的一类重要的细胞黏附分子，由α和β两个亚基通过非共价键连接而成的跨模异二聚体糖蛋白受体。整合素在人体内分布广泛，几乎所有不同组织的细胞上都表达有一种或几种整合素亚基分子。在脊椎动物中，目前发现有18个α及8个β亚基，α亚基和β亚基的不同组合共形成24个α/β整合素异二聚体。相关研究证实：整合素能够调节内皮细胞的分化、粘附、迁移以及存活，是作为内皮细胞和细胞外基质连接的桥梁；尤其是在肿瘤领域，肿瘤血管的生成离不开血管内皮细胞与细胞外基质的黏附过程：肿瘤细胞侵入血管周围间质后通过细胞间的黏附作用促进血管条索的形成，使得肿瘤细胞进一步转移和增殖。因此，例如通过制备整合素抗体类药物以抑制肿瘤新生血管的生成，促使肿瘤细胞死亡，以达到肿瘤治疗的目的。

通过采用上述技术方案，以整合素促进胰岛细胞和皮下组织细胞间的信息连通、胰岛细胞间的信息连通以及血管内皮细胞细胞间的连通，同时整合素和血管内皮生长因子相互协作，最终实现显著提高毛细血管的生成量，进而显著提高移植胰岛的存活率。另外，本申请的方案中，整合素并非是随意选择的，而是要同时选用整合素α和整合素β才能实现提高毛细血管的生成、进而延长胰岛存活寿命的目的。可能的原因是，体外添加整合素时，若是仅仅添加一种亚基的整合素，例如仅仅添加整合素α亚基或整合素β亚基时，由于均难以使得信号传导通路顺利打开，因此无法具有细胞间信号传导的作用，从而导致移植后新生血管的数量过少，因此依然存在胰岛细胞初始移植后由于营养素和氧气缺乏而导致的绝大多数胰岛细胞死亡的问题。

可选的，所述整合素α亚基和整合素β亚基的重量比为1:(4-6)。

通过采用上述技术方案，以该重量比添加整合素α亚基和整合素β亚基时，能够进一步显著提高皮下移植胰岛后胰岛细胞的存活寿命和功能的发挥效果。

可选的，所述整合素α亚基选自整合素α9亚基和整合素α10亚基中的任意一种或两种。

可选的，所述整合素β亚基选自整合素β1亚基和整合素β3亚基中的任意一种或两种。

可选的，所述保护剂为人血白蛋白；所述胶原蛋白为I型胶原蛋白；所述培养液为M199培养液。

第二方面，本申请提供一种上述胰岛存活基质的制备方法，采用如下的技术方案：上述胰岛存活基质的制备方法，包括以下步骤：将培养液、L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子-1、血管内皮生长因子、保护剂、整合素亚基、pH缓冲剂和胶原蛋白混合后配制得到所述胰岛存活基质。

通过采用上述技术方案，以简单高效的方法即可实现胰岛存活基质的制备，有利于工业化生产。

可选的，所有原料和所述胰岛存活基质，均置于-4～0℃的环境中。

通过采用上述技术方案，以防止在较高温度下原料或中间混合物的变性凝固，保证制备得到具有功效性的胰岛存活基质。

第三方面，本申请提供一种可皮下移植的胰岛，采用如下的技术方案：

一种可皮下移植的胰岛，包括胰岛细胞和上述的胰岛存活基质。

可选的，所述可皮下移植的胰岛采用包括以下步骤的方法制备得到：

S1、准备所述胰岛存活基质并置于-4～0℃的环境中备用；准备含有胰岛细胞的胰岛悬浮液，将所述胰岛悬浮液经固液分离后留细胞固体备用；

S2、将所述胰岛存活基质和所述细胞固体混合均匀，即得到可皮下移植的胰岛。

通过采用上述技术方案，保证在进行胰岛细胞移植前，胰岛细胞的相关功能是没有损失的，以保证移植后胰岛细胞的存活寿命和功能的发挥。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请通过以整合素α和整合素β共同添加，配合血管内皮生长因子以实现提高毛细血管的生成、进而延长移植后胰岛存活寿命的目的。

2、本申请以特定重量比添加整合素α亚基和整合素β亚基，以进一步延长皮下移植胰岛后胰岛细胞的存活寿命，保证其功能的长期、稳定地发挥。

附图说明

图1是实施例2试验组和对照组小鼠的移植部位皮肤的HE染色结果；

图2是实施例2试验组和对照组小鼠的移植部位皮肤的免疫组染色结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

本申请涉及的原料若无特殊说明，均为普通市售。其中，pH缓冲剂为碳酸氢钠，购自赛默飞，货号为Gibco 25080-094；I型胶原蛋白溶液购自Advanced BioMatrix的I型人胶原蛋白溶液，货号为5007-20ml，I型胶原蛋白含量为3.1mg/ml；L-谷氨酰胺溶液购自康宁(CORING)，货号为25-005-CI，L-谷氨酰胺含量为29.20mg/ml；M199培养液为10×M199培养液；人血白蛋白溶液中人血白蛋白的含量为20wt％；血管内皮生长因子是重组人VEGF 165A蛋白，货号为ab9571；胰岛素样生长因子-1为重组人胰岛素样生长因子-1，品牌为PrimeGene(即普欣)，货号为105-01；整合素α10亚基为整合素α10重组蛋白，品牌为HZbscience，货号为ZY096Hu013；整合素α9亚基为整合素α9重组蛋白，购自上海钰博生物科技有限公司，货号为YB095Mu013；整合素β1亚基为整合素β1重组蛋白，购自上海钰博生物科技有限公司，纯度99wt％；整合素β3亚基为整合素β3重组蛋白，品牌为HZbscience，货号为ZY262Mu012。

本申请中，重组人胰岛素样生长因子-1的简称为重组IGF-1，重组人VEGF 165A蛋白的简称为重组VEGF，整合素α10重组蛋白的简称为重组ITGα10，整合素α9重组蛋白的简称为重组ITGα9，整合素β1重组蛋白的简称为重组ITGβ1，整合素β3重组蛋白的简称为重组ITGβ3。

实施例

实施例1

一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质，该胰岛存活基质的组分为：10×M199培养液80ml/l，L-谷氨酰胺200mg/l，重组IGF-1 2mg/l，重组VEGF 2mg/l，人血白蛋白8mg/l，I型人胶原蛋白2000mg/l，碳酸氢钠1.2mg/l，整合素亚基1mg/l：其中，重组ITGα9 0.5mg/l，重组ITGβ1 0.5mg/l。

上述用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质的制备方法为：

A1、准备原料：10×M199培养液、L-谷氨酰胺溶液、重组IGF-1、重组VEGF、人血白蛋白溶液、重组ITGα9、重组ITGβ1、7.5wt％的碳酸氢钠溶液和I型人胶原蛋白溶液，均置于冰上备用；

A2、取10×M199培养液，按照上述比例依次加入L-谷氨酰胺溶液、重组IGF-1、重组VEGF、人血白蛋白溶液、重组ITGα9、重组ITGβ1、7.5wt％的碳酸氢钠溶液和I型人胶原蛋白溶液后混合均匀，即得胰岛存活基质；每加一种原料，均将混合液混合均匀后再加入下一个原料。

一种可皮下移植的胰岛：含有胰岛细胞和以上制备得到的胰岛存活基质。

该可皮下移植的胰岛的制备方法为：

S1、准备上述的胰岛存活基质并置于冰上备用；准备含有胰岛细胞的胰岛悬浮液，将胰岛悬浮液经离心后弃去上清，留胰岛细胞备用；后续实验是以B6系小鼠为实验对象，因此，本实施例中的胰岛细胞来源于B6系小鼠，该B6系小鼠来源的胰岛细胞以常规方法提取获得即可。

S2、将胰岛存活基质加入胰岛细胞内，并混合均匀，使得胰岛细胞均匀分散在胰岛存活基质内，即得到可皮下移植的胰岛，并置于冰上无菌保存。其中，S2中胰岛存活基质的添加体积和S1中胰岛悬浮液的体积相同。

实施例2

一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质，该胰岛存活基质的组分为：10×M199培养液91ml/l，L-谷氨酰胺233.6mg/l，重组IGF-1 5mg/l，重组VEGF 5mg/l，人血白蛋白1mg/l，I型人胶原蛋白2411.8mg/l，碳酸氢钠1.725mg/l，整合素亚基2.4mg/l：其中，重组ITGα90.4mg/l，重组ITGβ1 2.0mg/l。

上述用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质的制备方法为：

A1、准备原料：10×M199培养液91μl、L-谷氨酰胺溶液8μl、重组IGF-1溶液15μl、重组VEGF溶液15μl、人血白蛋白溶液50μl、重组ITGα9溶液10μl、重组ITGβ1溶液10μl、7.5wt％的碳酸氢钠溶液23μl和I型人胶原蛋白溶液778μl，均置于冰上备用；其中，重组IGF-1溶液中重组IGF-1含量为0.333mg/ml，重组VEGF溶液中重组VEGF含量为0.333mg/ml，重组ITGα9溶液中重组ITGα9含量为0.04mg/ml、重组ITGβ1溶液中重组ITGβ1含量为0.2mg/ml。

A2、取10×M199培养液，按照上述比例依次加入L-谷氨酰胺溶液、重组IGF-1、重组VEGF、人血白蛋白溶液、重组ITGα9、重组ITGβ1、7.5wt％的碳酸氢钠溶液和I型人胶原蛋白溶液后混合均匀，即得胰岛存活基质；每加一种原料，均将混合液混合均匀后再加入下一个原料。

一种可皮下移植的胰岛：含有胰岛细胞和以上制备得到的胰岛存活基质。

该可皮下移植的胰岛的制备方法为：

S1、准备上述的胰岛存活基质并置于冰上备用；准备含有胰岛细胞的胰岛悬浮液，将胰岛悬浮液经离心后弃去上清，留胰岛细胞备用；胰岛细胞来源同实施例1。

S2、将胰岛存活基质加入胰岛细胞内，并混合均匀，使得胰岛细胞均匀分散在胰岛存活基质内，即得到可皮下移植的胰岛，并置于冰上无菌保存。其中，S2中胰岛存活基质的添加体积和S1中胰岛悬浮液的体积相同。

实施例3

一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质，该胰岛存活基质的组分为：10×M199培养液110ml/l，L-谷氨酰胺260mg/l，重组IGF-1 8mg/l，重组VEGF 8mg/l，人血白蛋白15mg/l，I型人胶原蛋白3000mg/l，碳酸氢钠2.5mg/l，整合素亚基3.5mg/l：其中，重组ITGα90.5mg/l，重组ITGβ1 3.0mg/l。

上述用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质的制备方法为：

A1、准备原料：10×M199培养液、L-谷氨酰胺溶液、重组IGF-1、重组VEGF、人血白蛋白溶液、重组ITGα9、重组ITGβ1、7.5wt％的碳酸氢钠溶液和I型人胶原蛋白溶液，均置于冰上备用；

A2、取10×M199培养液，按照上述比例依次加入L-谷氨酰胺溶液、重组IGF-1、重组VEGF、人血白蛋白溶液、重组ITGα9、重组ITGβ1、7.5wt％的碳酸氢钠溶液和I型人胶原蛋白溶液后混合均匀，即得胰岛存活基质；每加一种原料，均将混合液混合均匀后再加入下一个原料。

一种可皮下移植的胰岛：含有胰岛细胞和以上制备得到的胰岛存活基质。

该可皮下移植的胰岛的制备方法为：

S1、准备上述的胰岛存活基质并置于冰上备用；准备含有胰岛细胞的胰岛悬浮液，将胰岛悬浮液经离心后弃去上清，留胰岛细胞备用；胰岛细胞来源同实施例1。

S2、将胰岛存活基质加入胰岛细胞内，并混合均匀，使得胰岛细胞均匀分散在胰岛存活基质内，即得到可皮下移植的胰岛，并置于冰上无菌保存。其中，S2中胰岛存活基质的添加体积和S1中胰岛悬浮液的体积相同。

实施例4

本实施例和实施例2的区别在于：本实施例中，整合素亚基2.4mg/l：其中，重组ITGα91.6mg/l，重组ITGβ1 0.8mg/l。

实施例5

本实施例和实施例2的区别在于：本实施例中，整合素亚基2.4mg/l：其中，重组ITGα90.3mg/l，重组ITGβ1 2.1mg/l。

实施例6

本实施例和实施例2的区别在于：本实施例中，整合素亚基2.4mg/l：其中，重组ITGα100.4mg/l，重组ITGβ3 2.0mg/l。

实施例7

本实施例和实施例2的区别在于：本实施例中，整合素亚基2.4mg/l：其中，重组ITGα100.2mg/l，重组ITGα9 0.2mg/l，重组ITGβ1 1.0mg/l，重组ITGβ3 1.0mg/l。

对比例

对比例1

本对比例和实施例10的区别在于：本对比例中，整合素亚基2.4mg/l：其中重组ITGα101.2mg/l，重组ITGα9 1.2mg/l。

对比例2

本对比例和实施例10的区别在于：本对比例中，整合素亚基2.4mg/l：其中重组ITGβ11.2mg/l，重组ITGβ3 1.2mg/l。

对比例3

本对比例和实施例8的区别在于：本对比例中制备胰岛存活基质的原料不含有整合素亚基。

性能检测试验

小鼠实验验证移植后胰岛调控血糖的能力

1.1、小鼠皮下胰岛移植模型的建立

取雄性B6系小鼠，单次注射170mg/kg的链脲佐菌素以诱导得到糖尿病模型(非空腹血糖>300mg/dl)。在糖尿病模型小鼠的下腹部皮肤横向切开0.3-0.5cm，用镊子扩大切口做成口袋状，用于后续的胰岛移植。于对照组小鼠(每组10只)和试验组小鼠(每组10只)腹部切口中分别注入胰岛细胞悬浮液360μl，其中，对照组小鼠内注入的胰岛细胞悬浮液的是以无菌水悬浮胰岛细胞获得的；试验组小鼠共有10组，注入的胰岛细胞悬浮液分别是实施例1-7和对比例1-3备得到的可皮下移植的胰岛；随后将腹部切口缝合。

1.2、对上述试验组和对照组的小鼠每日2次检测其非空腹血糖，连续2次血糖浓度<200mg/dl提示血糖恢复正常(胰岛移植成功)，连续2次血糖>300mg/dl提示胰岛移植失效。选择胰岛移植成功的小鼠进行后续操作；若是移植不成功则再次移植至成功即可。

移植胰岛细胞悬浮液一周后，切除每组对照组或试验组小鼠中5只小鼠的移植部位的皮肤，如果当天血糖升高到>300mg/dL提示血糖控制源于移植部位的胰岛；其余每组中的5只小鼠用于继续监测其血糖变化，具体结果见表1。

对实施例2试验组和对照组小鼠的移植部位的皮肤进行病理检测，具体进行的是HE染色和免疫组染色检测，观察胰岛的分布和胰岛素分泌情况，具体见图1和图2。

表1移植不同来源的可皮下移植的胰岛后小鼠的血糖

表1中对照组小鼠并未检测“未切除移植部位皮肤的小鼠在胰岛移植7天、15天、30天、60天和90天后的血糖”，并以“-”表示该情况。

从表1实施例1-7的数据结果中看出，将本申请的胰岛存活基质用于制备可皮下移植的胰岛时，该皮下可移植胰岛在移植后具有长达90天具有降低血糖的效果，使得小鼠血糖稳定在138-186mg/dl的范围内；说明该移植的胰岛细胞寿命长且功能良好。实施例2、实施例6-7的结果说明，在添加整合素亚基时，整合素α亚基选择为整合素α9亚基和/或整合素α10亚基，以及整合素β亚基选择为整合素β1亚基和/或整合素β3亚基均是可以实现效果的。

通过比较实施例2和实施例4-5的数据看出，在添加整合素亚基时，整合素α亚基和整合素β亚基的重量比建议在1:(1-6)的范围内，将进一步提高可皮下移植胰岛的降血糖效果，使得小鼠血糖稳定在138-158mg/dl的范围内。另外，实施例2和对比例1-2的数据也说明，在添加整合素亚基时，需要同时添加整合素α亚基和整合素β亚基，否则可皮下移植的胰岛，其仅仅在15天左右的时间内能够发挥其功能。这可能是因为整合素亚基在发挥作用时，是需要额外添加的整合素α亚基和整合素β亚基一起发挥作用，以实现有效的信号传导。进一步结合对比例3的数据，若是完全不添加整合素亚基，仅仅以血管内皮生长因子促进内皮血管生成，则可皮下移植的胰岛仅仅在一周内具有调控血糖的功能。由此看出，在本申请方案中，整合素亚基对保证可皮下移植的胰岛的存活时间的重要性。

而对照组中的所有小鼠均表现为血糖含量持续高于300mg/dl的水平，因此不存在针对“切除移植部位皮肤小鼠，当天血糖是否升高到>300mg/dl”这一情况的讨论，对照组小鼠均未能逆转糖尿病，表现为原发性胰岛无功能。而所有试验组小鼠均在切除移植部位皮肤后表现为当天血糖升高到>300mg/dl，糖尿病均复发，说明了小鼠的血糖得以控制是源于移植部位的胰岛细胞。

此外，图1中，对实施例2试验组小鼠和对照组小鼠的移植部位皮肤做HE染色显示：试验组中存在大量的健康胰岛细胞，周边可检测到大量的I型胶原蛋白包裹，而对照组中的胰岛形态几乎完全丧失。图2中的免疫组化检测表明，试验组的胰岛周边有大量的胰岛素和胰高血糖素表达。而对照组中检测不到2种激素的存在，该结果表明胰岛均已完全丧失。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种用于胰岛皮下移植的胰岛存活基质，其特征在于，所述胰岛存活基质包括以下组分：培养液80-110ml/l，L-谷氨酰胺200-260mg/l，胰岛素样生长因子-1 2-8mg/l，血管内皮生长因子2-8mg/l，保护剂8-15mg/l，胶原蛋白2000-3000mg/l，pH缓冲剂1.2-2.5mg/l，整合素亚基1-3.5mg/l；

所述整合素亚基是整合素α亚基和整合素β亚基的混合物。

2.根据权利要求1所述的胰岛存活基质，其特征在于，所述整合素α亚基和整合素β亚基的重量比为1:(4-6)。

3.根据权利要求1所述的胰岛存活基质，其特征在于，所述整合素α亚基选自整合素α9亚基和整合素α10亚基中的任意一种或两种。

4.根据权利要求1所述的胰岛存活基质，其特征在于，所述整合素β亚基选自整合素β1亚基和整合素β3亚基中的任意一种或两种。

5.根据权利要求1所述的胰岛存活基质，其特征在于，所述保护剂为人血白蛋白；所述胶原蛋白为I型胶原蛋白；所述培养液为M199培养液。

6.权利要求1-5任意一项所述胰岛存活基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将培养液、L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子-1、血管内皮生长因子、保护剂、整合素亚基、pH缓冲剂和胶原蛋白混合后配制得到所述胰岛存活基质。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所有原料和所述胰岛存活基质，均置于-4~0℃的环境中。

8.一种可皮下移植的胰岛，其特征在于，包括胰岛细胞和权利要求1-5任意一项所述的胰岛存活基质。

9.根据权利要求8所述的可皮下移植的胰岛，其特征在于，所述可皮下移植的胰岛采用包括以下步骤的方法制备得到：

S1、准备所述胰岛存活基质并置于-4~0℃的环境中备用；准备含有胰岛细胞的胰岛悬浮液，将所述胰岛悬浮液经固液分离后留细胞固体备用；

S2、将所述胰岛存活基质和所述细胞固体混合均匀，即得到可皮下移植的胰岛。