KR20050120712A

KR20050120712A - 세포 제제

Info

Publication number: KR20050120712A
Application number: KR1020057019282A
Authority: KR
Inventors: 가즈토모 이노우에; 위안쥔 구; 쇼이치로 스미
Original assignee: 가부시키가이샤 크리에이티브; 가즈토모 이노우에
Priority date: 2003-04-16
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2005-12-22
Also published as: EP1614436A1; AU2003277650A1; CN1764481A; WO2004091679A1; US20060246043A1; CA2522106A1

Abstract

본 발명은 환자에게 있어서 유용한 호르몬 또는 단백질 등의 생물학적 활성 인자를 분비하는 세포를, 폴리비닐 알코올 속에서 안정적으로 장기간 유지할 수 있는 세포 제제 및 그 세포 제제의 제조 방법, 및 그 세포 제제를 환자에게 투여함으로써 내분비·대사 질환, 혈우병, 뼈 질환 또는 암 등을 예방·치료하는 방법을 제공한다.

Description

세포 제제{CELLULAR PREPARATION}

본 발명은 인간 또는 동물용 의약품 조성물로서 유용한 세포 제제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 생체에 있어서 유용한 호르몬 또는 단백질 등의 생물학적 활성 인자를 생성·분비하는 세포 또는 유해한 물질을 해독하는 작용을 갖는 세포를, 안정적으로 장기간 유지하는 제제로서, 환자에게 투여함으로써, 내분비·대사 질환, 혈우병, 뼈 질환 또는 암 등의 예방·치료에 효과를 발휘하는 세포 제제에 관한 것이다.

바이오 인공 장기란, 생세포나 생체 조직 등을 함유하여, 환자에게 필요한 대사 기능, 구체적으로는 그 대사 기능을 담당하는 호르몬이나 단백질 등의 생물학적 활성 인자를 환자에게 공급함으로써, 환자의 질병을 예방 또는 치료하는 것을 목적으로 하는 장치이다. 면역 억제제에 의한 부작용이나 도너의 수요와 공급 등의 문제를 갖는 생체 장기 이식에 비하여, 바이오 인공 장기는 면역 격리막에 의해서 세포를 생체의 방어 기구로부터 보호할 수 있기 때문에, 면역 억제제를 필요로 하지 않고, 동종 이식 뿐만 아니라 이종 이식도 가능하다는 점에서 우수하다.

바이오 인공 장기는 그 속에 함유하는 세포 등의 종류를 바꿈으로써, 온갖 질환의 치료에 대응할 수 있다. 예를 들어 바이오 인공 췌도는 인슐린 분비 세포, 예를 들어 췌도 세포를 그 속에 갖고, 췌도 세포로부터 분비되는 인슐린 호르몬을 환자에게 공급하여 혈당치의 시정을 꾀하기 위해서 사용된다. 혈액 응고 인자 생산형 바이오 인공 장기는 그 내부에 혈액 응고 인자를 생산하는 간세포를 갖고 있고, VIII 인자나 XI 인자의 부족에 의해 혈액의 응고 장애를 갖는 혈우병의 치료에 사용되고 있다. 또한, 성장 호르몬 생산형 바이오 인공 장기는 그 내부에 성장 호르몬 (hGH) 분비 세포를 갖고 있고, 성장 호르몬의 분비 부족이 원인이 되어 발생되는 하수체 소인증 등의 치료에 사용되고 있다. 또한, 부갑상선 호르몬 및 에리트로포에틴을 각각 분비하는 세포를 바이오 인공 장기에 함유시킴으로써, 상피 소체 기능 저하증 및 빈혈과 같은 다른 질병도 치료할 수 있다.

바이오 인공 장기에는 여러 형상이 있다. 그 예로서, 세포를 고분자 중합체로 감싼 마이크로캡슐형 또는 매크로 캡슐형 등을 들 수 있다. 이들은 고분자 중합체가 갖는 강고한 가교 구조에 의해서, 그 속에 함유되는 세포를 생체의 방어 기구로부터 보호하고, 또한 고분자 중합체가 갖는 분자 투과능을 이용하여, 세포로부터 분비되는 호르몬 등을 생체에 공급하는 것을 특징으로 하고 있다.

매크로 캡슐형 인공 장기 등에 사용되는 고분자 중합체로서, 최근 폴리비닐 알코올 (이후 PVA 라고 약기한다) 이 주목되고 있다. PVA 는 종래부터 식품 업계나 의료 업계에서 사용되고, 구체적으로는 수술용 봉합 실이나 식품과 접촉하는 용기 등에 응용되어 왔다. 또한, PVA 를 인공 관절 연골 재료로서 사용하는 기술 (예를 들어 비특허문헌 1 참조) 이 지금까지 개시되어 있고, 임상면에서의 안전성에 관해서도 평가되어 있다 (예를 들어 비특허문헌 2 참조).

PVA 는 화학적 또는 물리적 처리를 행함으로써 겔화되고, 모든 형상으로 성형이 가능하다. 화학적 처리로서는 PVA 를 함유하는 수용액에 글루타르알데히드 (가교제) 및 염산 (촉매) 을 첨가하는 방법 (예를 들어 비특허문헌 3 참조), 또는 PVA 를 함유하는 수용액을 유리 플레이트 등에 도포하고, 이것을 Na₂SO₄/KOH 수용액에 침지하는 방법 (예를 들어 비특허문헌 4 참조) 등이, 또한 물리적 처리로서는 PVA 를 함유하는 수용액을 약 -80℃ 에서 급랭시켜 겔화하는 방법 등이 통상 사용된다. 그러나, PVA 를 매크로 캡슐형 인공 장기 등의 고분자 중합체로서 사용하는 경우에는 이들의 화학적 또는 물리적 처리의 필요성이 문제가 된다.

구체적으로는 PVA 를 화학적 처리에 의해 겔화하여 자루형의 PVA 겔막을 제작하고, 그 자루 내에 세포를 넣어 바이오 인공 장기를 제작한다는 방법이 있다. 그러나 이 방법에서는 자루의 시일링 처리나 PVA 겔막에 잔존한 가교제 등에 의해 세포가 데미지를 받거나, 자루 내의 세포가 응집함으로써 세포가 괴사하는 등, 생존 세포수의 감소 또는 생물 활성의 저하로 인한 호르몬 분비량의 저하를 부인할 수 없다.

물리적 처리는 약제를 사용하는 경우가 없고, 또한 PVA 겔 속에 세포를 분산시켜 포함할 수 있기 때문에, 응집 등으로 인한 세포의 괴사 우려가 없는 점에서 바람직하지만, -80℃ 에서 급랭시킬 때에 세포가 파괴될 우려가 있다.

바이오 인공 장기 내에 함유된 세포는, 환자에게 필요한 대사 기능을 발휘하는 생물학적 활성 인자를 안정적으로 공급할 수 있는 상태에 있는 것이 바람직하다. 따라서 PVA 는 그 특성으로부터 매크로 캡슐형 바이오 인공 장기 등에 적합한 고분자 중합체이기는 하지만, 그 응용 기술은 확립되지 않았다. 따라서 본 발명과 같이, PVA 가 갖는 특성을 이용하고, 또한 PVA 겔 내에서 세포를 안정적으로 유지할 수 있는 바이오 인공 장기는 지금까지 전혀 알려져 있지 않다.

특허문헌 1

고바야시 외 (Kobayashi M., et al.), 폴리비닐 알코올 하이드로겔제 인공 관절 연골의 예비 연구 (Preliminary study of polyvinyl alcohol-hydrogel (PVA-H) artificial meniscus), 바이오매터리얼즈 (Biomaterials), 2003년, 제24권, p 639-647

비특허문헌 1

비특허문헌 2

CC 데메르리스 외 (C.C.Demerlis et.al), 폴리비닐 알코올의 구강내 독성에 관한 조사 (Review of the oral toxicity of PVA), 푸드 앤드 케미컬 톡시콜로지 (Food and Chemical Toxicology), 2003년, 제41권, p 319-326

비특허문헌 3

크리스티나 B 외 (Krystyna Burczak et.al), 마이크로캡슐형 PVA 하이드로겔 인공 췌장의 생체내 장기 안정성과 생물학적 호환성 (Long-term in vivo performance and biocompatibility of PVA hydrogel macrocapsules for hybrid-type artificial pancreas), 바이오매터리얼즈 (Biomaterials), 1996년, 제17권, p 2351-2356

비특허문헌 4

타이-혼 영 외 (Tai-Horn Young et.al) 생체내 PVA 인공 췌장의 평가와 모델링 (Assessment and modeling of PVA bioartificial pancreas in vivo), 바이오매터리얼즈 (Biomaterials), 2002년, 제23권, p 3495-3501

도 1 은 시트상 췌도 세포 제제의 제조 방법을 나타내는 모식도이다.

도 2 는 제조예 1, 비교예 1 또는 유리 췌도 세포의 배양 1일 후의 생세포의 회수율을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.

도 3 은 제조예 1, 비교예 1 또는 유리 췌도 세포 중의 배양 1일 후의 인슐린 함유량을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.

도 4 는 제조예 1, 비교예 1 또는 유리 췌도 세포의 인슐린 분비능을 경시적으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5 는 제조예 1 또는 비교예 1 에 함유되는 췌도 세포를 경시적으로 관찰한 현미경 사진을 나타내는 도면이다.

도 6 은 제조예 2 또는 유리 췌도 세포의 인슐린 분비능을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.

도 7 은 이식 마우스군 및 당뇨병 마우스군의 생존 기간을 나타내는 도면이다.

도 8 은 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 혈당의 변화를 나타내는 도면이다.

도 9 는 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 체중의 변화를 나타내는 도면이다.

도 10 은 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 BUN (혈중 우레아질소) 의 변화를 나타내는 도면이다.

도 11 은 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 크레아티닌의 변화를 나타내는 도면이다.

도 12 는 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 24시간 요량의 변화를 나타내는 도면이다.

도 13 은 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 24시간 요당 배설량의 변화를 나타내는 도면이다.

도 14 는 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 요케톤체량의 변화를 나타내는 도면이다.

도 15 는 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 24시간 요알부민 배설량의 변화를 나타내는 도면이다.

도 16 은 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군 및 정상 혈당 마우스군의 1,5-AG량의 변화를 나타내는 도면이다.

도면 중의 부호 1 은 췌도 세포를, 2 는 PVA+EC 용액을, 3 은 PVA+EC 겔을, 4 및 6 은 메시 시트를, 5 및 7 은 유리 플레이트를, 8 은 시트상 췌도 세포 함유 제제를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은 세포 보존제를 배합한 PVA 를 함유하여, 그 PVA 속에 환자에게 있어서 유용한 호르몬이나 단백질 등의 생물학적 활성 인자를 생성·분비하는 세포를 갖고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명으로 사용되는 PVA 는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 어느 것이나 사용할 수 있는데, 예를 들어 안약의 각질 보호·보습제, 장관 유착 방지막 등의 의료용 재료나, 식품 포장 필름 등의 식품 접촉 재료로서 사용될 수 있을 정도의 순도를 갖는 것이 바람직하다. 또한 시판 중인 것이어도 되고, 아세트산비닐로부터 폴리아세트산비닐을 제조하고, 이것을 가수 분해함으로써 얻어지는 제조물의 동결 건조품이어도 된다. 또 PVA 를 제조하는 경우, 그 제조 방법 및 동결 건조 방법은 그 자체 공지된 기술에 따르면 된다. PVA 의 평균 중합 분자량은 약 5,000∼16,600 정도이고, 비누화도는 약 85% 이상인 것이 바람직하다.

이들의 PVA 는 미세한 입자상의 동결 건조품으로, 생리 식염수나 인산 버퍼 등의 용액에 용이하게 현탁할 수 있는 형상인 것이 바람직하다.

세포 보존제가 배합된 PVA 란, PVA 속에 세포 보존제를 함유하는 PVA 를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 세포 보존제는 특별히 한정되지 않지만, 통상 동물 세포 등의 보존에 사용되는 액제로서, 예를 들어 Euro-Collins 액 또는 세루반카 (SERUBANNKA code 630-01601: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka, Japan) 나 UW 액 (비아스판 ViaSpan: Bristol-Myers Squibb Company, USA) 등의 시판 중인 보존액이어도 된다. 이들은 시판 중인 것이어도 되고, 실험실 내에서 조제된 조성물 이어도 된다. 실험실에서 조제하는 경우에는 증류수 등에 각 조성 성분을 첨가·혼합하여, 필터 여과하거나 함으로서 제균하여 조제하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Euro-Collins 액의 조성은 표 1 과 같다.

성분	g/L
D-글루코오스	35.0
K₂HPO₄	7.4
KH₂PO₄	2.05
KCl	1.12
NaHCO₃	0.84
니코틴아미드	1.22

또한, UW 액 (비아스판) 의 조성은 표 2 와 같다.

성분	g/L
펜타프랙션 (주 1)	50
락토비온산	35.83
인산2수소칼륨	3.4
황산마그네슘	1.23
라피노스	17.83
아데노신	1.34
알로푸리놀	0.136
총글루타티온	0.922
수산화칼륨	5.61
수산화나트륨	pH 7.4 로 조정
주사용수	적량
주 1: 미국특허 제4,798,824호

PVA 속에 세포 보존제를 함유하는 PVA 는 예를 들어 PVA 와 세포 보존제를 혼합하여 제작할 수 있다. 또한 얻어지는 세포 보존제가 배합된 PVA 는 무균적인 것이 바람직하다. PVA 와 세포 보존제를 혼합하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 시판 중인 입자상 PVA 를 증류수 등에 현탁하고, 그 PVA 현탁액을 가열 멸균 (오토클레이브 등) 함으로써 용해·살균 처리하고, 얻어진 무균 PVA 수용액에 무균적으로 세포 보존제를 첨가·혼합하는 방법 등을 들 수 있다. 가열 멸균 처리나, 무균 조작은 그 자체 공지된 수단에 따르면 된다.

여기서, 상기 혼합 수단 및 그 이외의 어느 한 수단을 사용하여 제작된 세포 보존제를 함유하는 PVA 를, 세포 보존제로 처리된 PVA 라고 칭하기로 하면, 이 세포 보존제로 처리된 PVA 도 본 발명의 범위 내인 것은 물론이다.

또한 PVA 현탁 수용액과 세포 보존제를 혼합하여 얻어지는 혼합액 (이후, PVA-세포 보존제 용액이라고 칭한다) 중의 PVA 의 함유량은 PVA-세포 보존제 용액에 대하여, 통상 약 2∼5중량%, 보다 바람직하게는 약 2.5∼3.5중량%, 특히 바람직하게는 약 2.5∼3중량% 이다. 이는 그 농도역에 있어서 PVA 가 가장 겔화되기 쉽고, 또한 본 발명의 세포 제제의 세포를 포함하는 데에 바람직한 강도의 PVA 겔이 얻어지기 때문이다. 또한 PVA-세포 보존제 용액 속의 세포 보존제의 농도는 통상의 세포 보존에 사용하는 세포 보존제의 농도를 1배로 하면, 통상 약 0.8∼1배, 보다 바람직하게는 약 0.9∼1배, 특히 바람직하게는 약 0.95∼1배이다. 이는 그 농도역의 범위를 벗어나면, 세포가 안정적으로 생존할 수 없는 경우가 있기 때문이다. 따라서, 본 발명에 있어서는 통상의 세포 보존에 사용하는 농도의 약 2∼10배인 농축 세포 보존액을 조정 또는 구입하고, 이것과 상기 PVA 현탁 수용액을 적절히 (예를 들어, 10배 농축 세포 보존액:PVA 현탁 수용액=1:9) 혼합하여, 약 1배 농도의 세포 보존제를 함유하는 PVA-세포 보존제 용액을 제작하는 것이 바람직하다.

본 발명의 세포 제제에는 추가로, 세포의 보호를 목적으로 하여 디메틸술폭시드 (DMSO) 나 혈청 알부민 등이, 잡균의 혼입을 저지할 목적으로 항생 물질 등이, 또한 세포의 활성 유지를 위해 니코틴아미드 등의 비타민류 등이 함유되어 있어도 된다. 또 본 발명은 통상 제제에 첨가되는 것이 약사법상 허용되어 있는 다른 첨가 성분, 예를 들어 서방성 부여제, 등장화제, pH 조정제 등이 보충되어 있어도 된다. 이들 다른 첨가 성분의, 세포 제제에 대한 첨가 방법은 특별히 한정되지 않지만, 상기 PVA-세포 보존제 용액을 제작할 때에, 그 용액 속에 무균적으로 혼합되는 것이 바람직하다. 이들의 함유량은 본 발명에 포함되는 세포의 증식·생존 및/또는 생물학적 활성 인자의 분비 등을 저해하지 않는 범위로서, 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위인 것이 바람직하다.

세포 보존제로 처리된 PVA 는 상기 기술한 바와 같이 무균적으로 제조되는 점에서, 본 발명의 세포 제제는 잡균 등에 의한 오염의 확률이 낮고, 실온 (약 15∼35℃) 에서 장기간 보존이 가능하다.

본 발명에 사용되는 세포로서, 췌도 세포, 췌장 내분비 세포, 간세포, 전엽 세포, 성장 호르몬 분비 세포, 뼈 세포, 갑상선 호르몬 분비 세포 또는 부갑상선 호르몬 분비 세포 등을 들 수 있다. 이들의 세포는 인간, 돼지, 래트 또는 마우스 등의 포유 동물 유래로서, 환자에게 있어서 유용한 호르몬 또는 단백질 등의 생물학적 활성 인자를 생성·분비하는 세포인 것이 바람직하다. 세포 종류의 선택은 투여되는 환자의 질환의 종류에 따라 결정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 당뇨병 환자들에게는 인슐린을 생성하는 췌도 세포 또는 췌장 내분비 세포 등을, 혈우병 환자들에게는 혈관 응고 인자 등을 생성하는 간세포 등을, 하수체성 소인증 등의 환자들에게는 성장 호르몬을 생성하는 전엽 세포나 성장 호르몬 분비 세포 등을, 또한 골절 등의 뼈 질환 환자들에게는 뼈형성 단백질 (Bone Morphogenetic Protein: BMP) 을 생성하는 뼈 세포 등을 사용하는 것이 좋다. 암환자들에게는 유전자 재조합에 의해 종양 성장 억제 물질을 대량 생성할 수 있는 형질 전환 세포 등을 사용할 수도 있다. 또한 간부전, 신부전 또는 선천성 대사 이상 등에 의해 체내에 유독한 대사 산물이 축적되는 질환의 환자에 대하여는 유독한 대사 산물을 선택적으로 대사·해독하는 작용을 갖는 세포를 사용할 수도 있다. 환자가 복수의 질환을 갖는 등, 복수의 생물학적 활성 인자를 필요로 하는 경우에는 상기 세포를 2종 이상 조합해도 된다. 본 발명은 이들의 세포를 함유함으로써, 상기 환자들에게 유용한 생물학적 활성 인자를 공급할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 제제를 사용함으로써, 생물학적 활성 인자를 공급하는 것이나 유해한 대사 산물을 해독함으로써 치료가 가능한 여러 질환의 발증을 예방하거나, 치료할 수 있다.

본 발명에 사용되는 상기 세포는 실험실용으로 확립된 세포 또는 생체의 조직으로부터 분리한 세포 등의 어느 것이나 되지만, 분화된 비분열 세포인 것이 바람직하다. 왜냐하면 분화되지 않은 분열 세포보다, 분화된 비분열 세포가, 보다 목적으로 하는 호르몬이나 단백질 등을 생성·분비할 수 있기 때문이다.

생체 조직으로부터의 세포의 분리 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지된 기술에 따르면 된다. 예를 들어, 적절한 수단으로 적출한 조직을, Dispase 또는 EDTA 등으로 처리하고, 이어서 트립신 처리하여 단일 세포까지 분리하는 방법 등을 들 수 있다.

예를 들어 본 발명에 사용되는 세포가 췌도 세포인 경우, 이 세포의 생체 조직으로부터의 분리는, 공지된 콜라게나아제 처리에 의한 분리 방법, 예를 들어 J.Adam Van Der Vliet et al., Transplantation, 45(2), p 493-495 (1988) 등에 따르면 된다.

본 발명에 사용되는 세포가 췌장 내분비 세포인 경우, 예를 들어 일본 공개특허공보 2001-231548호에 기재된 방법 등에 따르면 된다.

상기한 바와 같이 생체 조직으로부터 분리된 세포는, 병원성 바이러스 등의 병원체가 제거되어 있는 것이 바람직하다.

실험실용으로 이미 확립된 세포 또는 생체 조직으로부터 얻어진 단일 세포는 적절한 배지에서 컨플루언트가 될 때까지 배양되고, 계대 배양을 2∼3회 반복하고 나서, 본 발명의 세포로서 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들어 본 발명에 사용하는 세포가, 췌도 세포 또는 췌장 내분비 세포 (이후 췌장 내분비 세포 등이라고 약기한다) 인 경우에는 이들 세포를, 예를 들어 10% 소 태아 혈청 (이후, FBS 라고 약기한다) 및 니코틴아미드를 보충한 CMRL-1066 배지 (Sigma, St.Louis, MO, USA) 에서 계대 배양하는 것이 바람직하다. 계대 배양된 세포는 트립신 처리 및 콜라게나아제 처리 등의 공지된 수단에 따라서, 다시 단일 세포로서 분리되어, 본 발명의 세포로서 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 사용되는 세포는 투여되는 환자에게 필요한 호르몬 또는 단백질 등의 생물학적 활성 인자 펩티드를 코드하는 유전자가 도입된 형질 전환 세포이어도 된다. 그 형질 전환 세포를 사용함으로써, 목적으로 하는 생물학적 활성 인자 펩티드를 효율적으로 또한 대량 생성할 수 있다. 생물학적 활성 인자 펩티드를 코드하는 유전자로서는 이미 그 염기 배열이 공개되어 있고, 아메리칸 타입 컬처 콜렉션 (American Type Culture Collection: ATCC) 등의 기탁 기관이나 일반의 시판원으로부터 용이하게 입수가 가능한 유전자, 또는 기지의 염기 배열로부터 올리고뉴클레오티드 프로브를 제작하고, 그 프로브를 사용하여, 예를 들어 PCR 증폭법, DNA 합성법의 공지된 수단을 사용하여 합성되는 유전자 등을 들 수 있다. 예를 들어, 종양 성장 억제 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 형질 전환 세포를 사용함으로써, 본 발명의 세포 제제를 암의 예방 및 치료제로서 사용할 수 있다.

상기 생물학적 활성 인자 펩티드를 코드하는 유전자가 도입되는 숙주 세포는 특별히 한정되지 않고, 통상 유전자 재조합 기술 분야에서 사용되는 공지된 숙주 세포를 사용하면 된다. 예를 들어 숙주 세포로서는 상기 췌도 세포, 췌장 내분비 세포, 간세포, 전엽 세포, 성장 호르몬 분비 세포, 뼈 세포 등 외에, 원숭이 세포 COS-7, Vero, 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO 세포라고 약기한다), dhfr 유전자 결손 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO (dhfr^-) 세포라고 약기한다), 마우스 세포 BALB/3T3, 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20, 마우스 C 127 세포, 마우스 미엘로마 세포, 래트 GH3, 인간 세포 HeLa, 인간 FL 세포 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 세포에 대한 상기 유전자의 도입 방법은 특별히 한정되지 않고 공지된 수단에 따르면 된다. 예를 들어, 플라스미드나 바이러스 등의 재조합 발현 벡터 또는 리포솜, 마이크로캡슐 등의 인공 벡터에 함유시켜 세포에 도입하는 등의 공지된 방법을 들 수 있다. 재조합 발현 벡터를 사용하는 경우에는 캄퍼턴트 세포법 [J.Mol.Biol., 53, p 154 (1970)], DEAE 덱스트란법 [Science, 215, p 166 (1982)], 인 비트로 패키징법 [Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 72, p 581 (1975)], 바이러스 벡터법 [Cell, 37, p 1053 (1984)], 마이크로 인젝션법 [Exp.Cell.Res., 153, p 347 (1984)], 일렉트로폴레이션법 [Cytotechnology, 3, p 133 (1990)], 인산칼슘법 [Science, 221, p 551(1983)], 리포펙션법 [Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 84, p 7413 (1987)], 프로토 플라스트법 [일본 공개특허공보 소63-2483942호, Gene, 17, p107, (1982), Molecular & General Genetics, 168, p 111 (1979)] 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

또한, 그 유전자를 숙주 세포에 도입하기 위한 벡터 등도 특별히 한정되지 않고 도입된 세포 내에서 원하는 유전자를 발현시켜, 생물학적 활성 인자펩티드를 유효하게 생성할 수 있는 발현 벡터이면 된다. 예를 들어, λ 파지 등의 박테리오 파지, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스 (AAV), 레트로 바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 렌치 바이러스 (HIV), 센다이 바이러스, 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 왁시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, 심비스 바이러스, SV40 등의 동물 바이러스 등 외, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등을 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 세포는 이하의 수법에 의해 PVA 속에 포함되는 것이 바람직하다.

상기에서 제작한 PVA-세포 보존제 용액 속에, 세포를 첨가·혼합한다. 첨가·혼합되는 세포는 미리 세포 보존제로 처리되어 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는 세포를 세포 보존제 속에 미리 현탁하고, 원심에 의해 세포를 회수한 후, PVA-세포 보존제 용액과 혼합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포 제제 중에 함유되는 세포의 개수는 그 세포 제제를 투여받는 환자의 질환의 종류 및 질환의 정도 등에 따라 상이하기 때문에 일률적으로는 말할 수 없고, 의사의 판단에 따라서 결정되는 것이 바람직하지만, 예를 들어 PVA-세포 보존제 용액 속, 바람직하게는 약 1×10⁷∼5×10⁷ cells/ml 이다. 세포수를 이 범위로 설정함으로써, 세포가 PVA 겔 내에서 균등하게 분산되고, 세포 응집 등에 의한 세포에 대한 산소 및 영양분의 공급이 저해되지 않고, 세포가 장기간 안정적으로 생존할 수 있다.

또한 본 발명에 사용되는 세포가, 그 생물학적 활성 인자를 최적으로 공급할 수 있는 상태에서 안정적으로 유지되기 위해서, 본 발명의 세포 제제는 추가로 히알루론산, 콘드로이틴황산, 더마탄산 등의 무코 다당, 엘라스틴, 콜라겐 및 피브린 등에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 세포외 매트릭스, 및/또는 간세포 증식 인자(HGF), 혈관 내피 세포 증식 인자 (VEGF), 인간 염기성 섬유아 세포 증식 인자 (bFGF), 섬유아 세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린형 성장 인자 (IGF) 또는 성장 호르몬 (GH) 등의 그로스 팩터 등을 함유하고 있어도 된다. 이들의 그로스 팩터는 1종 또는 2종 이상 함유되어 있어도 된다. 세포외 매트릭스 및/또는 그로스 팩터 등을 본 발명에 함유시키는 방법으로서는 예를 들어, 상기 PVA-세포 보존제 용액과 세포를 혼합하기 전에, 세포외 매트릭스 및 그로스 팩터를 함유하는 세포 배양 배지 등에 세포를 침지하고, 세포 표면에 세포외 매트릭스 등의 막을 형성시키거나, 또는 PVA-세포 보존제 용액에 미리 세포외 매트릭스 및/또는 그로스 팩터를 함유시키는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포 제제에 있어서의 상기 세포외 매트릭스 및/또는 그로스 팩터 등의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명에 사용되는 세포의 유지, 생물학적 활성 인자의 분비 기능을 저해하지 않는 범위로서, 세포의 생존 기간 및 생물학적 활성 인자의 분비 기간을 연장하는 효과를 부가할 수 있는 범위인 것이 바람직하다.

PVA-세포 보존제 용액과 세포를 혼합한 후, 얻어진 세포 혼합액 (이후, 세포 함유 PVA-세포 보존제 용액이라고 함) 을 냉각시키고, PVA 를 겔화함으로써 본 발명의 세포 제제를 제작할 수 있다. 냉각은 예를 들어 약 -20∼-80℃ 의 초저온고 등에서 약 12시간∼3일간 정치하거나, 약 -80℃ 의 초저온고에 약 18∼30시간 보존함으로써 실시하는 것이 좋다.

본 발명은 PVA 에 미리 세포 보존제가 배합되어 있기 때문에, 상기 온도에서 급랭시키더라도, 세포의 사멸이나 데미지를 억제할 수 있다. 더구나 PVA 겔 속에 세포를 분산시켜 함유할 수 있어, 세포의 응집 등을 방지할 수 있다.

PVA 가 겔화함으로써, 본 발명은 여러 형상, 예를 들어 시트상, 판상, 반상, 막대상, 튜브상 또는 비드상 등으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 함유 PVA-세포 보존제 용액을 유리 플레이트 상에 도말하고, 이 유리 플레이트마다 냉각시킴으로써, 박막 시트상의 세포 제제를 제작할 수 있다. 유리 플레이트 단위 면적 당 세포 함유 PVA-세포 보존제 용액 도말량을 적절히 변화시킴으로써, 원하는 두께를 갖는 세포 제제를 제작할 수 있는데, 통상은 약 100∼300㎕/㎟ 이다.

본 발명의 세포 제제는 그 보강 또는/및 조작성의 간편화를 위해서, 보강재와 조합하여 사용해도 된다. 예를 들어, 세포 제제를 박막 시트상으로 하는 경우에는 그 보강 및 조작성의 간편화를 위해서, 상기 세포 함유 PVA-세포 보존제 용액을 수지제 메시 시트 등에 고정하여 겔화하는 것이 좋다. 구체적으로는 도 1 에 있어서, 예를 들어 PET (폴리에틸렌테레프탈레이트) 수지제 메시 시트 (4) 를 유리 플레이트 (5) 상에 설치하고, 이 메시 시트 (4) 상에 세포 함유 PVA-세포 보존제 용액을 도포한다. 별도의 메시 시트 (6) 를 위로부터 씌우고, 다시 그 위로부터 별도의 유리 플레이트 (7) 를 씌워, 세포 함유 PVA-세포 보존제 용액과 메시 시트 (4) 와 시트 (6) 을, 유리 플레이트 (5) 와 유리 플레이트 (7) 사이에 끼운다. 그대로 약 -20∼-80℃ 에서 냉각시킴으로써 시트상 겔로 성형할 수 있다. 또한 상기 메시 시트는 미리 PVA-세포 보존제 용액에 침지해 두는 것이 바람직하다.

상기 보강재, 예를 들어 메시 시트는 생체에 있어서 안전한 소재, 요컨대 생체 내에서 비분해성으로서 생체 적합성이 우수한 소재, 예를 들어 PET 등인 것이 바람직하다. 이는 생체 내에서 본 발명의 세포 제제 중의 메시 시트가 분해되면, 그 세포 제제가 생체 조직에 유착되어, 본 발명의 효과를 장기간 나타내기가 어려워질 뿐만 아니라, 생체에 대해서도 유해해질 수 있는 경우가 있기 때문이다. 물론, 생체 내에서 분해되어도 생체에 유해하지 않은 보강재도, 본 발명에 사용될 수 있음은 물론이다.

냉동 상태의 세포 제제는 냉동 상태에 있는 세포를 활성화시킨 후에 생체에 투여되는 것이 바람직하다. 냉동 세포 제제 중의 세포의 활성화는 세포를 해동하여, 적절한 배지에서 재배양함으로써 행할 수 있다. 구체적으로는 약 37℃ 의 세포 배양 배지, 예를 들어 CMRL-1966 등에 냉동 상태의 세포 제제를 신속하게 침지하여 해동한 후, 더욱 새로운 세포 배양 배지에서, 예를 들어 약 24시간 배양함으로써 행한다. 그 세포 제제에 DMSO 가 함유되는 경우에는 해동된 세포 제제를 새로운 세포 보존액, 예를 들어 UW 액 등을 사용하여 세정한 후, 다시 UW 액 속에서, 예를 들어 약 4℃, 약 24시간 침지함으로써, 겔 속의 DMSO 를 제거하는 것이 바람직하다. 말할 필요도 없지만, 상기한 바와 같이 해동되어, DMSO 가 제거된 세포 제제도 본 발명의 세포 제제이다.

상기 방법에 의해 얻어지는 세포 제제의 생체에 대한 투여 형태는 투여되는 환자의 질환의 종류, 질환 부위, 질환의 정도에 따라 달라지기 때문에 일률적으로 말할 수 없고, 의사의 판단에 따라서 결정되지만, 바람직한 투여 형태를 이하에 기술한다.

본 발명의 세포 제제를 투여하는 대상은 인간을 비롯하여, 개, 고양이, 원숭이, 토끼 및 마우스 등의 인간 이외의 포유 동물이다.

본 발명은 상기 기술한 바와 같이, 생체 내의 투여 부위에 적합한 형상으로 성형되어 투여할 수 있다. 또한 본 발명은 질환을 갖는 조직에 직접 접촉하는 상태에서 투여 부위에 이식되어도 되지만, 비교적 경미한 침습으로 투여할 수 있는 피하 또는 근육 내에 이식할 수도 있다. 예를 들어, 튜브상의 그 세포 제제를 미세하게 절단하여, 이식 바늘 등을 사용하여 피하에 이식하거나, 주사기 등에 그 세포 제제를 충전하여, 근육 내 또는 피하에 주입할 수도 있다. 더구나 그 부위로부터의 세포 제제의 회수도 용이하다. 피하나 근육 내 등에 그 세포 제제를 이식할 때, 이식 부위의 혈관 분포 밀도가 소(疏)이고, 세포가 증식·생존하기 위한 산소 및 영양분의 공급이 곤란하다고 생각되는 경우에는 공지된 적절한 혈관 신생 유도제 등을 복합시켜 이식할 수도 있다. 혈관 신생 유도제는 세포 제제 중에 미리 함유시켜 두어도 되고, 세포 제제와는 별도의 형태로 투여되어도 된다.

본 발명의 세포 제제로부터 환자에게 공급되는 호르몬이나 단백질 등의 생물학적 활성 인자의 양은, 사용되는 세포의 생물학적 활성 인자의 분비능 및 이식 기간 중의 세포 생존율의 추이 등을 고려하여, 의사의 판단에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 환자의 질환이 당뇨병인 경우, 사용되는 세포, 예를 들어 췌장 내분비 세포 등의 인슐린 분비능을 시험관내 (in vitro) 에서 미리 측정해 두고, 그 인슐린 분비능, 세포수, 투여 기간 및 세포의 생존율의 추이 등으로부터, 본 발명의 세포 제제의 인슐린 공급량을 결정할 수 있다. 본 발명의 세포 제제는 함유하는 세포를 안정적으로 장기간 유지할 수 있기 때문에, 시간 경과에 따른 생물학적 활성 인자의 분비능의 저하율이 낮다. 따라서 본 발명을 사용하면, 환자에게 필요로 되는 생물학적 활성 인자를 장기간 안정적으로 환자에게 공급할 수 있고, 세포 제제의 이식의 빈도도 적게 할 수 있다.

본 발명의 세포 제제에 사용되는 세포의 생물학적 활성 인자의 분비능은 각각의 생물학적 활성 인자의 측정에 적합한 공지된 정량 방법에 따르면 된다. 예를 들어, 세포가 췌장 내분비 세포 등인 경우의 인슐린의 정량 방법에 관해서는 이하의 실시예에서 상세히 설명한다.

발명의 개시

본 발명은 인간 또는 동물용 의약품 조성물로서 유용한 세포 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는 환자에게 있어서 유용한 호르몬 또는 단백질 등의 생물학적 활성 인자를 분비하는 세포를, 바이오 인공 장기에 사용되는 고분자 중합체로서 적절한 재료인 PVA 속에서 안정적으로 장기간 유지할 수 있는 세포 제제 및 그 세포 제제의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 그 세포 제제를 환자에게 투여함으로써, 내분비·대사 질환, 혈우병, 뼈 질환 또는 암 등의 예방·치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 미리 PVA 를 세포 보존제, 예를 들어 Euro-Collins 액, 세루반카 또는 UW 액 등으로 처리한 후에 세포와 혼합하여 겔화시킴으로써, PVA 겔 속의 세포의 사멸률이나 데미지를 저감할 수 있어, PVA 속에서 세포가 안정적으로 유지되는 것을 발견하였다. 보다 구체적으로는 분체의 PVA 를 액상 세포 보존제로 용해하여 PVA-세포 보존제 혼합액을 제작 후, 그 혼합액 속에 세포를 분산시키고 급랭시켜, PVA 를 겔화시킴으로써, PVA 속의 세포의 생존율 및 생물학적 활성 인자 분비 기능의 저하가 억제되는 것, 나아가서는, 안정적으로 장기간 환자에게 호르몬 또는 단백질 등을 공급할 수 있는 세포 제제가 얻어지는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이러한 지견에 기초하여 더욱 검토를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은

(1) 세포 보존제가 배합된 폴리비닐 알코올 속에, 세포를 함유하는 세포 제제,

(2) 세포 표면이 추가로 세포외 매트릭스로 덮어져 있는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 세포 제제,

(3) 추가로 그로스 팩터를 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 세포 제제,

(4) 세포가 췌도 세포, 췌장 내분비 세포, 간세포, 전엽 세포, 성장 호르몬 분비 세포, 뼈 세포, 갑상선 호르몬 분비 세포 및 부갑상선 호르몬 분비 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제,

(5) 세포가 세포 보존제로 처리되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제,

(6) 세포가 형질 전환체인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제,

(7) 시트상, 판상, 막대상, 튜브상 또는 비드상의 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제,

(8) 세포 보존액이 Euro-Collins 액, 세루반카 또는 UW 액인 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제,

(9) 포유 동물의 피하, 근육 내 또는 복강 내에 이식하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(8) 에 기재된 세포 제제,

(10) 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 내분비·대사 질환의 예방 및 치료 방법,

(11) 내분비·대사 질환이 당뇨병 또는 하수체성 소인증인 것을 특징으로 하는 상기 (10) 에 기재된 내분비·대사 질환의 예방 및 치료 방법,

(12) 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 혈우병의 예방 및 치료 방법,

(13) 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 뼈 질환의 예방 및 치료 방법,

(14) 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료 방법,

(15) 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 간부전 또는 선천성 대사 이상의 예방 및 치료 방법,

(16) 폴리비닐 알코올에 세포 보존제를 배합한 후, 세포를 그 폴리비닐 알코올에 혼합하고, 얻어진 세포 함유 폴리비닐 알코올을 겔화하는 것을 특징으로 하는 세포 제제의 제조 방법,

(17) 인간 또는 동물용 의약인 상기 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 세포 제제,

에 관한 것이다.

이하에, 실시예 등을 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하겠지만, 말할 필요도 없이, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다. 또, 「%」 는 모두 「질량%」 을 나타낸다.

실시예 1

[제조예 1] 췌도 세포를 함유하는 시트상 세포 제제의 제조

(1) 췌도 세포의 조제

8∼10주령, 체중 300∼350g 의 Wister 래트 (Shimazu animal Co.Ltd. Kyoto, Japan) 로부터, 이하의 방법에 따라 췌도 세포를 분리하였다.

우선 적출한 래트 췌장의 췌관 내에, I형 콜라게나아제 (Sigma, St.Louis, MO, USA, 350U/mg) 및 XI형 콜라게나아제 (Sigma, St.Louis, MO, USA, 2,200U/mg) 를 각각 800U/ml 및 1500U/ml 의 농도로 함유하는 행크 용액 10ml 를 주입하여, 37℃ 에서 15∼20분간 효소 처리하였다. 냉각 행크 용액을 첨가하여, 효소 반응을 정지시켰다. 피펫을 사용하여 췌장 조직을 분산시키고, 원심에 의해 조직 펠릿을 회수한 후, 행크 용액으로 조직 펠릿을 2회 세정하였다. 그리고, 원심은 1,000rpm, 1분간으로 하였다. 조직 현탁액을 800μm 사이즈의 메시 시트를 사용하여 여과하였다. 여과액을 50ml 코니칼 튜브에 회수하여 원심 (1500rpm, 3분간) 하여 조직 펠릿을 얻었다. 그 펠릿을 27% 덱스트란 (Sigma, St.Louis, MO, USA, MW 70.000) 을 포함하는 행크 용액에 현탁하여 불연속 밀도 구배 원심 처리하였다. 이 때, 최하층을 27% 덱스트란 (밀도 1.094g/ml), 상층을 23% 덱스트란 (밀도 1.081g/ml) 및 11% (밀도 1.041g/ml) 덱스트란의 2층으로 하였다. 불연속 밀도 구배 원심은 400rpm 에서 4분간, 다시 1,700rpm 에서 10분간 행하였다. 원심 후, 최상 2층의 계면으로부터 췌도 세포 함유 획분을 패스 툴 피펫을 사용하여 채취하였다. 얻어진 췌도 세포를 CMRL-1066 배지를 사용하여 2회 세정하였다 (1,000rpm, 3분간).

(2) PVA-Euro-collins 용액의 제작

PVA 3g (군세사 제조: PVA-180H, Lot37435) 을 75ml 의 증류수에 현탁한 후, 오토클레이브 (121℃, 15분) 에 의한 가열 용해 멸균 처리를 2회 행하였다. 얻어진 무균 PVA 수용액에, 10배 농도 Euro-collins 용액 (이후, EC 용액이라고 약기한다) 10ml, DMSO 5ml, FBS 10ml 및 0.122g 니코틴아미드를 무균적으로 혼합·교반하여, 무균 3% PVA-EC 용액 100ml 을 얻었다. 상기 10배 농도 EC 용액은 증류수 100ml 에, 표 1 에 나타내는 성분을 첨가·혼합한 후, 0.22μm 의 여과 제균을 행하여 제작하였다. 제작 후에는 실온에서 보존하였다.

(3) 세포의 혼합

(1) 에서 얻어진 췌도 세포를, 더욱 10% FBS 및 1.22g/L 니코틴아미드를 함유하는 CMRL-1066 배지를 사용하여, 탄산 가스 인큐베이터 (5% CO₂, 37℃) 를 이용하여 24시간 배양하였다. 1,000개의 췌도 세포를 함유하는 배양액을 1.5ml 용량 원심 튜브 내에 넣어, 800rpm 로 1분간 원심하였다. 얻어진 세포 펠릿에 세루반카 (SERUBANNKA code 630-01601: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.Osaka, Japan) 0.1ml 를 첨가하여, 세포를 현탁한 후 5분간 방치하였다. 다시 원심하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를, (2) 에서 제작한 무균 3% PVA-EC 용액 100㎕ 속에 현탁하여 췌도 세포 함유 PVA-EC 용액을 얻었다.

(4) 시트의 형성

가로세로 10mm×10mm 의 PET 제 메시 시트 (군세사 제조: TNO60SS) 2장을 미리 무균 3% PVA 수용액에 5분간 침지하고, 이 중의 한 장 (4) 을 유리 플레이트 (5) 상에 설치하였다. 상기 (3) 에서 얻어진 췌도 세포 함유 PVA-EC 용액을 상기 메시 시트 (4) 상에 균일하게 도포하고, 또 한 장의 메시 시트 (6) 를 위로부터 씌워, 메시 시트 (4)-췌도 세포 함유 PVA-EC 용액-메시 시트 (6) 의 3층 구성 시트로 하였다. 다시 위로부터 별도의 유리 플레이트 (7) 를 씌우고, 압력을 가하여 약 1mm 두께의 3층 구성 시트가 되도록 조정하고, 이것을 2장의 유리 플레이트 사이에 낀 상태 그대로 -80℃, 24시간 보존하여 PVA 를 겔화시켰다 (도 1).

(5) 시트상 췌도 세포 제제의 해동 및 세포의 활성화

상기 (4) 에서 얻어진 동결 시트상 췌도 세포 제제를, 37℃ 의 CMRL-1066 배지 속에서 빠르게 해동시켰다. 해동된 시트상 췌도 세포 제제를, 5ml 의 UW 액 (비아스판 ViaSpan: Bristol-Myers Squibb Company, USA) 속에 5분간 침지하였다. 이 조작을 3회 반복하여 그 시트 내에 함유되는 DMSO 를 제거하였다. 그 시트를 다시 5ml 의 UW 액 속에서, 4℃, 24시간 침지하였다. 침지 후의 그 제제를 CMRL-1066 배지에서 2회 세정 후, 다시 CMRL-1066 배지 속에서 24시간 (37℃, 5% CO₂) 배양하여, 세포가 활성화된 시트상 췌도 세포 제제 (제조예 1) 를 얻었다. 얻어진 제조예 1 을 이후의 시험예에 사용하였다. 그리고, 상기 (2) 에서 10배 농도 EC 용액 10ml, DMSO 5ml, FBS 10ml 및 0.122g 니코틴아미드를 첨가하지 않은 무균 3% PVA 수용액을 제작하고, 이것을 사용하여 제조한 시트상 췌도 세포 제제를 비교예 1 로 하였다.

[시험예 1] 제제 중의 세포의 안정성 확인

상기 제조예 1, 비교예 1 또는 유리된 췌도 세포 (200개) 를, CMRL-1066 배지 속에서 배양하였다 (5% CO_2,37℃). 배양 1일 후의 제조예 1 또는 비교예 1 중의 생세포수 및 유리된 췌도 세포수를 각각 현미경 하에서 카운트하여, 생세포의 회수율 (%) 을 구하였다. 회수율은 배양 전의 세포수를 100 으로 하여 나타내었다.

도 2 에 결과를 나타낸다. 제조예 1 의 생세포의 회수율은 약 82% 로, 비교예 1 의 회수율 (약 35%) 에 비하여 매우 높고, 그 값은 유리 세포의 경우보다 높은 값이었다.

[시험예 2] 제제 중의 인슐린 함유량의 확인

상기 제조예 1, 비교예 1 또는 유리된 췌도 세포 (200개) 를 CMRL-1066 배지 속에서 배양하여 (5% CO₂, 37℃), 배양 1일 후의 각각의 인슐린 함유량을 조사하였다. 배양 1일 후의 제조예 1, 비교예 1 또는 유리된 췌도 세포를 염산-EtOH 에 회수하고, 스파테르 등을 사용하여 각각 갈아 으깨고, 이어서 볼텍스로 제제 중의 겔 및 세포를 염산-EtOH 중에 교반·현탁하였다 (-20℃, 24시간). 각각의 세포 현탁액 속의 인슐린 농도를 측정하였다. 인슐린은 시판 중인 인슐린 측정 ELISA 키트 (레비스 인슐린 키트 (시바야기 (주))) 를 사용하여 측정하였다.

결과를 도 3 에 나타낸다. 제조예 1 중의 인슐린 함유량 (약 205ng/ml) 은 비교예 1 (약 20ng/ml) 에 비하여 현저히 높은 값을 나타내고, 그 값은 유리 세포와 거의 같은 정도이었다.

[시험예 3] 제제의 인슐린 분비능 및 세포의 상태 확인

상기 제조예 1, 비교예 1 또는 유리된 췌도 세포 (200개) 를 CMRL-1066 배지 속에서 배양하고 (5% CO₂, 37℃), 배양 1일 후, 7일 후, 14일 후에, 각각을 회수하였다. 회수 후, 각각에 대하여 글루코스 반응 시험을 하였다. 글루코스 반응 시험은 이하와 같다. 우선, 상기 회수한 제조예 1, 비교예 1 또는 유리된 췌도 세포를 3.3mM 의 글루코스 및 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) 을 함유하는 CMRL-1066 배지 속에서 1시간 배양 (5% CO₂, 37℃) 후, 글루코스를 함유하지 않은 CMRL-1066 배지에서 세정하였다. 다시 이 조작을 반복하고, 다시 3.3mM 의 글루코스를 함유하는 CMRL-1066 배지 속에서 1시간 배양한 후, 각각의 상등액 속의 인슐린 농도를 측정하였다. 이어서 16.7mM 의 글루코스를 함유하는 CMRL-1066 배지에서 1시간 배양하여 각각 상등액 속의 인슐린 농도를 측정하였다.

결과를 도 4 에 나타낸다. 도 4 중 (a) 는 배양 1일 후, (b) 는 배양 7일 후, (c) 는 배양 14일 후의 인슐린 분비량 (농도) 을 각각 나타낸다. 비교예 1 에서는 글루코스 농도의 상승에 의존한 인슐린 분비량의 상승은 관찰되지 않았다. 이에 비하여, 제조예 1 은 배양 1일 후, 7일 후, 14일 모두, 글루코스 농도의 상승에 의존하여 인슐린 분비량 (농도) 이 상승하였다. 더구나 유리 세포에서는 이미 7일 후에 글루코스 농도에 의존한 인슐린 분비량의 상승이 관찰되지 않게 되었는데 비하여, 제조예 1 에서는 14일 후에도 그 상승이 관찰되었다.

또한, 제조예 1 또는 비교예 1 중에 함유되는 세포를 현미경 관찰한 결과, 비교예 1 중의 세포는 1일째부터 이미 세포 파괴가 일어나고 있었다. 이에 비하여 제조예 1 중의 세포는 현저한 세포 파괴가 관찰되지 않고, 14일 후에도 비교적 안정적으로 생존하고 있었다 (도 5). 도 5 중, (a) 는 배양 1일 후, (b) 는 배양 7일 후, (c) 는 배양 14일 후의 세포 관찰 이미지를 각각 나타낸다.

이상의 결과로부터, 제조예 1 중에 있어서 췌도 세포는 안정적으로 생존하여, 장기간 안정적으로 그 활성을 유지하고, 글루코스 농도의 상승에 반응하여 인슐린을 분비하는 것을 알 수 있었다. 따라서, PVA 에 미리 EC 용액을 배합함으로써, PVA 겔화시의 급랭에 의한 세포의 사멸 및 세포에 대한 데미지가 억제되고, 그 결과, PVA 속에 함유되는 췌도 세포의 생존율이 높고, 또한 인슐린 생성능 및 글루코스 농도의 상승에 대한 반응성을 유지할 수 있는 세포 제제를 제조할 수 있음이 증명되었다.

실시예 2

[제조예 2]췌도 세포를 함유하는 시트상 세포 제제의 제조

(1) 췌도 세포의 조제

Wister 래트를 디에틸에테르의 흡수 및 넴뷰탈 1mg/kg 의 복강 내 투여로 전신 마취시켰다. 개복한 후, 총담관을 동정해고, 이것을 베이터 (Vater) 유두부 부근에서 무구겸자에 의해 클램프하였다. 담낭관 합류부에 작게 절개한 부분을 두고, 캐뉼레이션 튜브를 총담관에 삽입, 결찰 고정시키고, 1200∼1500u/ml 상당의 XI형 콜라게나아제 (Sigma, St.Louis, MO, USA) 를 주입하여 췌장을 팽화시켰다. 췌장을 손상시키지 않도록 전적(全摘)하고, 플라스크에 넣어, 37℃ 의 항온조 속에 담그고, 18분 전후에서 온소화(溫消化)시켰다. 소화 후, 수회 플라스크를 진탕하여 췌장을 파쇄하고, 0.1% 소 혈청 알부민을 첨가한 행크 용액으로 3회 세정하였다. 행크 용액 속에 세포를 부유시킨 후, 850μm 직경의 메시 필터에 통과시켜 여과한 내용물을 회수하였다.

췌도 분리는 덱스트란 (Dextran 70) 의 비중 구배에 의해 행하였다. 즉, 상등액을 파기한 췌세포 성분을 비중 1.094 의 덱스트란+행크 용액에 균일해질 때까지 교반한 후, 비중 1.094 의 덱스트란액을 조용히 유입시켰다. 세포층 위에 비중 1.081 및 1.041 의 덱스트란액을 순차적으로 조용히 넣고 4층으로 하였다. 400rpm 으로 4분, 다시 1700rpm 으로 13분 원심시켰다. 1층째와 2층째 사이에 분리된 췌도를 핸드픽으로 회수하여 세정한 후, 핸드픽으로 순화시켰다. 4회 세정 후, 37℃, 5% CO₂ 95% 공기의 환경 하에서의 인큐베이터 속에서 하룻밤 배양시켰다. 배지는 CMRL 1066+10% 불활화 소 태아 혈청 + antibiotic-antimycotic solution (Gibco, BRL) + 니코틴아미드를 사용하였다.

(2) 시트상 췌도 세포 제제의 조제

상기에서 얻어진 췌도 세포의 배양액을 사용하여, 실시예 1 에 있어서의 제조예 1 의 (2), (3), (4) 및 (5) 와 동일하게 하여 세포가 활성화된 시트상 췌도 세포 제제 (제조예 2) 를 얻었다.

[시험예 4] 제제의 인슐린 분비능

상기에서 얻은 췌도 세포 제제 (제조예 2, 제작 후 1일째의 것) 또는 유리된 췌도 세포에, 시험예 3 과 동일하게, 저농도 글루코스 (3.3mm) 와 고농도 글루코스 (16.7mM) 에 의한 자극을 1시간씩 가하여, 분비되는 인슐린량을 ELISA 로 측정하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다. 이 도 6 으로 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 관한 췌도 세포 제제는 글루코스 자극에 따라 인슐린을 분비하고, 동 시기에 유리된 췌도 세포와 비교하여 손색이 없었다.

[시험예 5] 이식 시험

(1) 당뇨병 모델 마우스의 제작

8∼10주령의 수컷 C 57 BL/6 마우스에게, 시트르산 완충액 (pH 4.5) 에 용해한 스트렙토조토신 200mg/kg 을 복강 내 투여하였다. 투여 후 1주간에서 혈당을 3회 측정하고, 2회 이상 혈당 350mg/dl 이상이 된 마우스를 당뇨병이 성립된 것으로 판단하여 실험에 사용하였다. 또, 스트렙토조토신을 투여하지 않은 마우스를 정상 마우스군으로 하였다.

(2) 이식

췌도 세포 제제의 이식은 다음과 같이 하여 행하였다. 즉, 당뇨병 모델 마우스 (당뇨병 작성 후 1주 이상의 것) 를 에테르 마취 하에서 정중 절개에 의해 개복하고, 상기 제조예 2 에서 얻은 췌도 세포 제제 (제조예 2) 를 복강 내에 유치한 후, 복벽을 2층으로 폐쇄하였다. 이 마우스를 이식 마우스군으로 하였다. 또, 췌도 세포가 들어 있지 않은 제제 (비교예 1 과 동일하게 조제) 를 이식한 마우스를 당뇨병 마우스군으로 하였다.

(3) 생존 기간의 검토

이식하였을 때를 0일로 하고, 이후의 생존 기간을 관찰하였다.

결과를 도 7 에 나타낸다. 이 도 7 로 알 수 있는 바와 같이, 당뇨병 마우스군에서는 과반수가 이식 후 4주 이내에 사망하고, 경과 관찰 기간인 8주까지 생존한 마우스는 존재하지 않았다. 한편, 췌도 세포 제제를 이식한 이식 마우스군에서는 고혈당 상태가 이어져 사망한 2마리 이외에는 모두 8주 이상 생존하였다 (8주까지의 생존율은 0% 대 81.8%, p<0.001).

(4) 혈당·체중 측정

혈당, 체중 모두, 이식 전, 이식 후 1일째, 3일째, 5일째, 7일째에 측정하고, 그 이후에는 매주 1회 측정하였다. 각 군의 혈당 변화를 도 8 에 나타낸다. 이식군에서는, 이식 후의 혈당은 다수가 신속하게 300mg/dl 미만으로 저하 (13/16) 되어, 정상화된 것도 과반수에 관찰되었지만 점차로 상승하였다 (300mg/dl 미만으로 유지된 일수는 3일∼7주). 그러나, 혈당 상승의 정도는 가벼운 정도이고, 당뇨병 마우스군에 비하여 혈당은 유의하게 개선되고 (p<0.0001), 또한, 이식 후 8주까지의 생명 예후도 분명히 개선되었다. 8주까지 관찰한 9마리중 6마리에 췌도 세포 제제의 적출술을 시행하였지만, 그 중의 5마리에 혈당의 재상승이 관찰되었다.

각 군의 평균 체중의 변화를 도 9 에 나타낸다. 이식 마우스군에서는 이식 후, 체중은 수술 후의 절식 불량이 원인으로 생각되는데 감소되었고, 이식 후 3주까지의 반복 측정 분산 분석에서는 당뇨병 마우스군과의 유의차는 관찰되지 않았다. 그러나, 이식 후 3주부터는 증가하기 시작하여, 경과 중 체중이 가장 저하된 1주째에 비하여, 3주 이후에는 유의한 상승이 관찰되었다 (p<0.05). 또, 3주 및 4주에서는 동 시기의 당뇨병 마우스군의 평균 체중을 유의하게 상회하였다.

(5) 신장 기능 측정

BUN (혈중 요소질소), 크레아티닌은 이식 전, 이식 후에는 매주 1회 측정하였다. 이식 8주 후에 췌도 세포 제제를 적출하고, 그 후 1주까지 측정하였다.

BUN 의 변화를 도 10 에 나타낸다. 췌도 세포 제제 이식 전에 측정한 혈당 정상 마우스 BUN 의 평균±SE 는 25.53mg/dl±1.804 (20-38.9) 이었다. 스트렙토조토신를 투여하고 1주간째의 당뇨병 마우스군 중, 41.3% 에 BUN 의 상승이 관찰되었다 (24/58, 당뇨병 마우스군: 13/35 대 이식 마우스군: 11/23, BUN>35mg/dl). 실험에 사용한 당뇨병 마우스군 14마리 중, 13마리가 경과 중 BUN 높은 값을 나타내었다.

한편, 이식 마우스군 16마리의 검토에서는 수술 전에 BUN 이 상승한 9마리는 모두 이식 1주 후에 정상화가 관찰되었다. 평균치에서는 이식 1주 후에 저하된 BUN 치는 정상치와 거의 변하지 않게 경과하고, 당뇨병 마우스군과의 유의차가 관찰되었다 (p=0.002).

또, 이식 8주 후에 췌도 세포 제제를 적출한 6마리 중, 4마리에 적출후 1주의 BUN 치를 계측하였지만, 모두 적출 전에 비하여 상승되어 있었다.

크레아티닌의 변화를 도 11 에 나타낸다. 크레아티닌의 정상치는 0.351mg/dl±0.032 (0.16-0.5) 이었다. 스트렙토조토신 투여 1주 후 절반 가량의 당뇨병군 마우스가 0.5mg/dl 의 높은 값을 나타내고, 투여 4주 후에 모든 마우스에게 크레아티닌값에 이상이 관찰되었다. 또한, 크레아티닌 상승 후, 모든 마우스가 수주만에 사망하고, 스트렙토조토신 투여 후 10주까지 생존할 수 있었던 마우스는 존재하지 않았다. 이식 마우스군에서는 크레아티닌의 이식 후의 상승이 6마리에서 관찰되었지만, 모두 가벼운 정도로 경과 관찰 기간 중 생존 가능하였다. 크레아티닌 평균치는 이식 마우스군에서는 이식 후 5주만 0.5mg/dl 을 상회하였지만, 다른 모든 기간에서 0.4mg/dl 대로 안정되어 있었고, 당뇨병 마우스군에 비하여 유의하게 저하되어 있었다 (p=0.0478). 또한, 췌도 세포 제제 적출 후에는 BUN 과 마찬가지로 모든 마우스에서 재상승이 관찰되었다.

(6) 요검사

24시간 요를 채취하여, 요량, 24시간 요당 배설량, 24시간 요알부민 배설량, 요케톤체를 측정하였다. 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군, 정상 혈당 마우스군 모두 대사 케이지 내에서 24시간, 자유 음수, 식사 환경 하에서 사육하여 24시간 요를 회수하였다. 요당은 Fuji DRI-CHEM 시스템으로 측정하고, 요량을 곱한 것을 요당 배설량으로 하였다. 또한, 24시간 요알부민 배설량은 요알부민 농도를 ELISA (Albuwell M(Exocill)) 로 측정하고, 24시간 요량을 곱함으로써 산출하였다. 요케톤체는 우로테이프 (에이켄 (주)) 를 사용하여 색조를 수치화함으로써 평가하였다.

24시간 요량의 변화를 도 12 에 나타낸다. 이식 마우스군은 당뇨병 마우스군에 비하여 유의차는 없었으나, 약간 낮은 값을 나타내었다.

요당 배설량의 변화를 도 13 에 나타낸다. 당뇨 배설량에 관해서도, 이식 마우스군은 당뇨병 마우스군에 비하여 낮은 값이며, 이식 후 3주까지 유의차가 관찰되었다 (p<0.0452).

또한, 요케톤체량의 변화를 도 14 에 나타낸다. 요케톤체량은 당뇨병 마우스군, 이식 마우스군 모두 이식 전에서 상승하였다. 이식 마우스군에서는 이식 1주 후에 정상화되고, 그 후에도 당뇨병 마우스군에 비하여 유의하게 저하되었다 (p=0.0294).

또, 요알부민량의 변화를 도 15 에 나타낸다. 요알부민량은 이식 마우스군에서 당뇨병 마우스군보다 낮은 값을 나타내었지만, 유의차는 관찰되지 않았다.

(7) 1,5-안히드로-D-글루시톨(1,5-AG) 측정

당뇨병 정도를 검토하기 위해서, 1,5-AG 측정을 하였다. 1,5-AG 는 글루코스와 매우 유사한 구조를 갖는 폴리올로, 주로 음식물을 통해 섭취, 흡수되어, 체내에 널리 풍부하게 축적된다. 그리고 신장에 의해 재흡수된다. 글루코스와 경합 작용이 있어, 당뇨병시에는 요당의 AG 재흡수는 저해되고, 요중 AG 배설의 증대와, 혈중 AG 의 감소로 이어진다. 따라서, 1,5-AG 는 글루코스의 동태에 대하여 매우 예민하게 반응하기 때문에, 실시간의 당뇨병 상태를 반영하는 마커가 될 수 있다. 이식 마우스군, 당뇨병 마우스군, 정상 혈당 마우스군 모두 이식 전과, 이식 후 매주 1회 꼬리 정맥으로부터 혈액 25㎕ 를 채취하여, 동물용 1,5-AG 키트 (닛폰 화약) 로 측정하였다.

결과를 도 16 에 나타낸다. 이 도면으로 알 수 있는 바와 같이, 정상 혈당 마우스군에 비하여, 당뇨병 마우스군에서는 1,5-AG 농도는 분명히 낮은 값이고, 당뇨병의 상태를 잘 반영하였다. 이식 마우스군의 1,5-AG 평균치는 수술 전과 비교하여, 1주 후에 상승하였다. 또한, 기간 중 당뇨병 마우스군과 비교하여 유의한 상승이 관찰되었다 (p=0.0203).

(8) 고찰

상기 이식 실험을 통해 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 췌도 세포 제제는 그것을 이식함으로써, 당뇨병 상태를 개선하여, 당뇨병에 의한 사망 및 당뇨병성의 신장 장애의 예방에 유효하다. 또한, 본 발명의 췌도 세포 제제의 이식은 당뇨병 치유뿐 아니라, 합병증 예방 면에서도 유효하다.

본 발명에 의해, 환자에게 있어서 유용한 호르몬 또는 단백질 등의 생물학적 활성 인자를 분비하는 세포를, 바이오 인공 장기에 사용되는 고분자 중합체로서 적절한 재료인 PVA 속에서 안정적으로 장기간 유지할 수 있는 세포 제제를 제공할 수 있다. 또, 본 발명을 환자에게 투여함으로서, 내분비·대사 질환, 혈우병, 뼈 질환 또는 암 등의 예방 및 치료를 할 수 있다. 본 발명은 세포를 안정적인 상태에서 장기간 가질 수 있기 때문에, 그 이식의 빈도를 저감할 수 있고, 더구나 여러 형상으로 형성할 수 있기 때문에, 주사 등을 통해 피하나 근육 내로 이식할 수도 있다.

Claims

세포 보존제가 배합된 폴리비닐 알코올 속에, 세포를 함유하는 세포 제제.
제 1 항에 있어서, 세포 표면이 추가로 세포외 매트릭스로 덮어져 있는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 추가로 그로스 팩터를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 췌도 세포, 췌장 내분비 세포, 간세포, 전엽 세포, 성장 호르몬 분비 세포, 뼈 세포, 갑상선 호르몬 분비 세포 및 부갑상선 호르몬 분비 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 세포 보존제로 처리되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 형질 전환체인 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 시트상, 판상, 막대상, 튜브상 또는 비드상의 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 보존액이 Euro-Collins 액, 세루반카 또는 UW 액인 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유 동물의 피하, 근육 내 또는 복강 내에 이식하는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 내분비·대사 질환의 예방 및 치료 방법.
제 10 항에 있어서, 내분비·대사 질환이 당뇨병 또는 하수체성 소인증인 것을 특징으로 하는 내분비·대사 질환의 예방 및 치료 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 혈우병의 예방 및 치료 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 뼈 질환의 예방 및 치료 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 간부전 또는 선천성 대사 이상의 예방 및 치료 방법.
폴리비닐 알코올에 세포 보존제를 배합한 후, 세포를 그 폴리비닐 알코올에 혼합하고, 얻어진 세포 함유 폴리비닐 알코올을 겔화하는 것을 특징으로 하는 세포 제제의 제조 방법.
인간 또는 동물용 의약인 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 제제.