CN101903049A

CN101903049A - 包囊的肾组织

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Publication number: CN101903049A
Application number: CN2008801216148A
Authority: CN
Inventors: C·S·布恩苏西索; D·C·科尔特; B·C·克雷默; A·西达
Original assignee: Ethicon SAS
Current assignee: Johnson and Johnson Medical SAS
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2028-12-17
Also published as: WO2009085850A2; CN101903049B; WO2009085850A3; CA2708959A1; US20140271778A1; EP2231209B1; BRPI0821540A2; JP2011507875A; CA2708959C; US8734527B2; US20140248326A1; JP5456692B2; US9579348B2; US20090162411A1; BRPI0821540B1; AU2008343193A1; EP2231209A2; PL2231209T3; AU2008343193B2

Abstract

本发明提供治疗性植入物，其包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织。本发明还公开了治疗对象的疾病状态的方法，其包括将包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织的治疗性植入物植入所述对象内。本发明还提供制造治疗性植入物的方法，其包括：提供肾脏组织；混合所述肾脏组织与包括聚合物的溶液，从而形成组织-聚合物悬浮液；将所述组织-聚合物悬浮液挤出形成珠粒的溶液中，从而形成治疗性植入物，其包括将所述肾脏组织包囊在其内的所述聚合物的珠粒。

Description

包囊的肾组织

交叉参考相关申请

本申请要求2007年12月20日申请的美国临时专利申请No.61/015,328的优先权的利益，将其全部内容以引用的方式并入本文。

发明领域

本发明属于将组织包囊(encapsulation)在聚合物中。

发明背景

肾脏在维持生理内环境稳定中起关键作用。其中的内环境稳定功能为酸碱平衡、电解质浓度的调节、血压和血量的调节。肾脏独立地以及通过分泌进入血流的激素和蛋白质作用与其它器官系统协调实现这些功能。这些分泌的蛋白质包括红细胞生成素(Epo)、尿扩张素、肾素和维生素D，以及较少重视的蛋白质比如脂联脂联蛋白(adiponectin)和瘦蛋白。

脂联蛋白(也称为AdipoQ、Acrp30、apM1和GBP28)是一种已经显示出具有抗炎性质的脂肪细胞-衍生的细胞因子。另外，其经由与肝脏相互交流(cross-communication)起调节血糖水平的作用。在人类中，脂联蛋白的正常血液浓度为5-30μg/ml。之前的研究表明在人类和小鼠中，在长期热量限制期间，脂联蛋白的循环水平均升高。相反，人血浆中脂联蛋白的低水平与高胰岛素、葡萄糖和甘油三酯以及肥胖增加相关。已经表明，在转基因小鼠中人脂联蛋白的过表达引起脂肪累积的抑制，且预防了高卡路里饮食引起的早亡。而且，糖尿病敏感性基因座定位于染色体3q27，人脂联蛋白基因的位点。在治疗糖尿病和相关并发症中，脂联蛋白的血液水平增加可具有治疗价值。

瘦蛋白(leptin)是一种16-千道尔顿的蛋白质激素，其在通过降低食欲和增加代谢来调节能量摄取和能量消耗中起关键作用。最近，已经表明在糖尿病性肾病的小鼠模型中，瘦蛋白在保护肾脏免于肾脏损伤中起作用。另外，瘦蛋白通过上调血管内皮生长因子而促进血管生成。

红细胞生成素(Epo)，一种主要由肾脏合成和分泌的30.4kDa蛋白质，已经被成功地用于刺激患有贫血的患者的红细胞生成超过30年。最近，EPO除了刺激红细胞生成之外良好扩展的有利作用变得显而易见(Brines等人，Kidney Int.，2006；70(2)：246-250)。之前，Chong等人的研究确定了Epo保护血管内皮抗局部缺血损伤。Chong等人，Circulation，2002；106(23)：2973-9。其它的研究证实这些发现表明了在多种血管疾病的动物模型中，Epo对内皮细胞具有保护作用(Santhanam等人，Stroke，2005；36(12)：2731-7；Satoh等人，Circulation，2006；113(11)：1442-50；Urao等人，Circulation Research，2006；98(11)：1405-13)。在慢性肾衰竭中，患者由于肾脏生成的Epo不足而发展为贫血。给药重组体Epo作为替代治疗恢复了血细胞比容和血红蛋白浓度，避免了输血的需要。然而，该治疗必须定期注射Epo，每周两至四次静脉内或皮下给予。Epo剂量给药很麻烦，引起患者不配合和血液Epo和血细胞比容值的周期性波动。

考虑到Epo对心血管系统的保护作用，以及目前与重组体Epo治疗相关的挑战，植入Epo-洗脱装置可能是目前治疗模式的有效替代方法。这样的可植入装置也可以更好地控制血细胞比容值和甚至可能保护器官微血管系统免于损伤。

集中于研发可替代的Epo递送系统的最新研究正在进行中。研究者已经证实了将重组体Epo包囊在不同类型的生物可吸收的聚合物中的可能性(参见，例如Yeh等人，J.Microencapsulation，2007；24(1)：82-93；Pistel等人，J.of Controlled Release，1999；59(3)：309-325；Bittner等人，European Journal of Pharmaceutics an Biopharmaceutics，1998；45：295-305；Morlock等人，Journal of Controlled Release，1998；56：105-115)。虽然可以使用若干技术实现将肽和小分子包囊在可生物降解的封套中，但蛋白质的包囊具有相关挑战(associated challenges)。例如，难以获得具有最小初始速释的连续Epo释放特征和在微球内足够的蛋白质装载量。研发重组体Epo-装载的可植入装置可需要频繁的药物-再装载或装置替换，以确保长期的加强的疾病控制。

其他研究者较少将重点放在重组体Epo上，而是寻求遗传工程和细胞治疗方法。Naffakah等人验证了从遗传修饰的细胞分泌的Epo是否可以代表用于治疗慢性贫血的反复注射剂的替代物。Naffakh等人，Human Gene Therapy，1996；7(1)：11-21。在该研究中，用逆转录病毒载体转染原发性小鼠皮肤成纤维细胞，其中鼠的Epo cDNA在鼠的磷酸甘油酸激酶启动子控制下表达。将这些包含埋入胶原凝胶中的遗传修饰的成纤维细胞“新器官”植入小鼠的腹膜腔，在10个月的观察期之后，引起血细胞比容和血清Epo浓度增加。植入分泌Epo的成纤维细胞代表永久性体内Epo递送的潜在方法。

类似地，Orive等人研究了间接体内基因治疗法的长期作用。OriveG等人，Molecular Therapy，2005；12(2)：283-9。将载有分泌Epo的肌原细胞的聚合物微胶囊植入同源和异源小鼠的腹膜和皮下组织中。在所有植入的小鼠中，高且恒定的血细胞比容水平保持了超过100天。有趣的是，植入异源小鼠中的胶囊的作用持续至植入后210天。这些结果证实细胞包囊技术对于长期地将Epo递送到异源模型中的可行性。

另外，许多公司也正在研发细胞包囊技术。StemCells(CytoTherapeutics)正在研发可以通过外科手术植入和释放物质穿过血脑屏障用于神经病学应用的细胞包囊。Novocell Inc.(San Diego，CA)正在研发用于胰岛素依赖性糖尿病的包囊胰岛细胞。Islet Technology，Inc.(St.Paul，Minnesota)正在研发胰岛微囊化技术，并且证实了其植入糖尿病的狗中长期持续释放超过3年。Amcyte Inc.(Santa Monica，CA)正在研发使用可光交联的(photocross-linkable)海藻酸盐或聚乙二醇胶囊形成人工胰腺的胰岛细胞。最后，MicroIslet Inc.(San Diego，CA)正在研发使用高生物相容性海藻酸盐微囊化的猪胰岛的悬浮液，其用于注射到腹腔中。

实际上，存在尝试开发作为递送治疗剂的工具的细胞和蛋白质包囊的一些努力。总之，本领域的状况已经产生了非常强的且有用的数据，这些努力证实包囊作为体内Epo的受控、长期递送方法是有用的。然而，存在在包囊遗传修饰的细胞可以用于治疗目的之前，必须解决的重要的安全问题。

存在对克服与展开治疗相关的常规问题的可植入装置的需要。

发明简述

本发明提供治疗性植入物，其包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织。本发明还公开了治疗对象的疾病状态的方法，其包括将包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织的治疗性植入物植入所述对象内。

本发明还提供制造治疗性植入物的方法，其包括：提供肾脏组织；混合所述肾脏组织与包括聚合物的溶液，从而形成组织-聚合物悬浮液；将所述组织-聚合物悬浮液挤出进入形成珠粒的溶液中，从而形成治疗性植入物，其包括将所述肾脏组织包囊在其内的所述聚合物的珠粒。

附图说明

图1描述了包囊和非包囊的切碎的大鼠肾组织的相对生存力的评价结果。

图2图解了释放到培养基中的Epo的量，如在包囊后第4天通过ELISA测定的；数据包括没有组织的珠粒(仅仅珠粒)的、非包囊的切碎的大鼠肾组织(仅仅组织)的和包囊的切碎的大鼠肾组织的(含有组织的珠粒)。

图3描述了来自研究的数据，其中在培养四天后测量分泌到所述培养基中的各种蛋白质的平均量。

示例性实施方案的详细说明

尽管对作为递送治疗剂的方法的细胞包囊的兴趣增加了，但是对于已经提出的包囊整个组织片段还没有引起注意。目前已经发现包囊切碎的肾组织提供了递送天然Epo及来自内源细胞的其它有益试剂，同时提供预防组织排异反应的免疫屏障的机会。如本文发现的，移植由肾组织组成的可诱导的、分泌有益试剂的、可植入的装置可以显著地减缓目前围绕红细胞生成-刺激剂的经济、安全和医学问题。肾组织包囊技术也可以使能够研发治疗多种疾病状态的其它治疗技术。

在本发明公开的内容中，单数形式“a”、“an”、和“the”包括复数对象，提及特定数值时其至少包括所述特定值，除非上下文另有明确说明。当数值表示为近似值时，使用先行词“约”，应当理解该特定值构成另外的实施方案。当存在约时，所有范围都被包括，且是可以组合的。

本发明提供包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织的治疗性植入物。本发明的植入物适于引入体内，和在植入后提供治疗作用。在本发明的植入物中所用的肾脏组织可以是自身组织、同种异体组织、异种组织或其任意组合。可以加工所述肾脏组织的尺寸以用于本发明的植入物，例如通过将肾脏组织源切碎成片段。这样的片段可以具有的尺寸为小于约1mm，或者它们可以更大。所述片段的尺寸优选地根据其最大尺寸来测量，例如如果所述片段具有的长宽比大于1∶l则测量纵长，如果所述片段是大致立方形的则测量侧长，或者如果所述片段是大致球形的则测量直径等。除了切碎之外，还可以进一步加工所述片段的尺寸以减小该组织的尺寸。例如，可以进一步切碎所述片段，使得基本上所有片段的尺寸都小于约300μm、小于约150μm、小于约100μm或小于约50μm。在本发明的植入物中肾脏组织的总量可以为至少约100mg、至少约50mg、至少约30mg或至少约10mg。各种因素，比如期望的肾脏组织的总表面积、治疗的类型、肾脏组织的类型、接受治疗的对象的特征、期望治疗的疾病状态的类型和阶段、组织分泌的物质的量和类型、以及本领域技术人员理解的其它因素，可用于确定所述植入物中肾脏组织的量、个体组织片段的尺寸或两者。

所述聚合物珠粒优选地包括生物相容性聚合物，比如天然存在的或合成衍生的生物聚合物。所述聚合物珠粒可以包括这样的聚合物，如海藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、聚乙二醇、葡聚糖、琼脂糖、聚-L-赖氨酸、角叉菜胶、果胶、黄蓍胶、黄原胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白或其任意组合。一种优选的聚合物组合包括海藻酸盐和聚-L-赖氨酸。这样的聚合物是容易市售可获得的。

术语“珠粒”当针对所述聚合物使用时，意味着转运的聚合物组合物通常设想是大致球形的，但也可以是卵形的或长圆形(oblong)的。所述聚合物珠粒的精确形状对于本发明不重要；可以允许肾脏组织基本上包封在所述聚合物内的任何形状都是可接受的。当根据其最大尺寸测量时，聚合物珠粒可以具有的直径为约0.5mm至约10mm，优选地为约3mm至约6mm。聚合物珠粒的尺寸可以根据珠粒的特性在植入前或植入后侧量。当聚合物珠粒可以自发分化(bud)时，可以根据未分化的珠粒或根据分化形成的珠粒测量聚合物珠粒的尺寸。

所述聚合物珠粒的特征使本发明的植入物能够从珠粒内分泌有益试剂进入到其中植入或以其它方式包含该珠粒的周围环境中。换句话说，所述聚合物珠粒是包囊在珠粒内的肾脏组织分泌的物质能渗透的。所述肾脏组织可以是内源的、天然存在的组织，或者可以包括含有基因改变的细胞，比如插入非天然存在的基因或基因的一部分。包括基因改变或插入的肾脏组织可以物理上能够分泌内源或天然存在的组织不能分泌的物质。所述肾脏组织和因而本发明的植入物可以分泌内源性或改变的(例如遗传改变的)肾脏组织物理上能够生成的任何化合物。例如，所述肾脏组织可以分泌一种或多种激素、激素原、蛋白质、生长因子、营养因子或其任意组合。作为另外的实例，和如本文进一步描述的，所述组织可以分泌一种或多种红细胞生成素、MCP-1、脂联蛋白、瘦蛋白和MMP-2。遗传改变的肾脏组织可以分泌的化合物是理论上来说实际是无限制的。

本发明还提供治疗对象的疾病状态的方法，其包括将包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织的治疗性植入物植入对象内。因为本发明的植入物能够分泌大量有益试剂，本发明的方法可用于治疗多种疾病状态。如本文使用的“治疗”指预防性治疗，或减缓任何病理性表型。本发明提供的要治疗的疾病状态可以是贫血、中风、心血管疾病或任何肾病，即与肾功能不适直接地或间接地相关的任何病理，例如其引起肾功能不适，或者其至少部分地由肾功能不适引起。肾病可以是遗传的、先天性的或获得性的。肾病的非限制性实例包括多囊肾病、奥尔波特综合征(Alport′s syndrome)、遗传性肾炎、原发性高草酸尿、胱氨酸尿症、肾炎、肾脏综合征、高血压、糖尿病、急性肾病、慢性肾病(持续性蛋白尿)、肾小管性酸中毒、肾小球疾病和肺出血肾炎综合征(Goodpasture′s syndrome)。用Epo治疗的益处，例如已经根据许多病理学广泛地证实了，且容易被本领域技术人员所理解。在本发明的方法中所用的聚合物珠粒和肾脏组织的特征可以如前对于本发明的治疗性植入物所描述的。

本发明还涉及制造治疗性植入物的方法。用于制造治疗性植入物的方法成功地使得能够制造可以根据本发明公开的内容使用的治疗性组合物。本发明的方法包括提供肾脏组织；混合所述肾脏组织与包括聚合物的溶液，从而形成组织-聚合物悬浮液；将所述组织-聚合物悬浮液挤出至形成珠粒的溶液中，从而形成治疗性植入物，其包括将所述肾脏组织包囊在其内的所述聚合物的珠粒。

肾脏组织可以根据以前公开的技术制备，包括选择组织类型和加工尺寸。根据本发明与肾脏组织混合的聚合物溶液可以包括聚合物和生长培养基的组合。可以如上所述确定所述聚合物的特性。任何可接受的培养基、营养肉汤等都可以用作本发明的生长培养基；本领域技术人员可容易地确定合适的生长培养基的特征，所述生长培养基可以包括培养基的混合物。生长培养基的pH、葡萄糖浓度、生长因子、和存在的其它营养组分可以不同，但是生长培养基应当满足肾脏组织的至少一些营养需求，优选地满足大多数或所有的营养需求，并且应当具有缓释和供给肾脏组织所必需的pH及其它化学特性。一个合适的生长培养基的实例是DULBECCO’S MODIFIED EAGLES MEDIUM(DMEM；Invitrogen，Carlsbad，CA)。生长培养基是市售可获得的，合适的培养基是本领域技术人员容易识别的。为了预防感染，可以将抗生素比如青霉素、链霉素等加入到所述生长培养基中。也可以将血清比如胎牛血清加入到所述生长培养基中。

可以通过适于形成悬浮液的任何方法实现肾脏组织和聚合物溶液的混合，即其中肾脏组织基本上均匀地悬浮在聚合物溶液中的混合物，所述方法比如振荡、搅拌或倾倒。例如，可以通过如下方法实现混合：将肾脏组织和聚合物溶液装载到第一容器比如注射器中，将溶液转移到另一个容器中，比如通过将注射器的内含物排出到第二注射器中，将该溶液再返回第一容器中，根据需要如此重复该循环，直到获得悬浮液。

在形成悬浮液后，将该悬浮液挤出至形成珠粒的溶液中，以便形成肾脏组织包囊在其中的聚合物珠粒。所述挤出可以包括从注射器中喷射所述悬浮液，或者以其它方式将该悬浮液从一个容器转移到其中包含形成珠粒的溶液的另一个容器中，或者可选地，将形成珠粒的溶液转移到其中含有该悬浮液的容器中。所述形成珠粒的溶液可以是离子型的，可以是交联溶液，或者同时为两者。在一个实施方案中，所述形成珠粒的溶液包括CaCl₂。当与形成珠粒的溶液组合时，可以自发地形成具有包囊的肾脏组织的聚合物珠粒。形成珠粒的方法可以进一步例如通过振荡该悬浮液和形成珠粒的溶液的混合物、调节该混合物的温度(例如升高温度)或同时两种方式来促进。

在形成聚合物珠粒后，可以通过将该珠粒放置到交联溶液中实现珠粒的化学交联。对于交联，可以将珠粒转移到聚合物的稀溶液中，该聚合物优选地为与珠粒的主要聚合物组分不同。例如，如果所述聚合物珠粒的主要组分包括海藻酸盐，可以使用聚-L-赖氨酸的稀溶液来交联该海藻酸盐珠粒。任选地，在其在形成珠粒的溶液中“产生”后，或者在交联后，可以向聚合物珠粒中加入另外的聚合物层。优选地，所述另外的聚合物层包括与构成所述聚合物珠粒的主要组分相同的聚合物。例如，可以向其中主要组分为海藻酸盐的珠粒中加入另外的海藻酸盐层。可以通过将所述珠粒置于包括其中制备另外层的聚合物的稀聚合物溶液中来实现向所述聚合物珠粒中加入另外的聚合物层。

在下述实施例中进一步定义本发明。应当理解给出本发明的所示实施方案仅仅是为了示例，这些实施例不应当被看作是限制附加权利要求。从上述讨论和这些实施例可知，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围下，可以进行本发明的各种改变和修饰以使其适应各种用法和条件。

实施例1-治疗性植入物的形成

通过外科手术从雌性的Long Evans大鼠(八周龄)中切除四个肾，在冰冷却的不含Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中冲洗，然后使用解剖刀将其切成小块(1-5mm³)。然后使用300uM-钢筛(Sigma，St Louis，MO)进一步切碎所述组织片段。然后，用30-50mL的生长培养基洗涤切碎的组织三次，该生长培养基包含Dulbecco′s Modified Eagles Medium(DMEM)(Invitrogen)，所述DMEM含有1％的青霉素/链霉素(Invitrogen)和1％的胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)。完全地除去最后的洗涤液，将该组织片段装入两个注射器混合系统中的一个1毫升的注射器中。制备在生长培养基中的1.8％(w/v)的海藻酸盐溶液(Sigma)，将其装入第二个1-毫升注射器中。然后，通过在两个注射器中都前后推动内含物将这两种溶液混合在一起。接着，将切碎的组织-凝胶悬浮液挤出至100mM的CaCl₂溶液中。之后，在室温下，在CaCl₂中培养得到的包囊组织珠粒，并慢慢振荡5分钟。然后，通过将该珠粒转入包含1％FBS的0.05％(w/v)的分子量24,000聚-L-赖氨酸(Sigma)中5分钟来化学交联，之后，用包含1％FBS的0.1％(w/v)的海藻酸盐溶液的另一层涂覆5分钟。然后，将四至十个珠粒转移到24孔低簇组织培养皿的各个孔中，所述组织培养皿包含0.5mL的生长培养基、或包含100ng/ml聚-D-谷氨酸(pDGA)的生长培养基(Sigma)，并在含氧量正常或含氧量低(5％氧气)的大气条件下于37℃培养四天。目测检查珠粒，并使用数码相机和Eclipse TE2000-U显微镜(Nikon，Japan)照像。

肉眼观察海藻酸盐包囊的组织珠粒表明在制备球状的包含组织的珠粒中，经过双向注射器系统人工挤出是有效的。在所述海藻酸盐珠粒内的组织片段也是可见的，证实了其在整个海藻酸盐凝胶内分布均匀。

实施例2-珠粒直径的测量

将十四个独立的包含组织的珠粒放置到干净的组织培养板中，使用装备有数码相机的Nikon解剖显微镜照相。然后，使用IMAGE PROPLUS软件测量各个珠粒的直径。

肉眼观察海藻酸盐包囊的组织珠粒表明在制备球状的包含组织的珠粒中，经过双向注射器系统人工挤出是有效的。在所述海藻酸盐珠粒内的组织片段也是可见的，证实了其在整个海藻酸盐凝胶内分布均匀。从3.72g破碎的肾组织中生成一百一十五个珠粒，每个珠粒约32mg的组织。表1显示了珠粒直径的分布。

表1

发现十四个独立珠粒的平均直径为4.56+/-0.44mm。

实施例3-细胞生存力的评价

使用ALAMAR BLUE(Invitrogen)，一种响应于代谢活性减少的比色REDOX指示剂，评价切碎的肾组织的生存力。在培养四天后，从非包囊的肾组织、包囊的肾组织、异丙醇固定的组织和单独的生长培养基样品中除去用过的生长培养基。将包含10％ALAMAR BLUE的1毫升生长培养基加入到样品中，并在37℃、5％CO₂下进一步培养2-4小时，同时轻轻地摇动。然后，在570nm和600nm分光光度法地(SPECTRAMAX-190，Molecular装置，Sunnyvale，CA)分析用过的培养基。分析来自每个样品的培养基，一式三份。按照制造商的说明测定ALAMAR BLUE的减少％，其为细胞生存力的间接测量方式。

在培养四天后，评价组织生存力。与非包囊的组织相比，包囊保持更大的组织生存力(图1)。在含氧量正常或缺氧下培养的非包囊肾组织分别显示出相似的相对平均生存力为20.9％+/-3.4％和21.0％+/-1.9％。然而，在含氧量正常条件下培养的包囊肾组织显示出相对平均组织生存力增加。包囊的组织显示出的相对平均组织生存力为83.5％+/-4.5％。在缺氧条件下培养的包囊肾组织引起降低的组织生存力，为31.3％+/-3.4％。如预期的，组织固定引起组织生存力显著地降低，为5.0％+/-0.084％。

实施例4-Epo分泌分析

在培养四天后，收集用过的培养基，使用Quantikine Mouse/RatErythropoietin ELISA试剂盒(R&D系统，MN)测定释放到该培养基中的Epo的量。在540nm分光光度法(SPECTRAMAX-190，Molecular装置，Sunnyvale，CA)测定ELISA板。通过将未知样品的吸光度值与线性回归的标准曲线的比较来分析数据。

在包囊后第4天，通过ELISA测定释放到所述培养基中的Epo的量。将该数据标准化成仅仅用生长培养基得到的吸光度值(修正均数)。在由8-10个珠粒获得的用过的培养基上进行每个测量。也计算平均标准误差(SEM)。将显示在下述表2中的数据以图形形式表示在图2中。

表2

处理组	平均值(pg/mL)	SEM(pg/mL)	标准化的平均值(pg/mL)
				仅仅生长培养基(背景)	-26.79	3.73	0.00
仅仅珠粒	-32.85	2.10	-6.06

仅仅组织	19.04	3.34	45.83
				具有组织的珠粒	52.52	28.59	79.31
具有组织和pDGA的珠粒	34.12	10.50	60.91

在图2中，数据条代表三次测量的平均值，误差条代表SEM。在由8-10个珠粒获得的用过的培养基上进行每次测量。

结果表明切碎的肾组织生成了45.8+/-3.3pg/mL的Epo进入周围培养介质中。同样地，海藻酸盐包囊不能阻止Epo从切碎的组织中释放出，生成了79.3+/-28.6pg/mL的Epo。为了测定Epo的生成是否能够是化学增强的，制备珠粒并培养在pDGA中。结果表明pDGA处理对于Epo的生成没有影响，产生了60.9+/-10.5pg/mL的Epo。作为阴性对照，测定来自没有组织的珠粒的Epo生成。如所预期的，从这些样品中没有检测到可测量的Epo。

实施例5-营养因子分泌分析

在培养四天后，收获来自珠粒的用过的培养基。通过离心从用过的培养基中除去细胞碎片，并将该培养基在-80℃贮存。在分析时，通过用具有Searchlight Proteome Arrays(Pierce Biotechnology Inc.)的ELISA测定用过的培养基的下述蛋白因子：白细胞介素-4(IL-4)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素-10(IL-10)、脂联蛋白、瘦蛋白、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)。

与源自没有组织包囊的珠粒的用过的培养基相比较，包含肾组织片段的珠粒分泌增加量的MCP-1(50.6+/-8.9pg/mL)、脂联蛋白132,060.6+/-11，226.7pg/mL)、瘦蛋白(10.3+/-2.6pg/mL)和MMP-2(945.2+/-13.3pg/mL)及低至不可检测量的IL-4、RANTES、GMCSF和IL-10。如下表3所示，每个处理组包含三个样品(1、2、3)。

表3

STD＝标准偏差，SEM＝平均标准误差。将此处显示的数据以图形形式表示在图3中，其中数据条代表在培养四天后分泌到所述培养基中的蛋白质的平均量。用从没有组织的珠粒获得的背景测量结果减去显示的数据。误差线代表SEM。

实施例6-红细胞生成刺激活性的评价

将大鼠红细胞系统的CD34+细胞(Lonza，Walkersville MD)以15,000个细胞/cm2再悬浮在含有10％FBS的IMDM中。然后，将珠粒调理的培养基加入到甲基纤维素菌落形成性测定培养基(MethoCultGF H4534，StemCell Technologies，Vancouver BC)中。将细胞加入到甲基纤维素中，并随后在37℃的5％CO2恒温箱中进行平板培养12-14天。通过相差显微镜检查计数包含多于50个细胞的菌落。

来源于包囊的大鼠肾组织的调理培养基已经之前显示出包含Epo。目前，当通过BFU-E活性测定时，调理培养基显示出具有红细胞生成刺激活性(ESA)。

实施例7-包囊的肾脏组织片段的肾脏保护作用的评价

该研究的目的是评价肾病大鼠模型中海藻酸盐包囊的大鼠肾组织片段的肾脏保护作用。将具有初始重量200-250g的Sprague Dawley大鼠(糖尿病的或非糖尿病的)用于这些试验。腹膜内注射(5mg/kg)氯胺酮盐酸盐和甲苯噻嗪盐酸盐的4∶1溶液来麻醉大鼠。通过两阶段肾切除程序诱导肾衰竭。使用结扎丝线切除左肾的上部和下部(一个肾的三分之二)，同时保护肾囊。十天后，切除右肾，留下总肾质量的约1/6(5/6肾切除)。施用软压甲基纤维素止血，并用可吸收的4-O Vicryl缝线逐层缝合腹膜和皮肤。

在5/6的肾切除程序后五周，移植在包囊下的珠粒。作为对照，给5/6肾切除的大鼠注射单独的纤维蛋白基质。在第0天(5/6肾切除之前)和第1天(细胞移植当天)、第7、14、21、28和35天(尸体剖检当天)获得血清样品。使用VETACE CHEMISTRY ANALYZER(Alpha Wassermann Diagnostic Technologies，LLC，West Caldwell，NJ)定量血液尿素氮和肌酸酐。

在细胞移植后五周，通过二氧化碳窒息处死所有组中的动物。切除肾进行组织学和转录分析。将每个肾的一半在液氮中快速冷冻用于RT-PCR分析。由研究协调者从冷冻的肾组织中分离信使RNA，利用包含促-纤维变性的和炎症基因的低密度微点阵卡片进行转录分析。将剩余的corneal肾切片固定在10％的中性缓冲的福尔马林中用于下游组织学分析。

对用于组织学固定肾组织进行组织学处理，切片(5μm-厚度)，并用苏木精/曙红染色。按兽医病理学对肾小管损害进行评价和评级。

在该研究中，囊下移植海藻酸盐包囊的肾组织片段将减缓5/6肾切除的啮齿类中或糖尿病性肾病的啮齿类模型中肾脏损伤的发展。与对照动物相比，hUTC处理的动物中血清肌酸酐和血液尿素氮值都显著地降低。另外，所述珠粒降低了糖尿病性肾病的啮齿类模型中的血糖水平。组织学损伤评价显示处理的动物中肾小管坏死和肾小管扩张减少。

尽管对作为递送治疗剂的方法的细胞包囊的兴趣增加了，但是对于包囊整个组织片段还没有引起注意。本文证实了包囊的肾组织片段将Epo及其它有益试剂分泌到培养基中。因此，本文公开的治疗性植入物和治疗方法可以提供许多疾病状态的治疗。

将在该文件中引用或描述的每篇专利、专利申请和公布的全部内容引入本文作为参考。

Claims

1.治疗性植入物，其包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织。

2.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述肾脏组织为自身组织、同种异体组织、异种组织或其任意组合。

3.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述肾脏组织包括遗传改变的细胞。

4.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述肾脏组织包括肾脏组织片段，且其中所述片段具有小于约1mm的尺寸。

5.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述肾脏组织包括肾脏组织片段，且其中所述片段具有小于约300μm的尺寸。

6.根据权利要求1的治疗性植入物，其包括至少约30mg的肾脏组织。

7.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、聚乙二醇、葡聚糖、琼脂糖、聚-L-赖氨酸、角叉菜胶、果胶、黄蓍胶、黄原胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白或其任意组合。

8.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸盐和聚-L-赖氨酸。

9.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述聚合物珠粒具有约3mm至约6mm的直径。

10.根据权利要求1的治疗性植入物，其中所述组织分泌一种或多种激素、激素原、蛋白质、生长因子或其任意组合。

11.根据权利要求10的治疗性植入物，其中所述组织分泌一种或多种红细胞生成素、MCP-1、脂联蛋白、瘦蛋白和MMP-2。

12.治疗对象的疾病状态的方法，其包括将包括包囊在聚合物珠粒内的肾脏组织的治疗性植入物植入所述对象内。

13.根据权利要求12的方法，其中所述疾病状态为贫血、中风、心血管疾病或肾病。

14.根据权利要求12的方法，其中所述肾脏组织为自身组织、同种异体组织、异种组织或其任意组合。

15.根据权利要求12的方法，其中所述肾脏组织包括遗传改变的细胞。

16.根据权利要求12的方法，其中所述肾脏组织包括肾脏组织片段，且其中所述片段具有小于约1mm的尺寸。

17.根据权利要求12的方法，其中所述肾脏组织包括肾脏组织片段，其中所述片段具有小于约300μm的尺寸。

18.根据权利要求12的方法，其中所述治疗性植入物包括至少约30mg的肾脏组织。

19.根据权利要求12的方法，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、聚乙二醇、葡聚糖、琼脂糖、聚-L-赖氨酸、角叉菜胶、果胶、黄蓍胶、黄原胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白或其任意组合。

20.根据权利要求12的方法，其中所述聚合物珠粒包括海藻酸盐和聚-L-赖氨酸。

21.根据权利要求12的方法，其中所述聚合物珠粒具有约3mm至约6mm的直径。

22.根据权利要求12的方法，其中所述组织分泌一种或多种激素、激素原、蛋白质、生长因子或其任意组合。

23.根据权利要求22的方法，其中所述组织分泌一种或多种红细胞生成素、MCP-1、脂联蛋白、瘦蛋白和MMP-2。

24.制造治疗性植入物的方法，其包括：

提供肾脏组织；

使所述肾脏组织与包括聚合物的溶液混合，从而形成组织-聚合物悬浮液；

将所述组织-聚合物悬浮液挤出至形成珠粒的溶液中，从而形成治疗性植入物，其包括将所述肾脏组织包囊在其内的所述聚合物的珠粒。

25.根据权利要求24的方法，其中所述溶液包括聚合物，该聚合物包括：

海藻酸盐、透明质酸、羧甲基纤维素、聚乙二醇、葡聚糖、琼脂糖、聚-L-赖氨酸、角叉菜胶、果胶、黄蓍胶、黄原胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、I型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白或其任意组合；

和生长培养基。

26.根据权利要求24的方法，其中所述形成珠粒的溶液包括交联溶液。

27.根据权利要求24的方法，其中所述形成珠粒的溶液包括离子溶液。

28.根据权利要求24的方法，其中所述形成珠粒的溶液包括CaCl₂。

29.根据权利要求28的方法，其进一步包括用另外的聚合物层涂覆所述珠粒。