CN114699400B - 达格列净在制备预防或治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及达格列净在制备预防或治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用。本发明通过体外和动物实验研究探索钠‑葡萄糖协同转运蛋白抑制剂达格列净通过靶向OTUD1调控Notch2‑ICD蛋白稳定性在预防和治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用。发现达格列净具有抑制异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的作用；能抑制CD4+T细胞的激活和炎性细胞因子的分泌水平；靶向抑制OUTD1‑NICD作用轴，因此成为aGVHD潜在的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及达格列净在制备预防或治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用。
背景技术
异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem celltransplantation，allo-HSCT)是治疗血液系统多种良恶性疾病的有效方法，但是急性移植物抗宿主病(acute graf tversus host disease，aGVHD)作为allo-HSCT后最常见的并发症之一，严重影响了患者的生存率和生存质量。aGVHD主要发生在allo-HSCT后100天之内，是由供者的初始T细胞在促炎环境和抗原提呈细胞的作用下活化成为效应T细胞进而对靶器官造成损伤的的免疫反应，主要累及皮肤、肠道和肝脏等器官。在所有接受allo-HSCT的患者中，有30-50％的患者会发生aGVHD，约15％的患者会发展为重度aGVHD(III-IV级)。因此探索aGVHD的预防和治疗手段，是目前研究的热点，也是临床迫切要解决的科学问题。
达格列净是钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sodium dependent glucosetransporters 2，SGLT2)的抑制剂，是一类不依赖于胰岛素分泌的新型降糖药，已广泛用于糖尿病的治疗。研究显示达格列净还可以用于心力衰竭(heart failure，HF)的治疗，对于合并糖尿病的HF患者，疗效同样显著。研究报道达格列净对于免疫性疾病同样具有治疗作用，在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)中，Elmahdy等研究显示小鼠口服达格列净治疗抑制了MCP1/NF-κB/IL-18信号通路，减少了促炎因子的释放，降低了乳酸脱氢酶和C反应蛋白等炎性指标的表达水平，保留了肠道的完整性，缓解了了UC的发病。Liu等发现在小鼠腹主动脉瘤模型中，达格列净通过减少动脉中巨噬细胞、T细胞等炎症细胞的浸润以及抑制血管基质细胞的生成限制了腹主动脉瘤的发生发展。去泛素化酶OTUD1在肿瘤发生、病毒和真菌感染以及自身免疫性疾病中发挥调控作用，研究显示OTUD1通过调控Notch2-ICD的泛素化降解，抑制CD4+T细胞的激活以及炎性细胞因子的分泌，从而延长aGVHD小鼠的生存周期，改善其aGVHD症状。
aGVHD作为allo-HSCT后早期最凶险的并发症之一，大大限制了allo-HSCT的广泛应用。aGVHD的一线治疗糖皮质激素仅能使40％-60％左右的患者获得缓解，激素耐药及复发的aGVHD患者的治疗仍然是一大难题，但目前尚无公认的针对aGVHD的二线治疗。达格列净已被批准用于糖尿病和HF的治疗，既往研究仅显示其可以用于自身免疫性疾病UC和腹主动脉瘤的治疗，但目前暂无研究报道达格列净在aGVHD中的预防和治疗作用。供体OTUD1敲除可以显著改善小鼠aGVHD的发生发展，但OTUD1抑制剂及其在aGVHD中的应用至今尚没有被报道。
近年来，针对aGVHD的二线治疗以及新型的小分子抑制剂或药物治疗等，绝大多数都靶向CD4+T细胞，通过调控CD4+T细胞的激活、增殖以及炎性因子分泌等影响aGVHD的发生发展。达格列净对于溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病有显著疗效，但是其在aGVHD中的作用尚无研究报道。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供一种钠-葡萄糖协同转运蛋白抑制剂达格列净通过靶向OTUD1调控Notch2-ICD蛋白稳定性在allo-HSCT后aGVHD的预防和治疗中的应用。
本发明采用如下技术方案:
提供一种预防或治疗急性移植物抗宿主病的药物，包括所述的达格列净。
优选的，所述药物用于抑制CD4+T细胞的激活水平和CD4+T细胞炎性细胞因子的分泌水平。
优选的，所述药物用于抑制OTUD1与Notch2-ICD的结合。
优选的，所述药物还包括药学上可接受的载体。
进一步地，所述载体选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、膏剂及溶液剂和悬浮剂的一种或多种。
优选的，所述药物还包括添加剂。
进一步地，所述添加剂为抗氧化剂、防腐剂、增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂和表面活性剂中的一种或多种。
优选的，所述达格列净的给药剂量为1-100mg/kg。
优选的，所述药物的给药方式为口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射和肌肉注射中的一种或多种。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
1.该药物与OTUD1活性位点相结合。
2.该药物治疗抑制CD4+T细胞的激活水平。
3.该药物治疗抑制CD4+T细胞炎性细胞因子的分泌水平。
4.该药物治疗抑制OTUD1活性增加Notch2-ICD蛋白泛素化降解，抑制其蛋白水平，抑制OTUD1与Notch2-ICD的结合。
5.该药物治疗延长aGVHD小鼠生存周期，改善其aGVHD症状。
综上，本发明对于达格列净在小鼠aGVHD模型中对aGVHD的作用进行评估。发现达格列净具有抑制异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的作用；能抑制CD4+T细胞的激活和炎性细胞因子的分泌水平；靶向抑制OUTD1-NICD作用轴，因此成为aGVHD潜在的治疗药物。
附图说明
图1为OTUD1晶体结构(A)和Sitemap预测到的site1(白色球状)与催化三联体氨基酸残基空间位置(B)。
图2为达格列净对CD4+T细胞激活的抑制作用图，其中*代表P＜0.05。
图3为达格列净对CD4+T细胞炎性细胞因子分泌功能的抑制作用图，其中*代表P＜0.05，***代表P＜0.001。
图4为达格列净对OTUD1-NICD作用轴的的抑制作用图。
图5为达格列净与OTUD1预测的分子对接模式图；虚线表示π-π相互作用，蛋白以白色显示。图6为小鼠移植后的生存情况(A)和aGVHD评分(B)，1mg/kg和10mg/kg达格列净治疗组与对照组小鼠相比生存周期延长，aGVHD症状均较轻，其中*代表P＜0.05。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
1.生物信息技术虚拟筛选
采用Glide XP模式对L1000所有化合物进行基于分子对接的虚拟筛选，输出了化合物的作用途径、作用靶点、对接分数等相关信息，在上述结果的基础上进行蛋白-配体相互作用指纹图谱分析，筛选出OTUD1的抑制剂。
2.小鼠CD4+T细胞体外刺激实验
(1)预先用anti-CD3(2μg/mL)和anti-CD28(0.4μg/mL)抗体包被96孔板，4℃孵育过夜，使用前用1×PBS洗涤3遍；
(2)获取小鼠脾脏细胞，将浓度调整至1×108/ml；
(3)加入50μl/ml大鼠血清，混匀；
(4)加入50μl/ml isolation cocktail，混匀，室温静置10min；
(5)加入75μl/ml RapidSpheres(使用前混匀)，混匀，室温静置2.5min；
(6)将体积补足至要求，混匀，放入分选磁铁，室温静置2.5min；
(7)将管中液体沿同一方向倒入新管子中；
(8)重复(6)(7)步骤2-3次；离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清，采用适当体积含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬；
(9)将分选获得的CD4+T细胞铺入96孔板中，同时加入达格列净(5μM)，对照组加入DMSO，混匀后放入培养箱培养24h。
3.流式细胞术检测免疫细胞表型
3.1胞膜染色
(1)取出孔板，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(2)加入100μl CD16/CD32抗体封闭，混匀，4℃，20min；
(3)离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(4)加入100μl胞膜抗体，混匀，4℃，30min，避光；
(5)加入100μl 1×PBS洗涤，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(6)加入200μl 1×PBS洗涤，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(7)200μl 1×PBS重悬，上机检测。
3.2胞内染色
(1)取出孔板，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(2)加入200μl胞内刺激液(50ng/ml PMA+500ng/ml Ionomycin+10μg/mlBrefeldin A)，放入细胞培养箱培养4-6h；
(3)取出孔板，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(4)加入100μl CD16/CD32抗体封闭，混匀，4℃，20min；
(5)离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(6)加入100μl胞膜抗体，混匀，4℃，30min，避光；
(7)加入100μl 1×PBS洗涤，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(8)加入200μl 1×PBS洗涤，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(9)加入100μl固定/破膜液，4℃，30min，避光；
(10)加入100μl 1×固定/破膜缓冲液洗涤(10×固定/破膜缓冲液与ddH2O稀释完成)，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(11)加入200μl 1×固定/破膜缓冲液洗涤，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(12)加入100μl胞内抗体(由1×固定/破膜缓冲液洗涤配置)，混匀，4℃，30min，避光；
(13)加入100μl 1×PBS洗涤，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(14)加入200μl 1×PBS洗涤，离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(15)200μl 1×PBS重悬，上机检测。
4.细胞转染
(1)在6孔板中培养HEK293T细胞，生长密度约70％时可以进行瞬转；
(2)提前为细胞更换新鲜培养基；
(3)将目的质粒按照需要加入到DMEM高糖培养基中，混匀；
(4)1:1比例加入Lipofectamine 3000转染试剂，混匀，室温静置10-15min；
(5)将上述液体轻柔滴加到HEK293T细胞中，轻轻摇晃以混匀，将细胞放入
培养箱培养；
(6)6-8h后弃去上清，加入新鲜的DMEM高糖培养基；
(7)24h后加入100nM或500nM达格列净；
(8)48h收集细胞进行后续操作。
5.蛋白提取
(1)细胞收集至离心管或EP管中，1×PBS洗涤2次；
(2)吸尽上清，加入合适体积的RIPA或IP裂解液，提前1:100加入PMSF(泛素实验1:40加入NEM；免疫沉淀实验1:100加入PI cocktail)，吹打混匀，置于冰上，冰浴30min；
(3)细胞超声破碎仪进行超声(功率为10％，运行5s停2s)；
(4)离心，12000g，4℃，15min；
(5)吸取上清留存于新的EP管，加入0.2倍体积6×蛋白上样缓冲液，金属浴100℃，10min；
(6)冻存于-20℃。
6.免疫共沉淀
(1)在提取好的蛋白中加入标签beads(1％NP40 washing buffer洗涤2-3遍)，混匀，置于摇床上，4℃，过夜；
(2)1％NP40 washing buffer洗涤4-6遍；
(3)加入合适体积1×蛋白上样缓冲液，金属浴100℃，10min；
(4)冻存于-20℃。
7.免疫印迹
(1)制胶：制备合适浓度的SDS-PAGE胶；
(2)上样：将样品加入到上样槽中，两边加入1×蛋白上样缓冲液补足；
(3)跑胶：80V 30min之后转120V 60min；
(4)转膜：提前将PVDF膜浸泡在无水甲醇中激活，按照黑面—海绵垫—滤纸—胶—PVDF膜—滤纸—海绵垫—白面顺序放置转膜夹，转膜条件为200mA，90min(泛素试验为300mA，120min)；
(5)封闭：用1×TBST配置5％脱脂奶粉，然后将PVDF膜置于封闭液中室温封闭60min；
(6)一抗孵育：用1×TBST配置1％-3％BSA，按照说明书配置抗体，置于摇床上，4℃，过夜；
(7)洗膜：吸出一抗，加入1×TBST，置于摇床快摇10min，重复3次；
(8)二抗孵育：用1×TBST配置1％-3％BSA，按照说明书配置抗体，置于摇床上，室温，60min；
(9)洗膜：吸出二抗，加入1×TBST，置于摇床快摇10min，重复3次；
(10)显影：将ECL试剂盒的A液和B液按照1:1等体积混合，然后用1×PBS稀释至不同浓度，然后将A液和B液的混合液滴加到PVDF膜上，放入显影机器。
8.小鼠骨髓和脾脏细胞制备
(1)颈椎脱臼处死小鼠，75％酒精浸泡3min；
(2)在超净工作台中使用眼科剪和镊子取出小鼠的脾脏、下肢腿骨及脊柱，浸泡在RPMI-1640培养基中；
(3)使用毛玻璃玻片充分研磨脾脏，用研钵充分挤压研磨下肢腿骨及脊柱，采用200目滤网将细胞过滤至50ml离心管中；
(4)离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(5)加入适当体积1×红细胞裂解液，混匀，室温裂解5-8min，加入适当体积RPMI-1640培养基终止裂红；
(6)离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(7)采用适当体积1×PBS洗涤后再次经过200目滤网过滤；
(8)离心，1300rpm，4℃，5min，弃上清；
(9)采用适当体积1×PBS重悬，置于冰上，备用。
9.小鼠aGVHD模型建立
BALB/c(H-2d)小鼠作为受体鼠，C57BL/6(H-2b)小鼠作为供体鼠。实验开始前一周予庆大酶素水溶液清除受体鼠肠道细菌，受体鼠在移植前一天接受间隔4h的Co650cGy的清髓性辐照。移植当天输注C57BL/6来源的1×107骨髓细胞和5×106的脾脏细胞(总体积200μl)，建立aGVHD模型，移植后每天记录小鼠生存情况，每2-3天记录小鼠体重并进行aGVHD评分，aGVHD评分标准见表1。
表1异基因造血干细胞移植后小鼠aGVHD临床积分评分标准表
10.达格列净给药方式
达格列净(200mg/支)是TargetMol(USA)公司，采用溶剂(5％DMSO+30％PEG300+5％tween80+60％PBS)溶解，经0.22μm滤头过滤后分装于1.5ml无菌PBS的EP管中，充分混匀后置于-20℃冰箱保存。一般认为小鼠移植后7天左右可以观察到比较明显的aGVHD症状，因为从移植前1天至移植后10天通过每天一次腹腔注射达格列净(1mg/kg和10mg/kg)对小鼠进行预防和治疗，对照组小鼠注射空白对照溶剂。
11.统计学分析
所有数据均用均数±标准差表示，采用学生双尾t检验法进行两组均值比较；生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线，Log-rank检验比较组间差异。当P＜0.05时，表明两组之间有显著性统计学差异，为*；当P＜0.01时，为**；当P＜0.001时，为***。分析与作图均采用GraphPad Prism 7软件。
效果评价
1.该药物与OTUD1活性位点相结合
为了筛选OTUD1的抑制剂，本发明采用生物信息技术对L1000上市药物库中的2356种药物进行筛选。OTUD1的去泛素化酶活性位点为Asp317、Cys320和His431构成的催化三联体氨基酸残基(图1)。通过Sitemap软件预测得到两个结合位点，其中site1具有较高的成药性。与OTUD1的催化三联体氨基酸残基进行对照，发现与site1基本一致(图1)，因此选择site1作为结合位点进行虚拟筛选，结果显示达格列净可以与OTUD1活性位点相结合。
2.该药物用于抑制CD4+T细胞的激活
分选C57BL/6小鼠的CD4+T细胞，采用anti-CD3和anti-CD28抗体刺激24h，同时加入达格列净(5μM)处理。结果显示达格列净能显著降低激活的CD4+T细胞的比例(图1)。
3.该药物用于抑制CD4+T细胞炎性细胞因子的分泌
分选C57BL/6小鼠的CD4+T细胞，采用anti-CD3和anti-CD28抗体刺激24h，同时加入达格列净(5μM)处理。结果显示达格列净能显著减少CD4+T细胞IFN-γ、IL-2、IL-17A和TNFα细胞因子的分泌水平(图2)。因此认为达格列净对CD4+T细胞的异基因反应行具有显著的抑制功能。
4.该药物用于抑制OTUD1活性促进Notch2-ICD蛋白泛素化降解
利用HEK293T转染PCDH-OTUD1、Flag-NICD和HA-Ub质粒，转染后24h加入达格列净(100nM和500nM)，转染后48h提取总蛋白蛋白。结果显示无论是100nM还是500nM，达格列净均可显著抑制NICD的蛋白水平，增加其泛素化降解，抑制OTUD1与NICD的结合。
5.该药物与OTUD1分析对接模式图
采用了生物信息技术进行了达格列净与OTUD1结合模式预测，图5即为达格列净与OTUD1预测的分子对接模式图。
6.该药物治疗对小鼠aGVHD的作用
移植后约一周左右小鼠开始出现体重下降、弓背、耸毛、活动度下降等aGVHD症状并开始死亡。对照组小鼠于22内天全部死亡，1mg/kg和10mg/kg达格列净治疗组小鼠分别存活至移植后30天和40天左右，生存情况显著优于对照组。虽然小鼠体重差异不大，但对照组小鼠aGVHD评分显著升高(图4)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (3)
1.达格列净在制备预防或治疗急性移植物抗宿主病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制CD4+T细胞的激活水平和CD4+T细胞炎性细胞因子的分泌水平。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制OTUD1与Notch2-ICD的结合。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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