ES2705225T3 - Tejido de riñón encapsulado - Google Patents

Abstract

Un implante terapéutico que comprende tejido renal encapsulado dentro de una perla de polímero.

Description

DESCRIPCIÓN

Tejido de riñón encapsulado

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la encapsulación de tejido en polímero.

Antecedentes de la invención

El riñón juega un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica. Entre sus funciones homeostáticas se encuentran el equilibrio ácido-base, la regulación de las concentraciones de electrolitos , la presión arterial y la regulación del volumen sanguíneo. Los riñones realizan estas funciones de forma independiente, así como a través de la coordinación con otros sistemas orgánicos a través de las acciones de las hormonas y proteínas secretadas en el torrente sanguíneo. Estas proteínas secretadas incluyen eritropoyetina (Epo), urodilatin, renina y vitamina D, así como proteínas menos enfatizadas como la adiponectina y la leptina.

La adiponectina (también conocida como AdipoQ, Acrp30, apM1 y GBP28) es una citocina derivada de adipocitos que se ha demostrado que tiene propiedades antiinflamatorias. Además, funciona para regular los niveles de glucosa en sangre a través de comunicación cruzada con el hígado. Las concentraciones normales en sangre de adiponectina son de 5 a 30 p/ml en humanos. Estudios anteriores han demostrado que los niveles circulantes de adiponectina se elevan durante la restricción calórica crónica tanto en humanos como en ratones. En contraste, los niveles bajos de adiponectina en el plasma humano se correlacionan con niveles altos de insulina, glucosa y triglicéridos, así como con un aumento de la obesidad. Se ha demostrado que la sobreexpresión de adiponectina humana en ratones transgénicos dio como resultado la supresión de la acumulación de grasa y la prevención de la muerte prematura mediante una dieta alta en calorías. Además, un locus de susceptibilidad a la diabetes se ha mapeado en el cromosoma 3q27, la ubicación del gen de la adiponectina humana. El aumento de los niveles en sangre de adiponectina podría tener un valor terapéutico en el tratamiento de la diabetes y las comorbilidades relacionadas.

La leptina es una hormona proteica de 16 kilodalton que desempeña un papel clave en la regulación de la ingesta de energía y el gasto de energía al disminuir el apetito y aumentar el metabolismo. Recientemente, se ha demostrado que la leptina desempeña un papel en la protección de los riñones de la lesión renal en un modelo de ratón de nefropatía diabética. Además, la leptina promueve la angiogénesis al regular el factor de crecimiento endotelial vascular.

Por más de treinta años, la eritropoyetina (Epo), una proteína 30,4 kDa sintetizada y secretada principalmente por el riñón, se ha utilizado con éxito para estimular la eritropoyesis en pacientes que sufren de anemia. Recientemente, se ha hecho evidente que los efectos beneficiosos de EPO se extienden mucho más allá de la estimulación de la producción de glóbulos rojos (Brines et al., Kidney Int., 2006; 70 (2): 246-250). Estudios previos de Chong et al. estableció que Epo protege el endotelio vascular contra la lesión isquémica. Chong et al., Circulation, 2002; 106 (23): 2973-9. Otros han confirmado estos hallazgos, lo que demuestra que Epo tiene un efecto protector sobre las células endoteliales en diversos modelos animales de enfermedad vascular (Santhanam et al., Stroke, 2005; 36 (12): 2731-7; Satoh et al., Circulation, 2006 113 (11): 1442-50; Urao et al., Circulation Research, 2006; 98 (11): 1405-13). En la insuficiencia renal crónica, los pacientes desarrollan anemia por insuficiencia renal producida por Epo. El Epo recombinante, administrado como terapia de reemplazo, restaura las concentraciones de hemoglobina en el hematocrito y la sangre, eliminando la necesidad de transfusiones de sangre. Sin embargo, este tratamiento implica inyecciones regulares de Epo, de dos a cuatro veces por semana, administradas por vía intravenosa o subcutánea. La dosificación de Epo es engorroso, lo que resulta en el incumplimiento del paciente y las frecuentes fluctuaciones cíclicas en los valores de Epo y hematocrito en sangre. A la luz de los efectos protectores de Epo en el sistema cardiovascular, también como los desafíos actuales asociados con el tratamiento con Epo recombinante, la implantación de un dispositivo Epo de elución puede ser una alternativa efectiva a la modalidad de tratamiento actual. Un dispositivo implantable de este tipo también podría controlar mejor los valores de hematocrito y potencialmente proteger incluso la microvasculatura del órgano de una lesión.

Se están realizando estudios recientes centrados en el desarrollo de sistemas de suministro de Epo alternativos . Los investigadores han demostrado la viabilidad de encapsular Epo recombinante en diferentes tipos de polímeros bioabsorbibles (Ver, por ejemplo, Yeh et al., J. Microencapsulation, 2007; 24 (1): 82-93; Pistel et al., J. of Controlled Release, 1999; 59 (3): 309-325; Bittner et al., European Journal of Pharmaceutics an Biopharmaceutics, 1998; 45: 295-305; Morlock et al., Journal of Controlled Release, 1998; 56: 105-115). Si bien la encapsulación de péptidos y moléculas pequeñas en envolturas biodegradables se puede lograr usando varias técnicas, la encapsulación de proteínas tiene desafíos asociados. Por ejemplo, ha sido difícil obtener perfiles continuos de liberación de Epo con una explosión inicial mínima, así como una carga suficiente de proteínas dentro de las microesferas. El desarrollo de un Epo cargado recombinante, dispositivo implantable puede requerir la recarga frecuente de medicamentos o el reemplazo del dispositivo para garantizar un manejo sólido y duradero de la enfermedad.

Otros investigadores han colocado menos énfasis en la Epo recombinante y están adoptando el enfoque de la ingeniería genética y la terapia celular. Naffakah et al. examinó si la secreción de Epo a partir de células modificadas genéticamente podría representar una alternativa a las inyecciones repetidas para el tratamiento de la anemia crónica. Naffakh et al., Human Gene Therapy, 1996; 7 (1): 11 21. En este estudio, los fibroblastos primarios de piel de ratón se transdujeron con un vector retroviral en el que el ADNc Epo murino se expresó bajo el control del promotor de la fosfoglicerato quinasa murino. Estos "neo-órganos" que contienen los fibroblastos modificados genéticamente incrustados en geles de colágeno se implantaron en la cavidad peritoneal de ratones, lo que resultó en un aumento de las concentraciones de hematocrito y Epo en suero después de un período de observación de 10 meses. La implantación de fibroblastos secretores de Epo representa un método potencial para el suministro in vivo permanente de Epo.

De forma similar, Orive et al. investigó la funcionalidad a largo plazo de un enfoque de terapia génica ex vivo . Orive G et al., Molecular Therapy, 2005; 12 (2): 283-9. Se implantaron microcápsulas de polímero cargadas con mioblastos secretores de Epo en el peritoneo y tejido subcutáneo de ratones singénicos y alogénicos. Niveles altos y constantes de hematocritos se mantuvieron durante más de 100 días en todos los ratones implantados. Curiosamente, la funcionalidad de las cápsulas implantadas en los ratones alogénicos persistió hasta el día 210 después de la implantación. Estos resultados demuestran la viabilidad de la tecnología de encapsulación celular para el suministro a largo plazo de Epo dentro de un modelo alogénico.

Además, muchas empresas también están desarrollando tecnologías de encapsulación celular. StemCells (CytoTherapeutics) está desarrollando cápsulas celulares que pueden implantarse quirúrgicamente y liberar sustancias que cruzan la barrera hematoencefálica para aplicaciones neurológicas . Novocell Inc. (San Diego, CA) está desarrollando células de islotes encapsulados para la diabetes dependiente de la insulina. Islet Technology, Inc. (St. Paul, Minnesota) también está desarrollando tecnología de microencapsulación de islotes y ha demostrado la persistencia a largo plazo de sus implantes en un perro diabético durante más de 3 años. Amcyte Inc. (Santa Mónica, CA) está desarrollando células de los islotes para formar un páncreas artificial utilizando alginato de fotocruzamiento o cápsula de polietilenglicol. Finalmente, Microlslet Inc. (San Diego, CA) está desarrollando una suspensión de islotes porcinos microencapsulados para inyección en la cavidad abdominal utilizando un alginato altamente biocompatible.

De hecho, existen varios esfuerzos, que intentan explotar celular y encapsulación de proteínas como un medio para administrar agentes terapéuticos. En total, el estado del arte ha generado datos muy convincentes y útiles, y estos esfuerzos han demostrado la utilidad de la encapsulación como un método para el suministro controlado a largo plazo de Epo in vivo. Sin embargo, existen considerables problemas de seguridad que deben resolverse antes de poder utilizar la encapsulación de células modificadas genéticamente para fines terapéuticos.

Sigue habiendo una necesidad de dispositivos implantables que superen los problemas tradicionales asociados con el despliegue terapéutico.

Sumario de la invención

Se proporcionan implantes terapéuticos que comprenden tejido renal encapsulado dentro de una perla de polímero. También se describen implantes terapéuticos para uso en métodos para tratar un estado de enfermedad en un sujeto que comprende implantar dentro de dicho sujeto un implante terapéutico que comprende tejido renal encapsulado dentro de una perla de polímero.

También se proporcionan procedimientos para la fabricación de un implante terapéutico que comprende: proporcionar tejido renal; mezclar el tejido renal con una solución que comprende un polímero, formando así una suspensión de polímero de tejido; expulsando la suspensión de polímero de tejido en una solución formadora de perlas, formando así un implante terapéutico que comprende perlas de dicho polímero dentro de las cuales se encapsula el tejido renal.

Breve drescripción de los dibujos

La fig. 1 representa los resultados de una evaluación de la viabilidad relativa de tejido de riñón de rata picado encapsulado y no encapsulado.

La fig. 2 ilustra la cantidad de Epo liberada en el medio de cultivo, según se determina en el día 4 posterior a la encapsulación mediante ELISA; los datos se incluyen para perlas sin tejido (solo perlas), tejido de riñón de rata picado no encapsulado (solo tejido) y tejido de riñón de rata picado encapsulado (perlas con tejido).

La fig. 3 representa datos de un estudio en el que se midió la cantidad promedio de varias proteínas secretadas en el medio después de cuatro días de cultivo.

Descripción detallada de las realizaciones ilustrativas

A pesar del creciente interés en la encapsulación de células como un método para el suministro de agentes terapéuticos, se le ha dado escasa o ninguna atención a la encapsulación de los fragmentos de tejido enteros. En la actualidad, se ha descubierto que la encapsulación de tejido de riñón picado brinda la oportunidad de administrar Epo natural y otros agentes beneficiosos de células endógenas , al tiempo que brinda una barrera inmunológica para prevenir el rechazo de los tejidos. Como se descubrió en el presente documento, el trasplante de un agente inducible, beneficioso que secreta e implantable dispositivo compuesto por tejido renal puede aliviar dramáticamente los problemas financieros, de seguridad y médicos actuales relacionados con los agentes estimulantes de la eritropoyesis. La tecnología de encapsulación de tejido renal también puede permitir el desarrollo de otras tecnologías terapéuticas para el tratamiento de diversos estados de enfermedad.

Se proporcionan implantes terapéuticos que comprenden tejido renal encapsulado dentro de una perla de polímero. Los presentes implantes son adecuados para la introducción in vivo y para proporcionar efectos terapéuticos después de la implantación. El tejido renal para uso en los presentes implantes puede ser tejido autólogo, tejido alogénico, tejido xenogénico, o cualquier combinación de los mismos. El tejido renal puede procesarse por tamaño para su uso en los implantes presentes, por ejemplo, picando una fuente de tejido renal en fragmentos. Dichos fragmentos pueden tener un tamaño inferior a aproximadamente 1 mm, o pueden ser más grandes. El tamaño de los fragmentos se mide preferiblemente en términos de la dimensión más grande de los mismos, por ejemplo, a lo largo si los fragmentos tienen una relación de aspecto de más de 1: 1, por la longitud de un lado si los fragmentos son aproximadamente cúbicos, o por diámetro si los fragmentos son aproximadamente esféricos, etc. Además de la picadura, los fragmentos pueden ser más procesados para reducir las dimensiones del tejido. Por ejemplo, los fragmentos se pueden picar más para que el tamaño de prácticamente todos los fragmentos sea menor que aproximadamente 300 g, menor que aproximadamente 150 [tm, menor que aproximadamente 100 [tm, o menor que aproximadamente 50 pm El total la cantidad de tejido renal en un implante de la presente invención puede ser al menos aproximadamente 100 mg, al menos aproximadamente 50 mg, al menos aproximadamente 30 mg, o al menos aproximadamente 10 mg. Varios factores, como el área de superficie total deseada del tejido renal, el tipo de terapia, el tipo de tejido renal, las características del sujeto sometido a terapia, el tipo y la etapa del estado de la enfermedad contra la cual se desea la terapia, la cantidad y el tipo de materiales secretados por el tejido, y otros factores que serán apreciados por los expertos en la técnica, pueden usarse para determinar la cantidad de tejido renal en el implante, el tamaño del individuo, fragmentos de tejido, o ambos.

La perla de polímero comprende un polímero biocompatible, tal como un biopolímero de origen natural o derivado sintéticamente. La perla de polímero puede comprender polímeros tales como alginato, ácido hialurónico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, dextrano, agarosa, poli-L-lisina, carageenano, pectina, goma tragacanto, goma xantana, goma guar, goma arábiga, colágeno tipo I, laminina, fibronectina, fibrina o cualquier combinación de los mismos. La combinación preferida de polímeros comprende alginato y poli-L-lisina. Tales polímeros están fácilmente disponibles comercialmente.

El término "perla" cuando se utiliza en referencia al polímero se pretende transmitir que la composición de polímero generalmente asume una forma aproximadamente esférica, pero también puede ser ovoide o rectangular. La forma precisa de la perla de polímero no es esencial para la presente invención; cualquier forma que permita que el tejido renal esté sustancialmente envuelto dentro del polímero es aceptable. Cuando se mide de acuerdo con su mayor dimensión, una perla de polímero puede tener un diámetro de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 10 mm, y preferiblemente de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 6 mm. El tamaño de la perla de polímero se puede medir de acuerdo con las características de la perla antes de la implantación, o después de la implantación. Como las perlas de polímero pueden brotar espontáneamente, el tamaño de la perla de polímero se puede medir con respecto a una perla sin brotar o con respecto a una perla que resulta de la brotación.

Las características de la perla de polímero permiten instantáneos implantes para secretar agentes beneficiosos desde dentro de la perla en el entorno ambiental en el que se implanta la perla o es contenida de otra manera. En otras palabras, la perla de polímero es permeable a sustancias que son secretadas por el tejido renal que está encapsulado dentro de la perla. El tejido renal puede ser endógeno, tejido de origen natural o puede incluir células que contienen alteraciones genéticas, como las inserciones de genes o porciones de genes que no están presentes de forma natural. El tejido renal que incluye alteraciones o inserciones de genes puede ser físicamente capaz de secretar sustancias que el tejido endógeno o natural no puede. El tejido renal y, por lo tanto, a su vez, el implante de la presente invención puede secretar cualquier compuesto que el tejido renal, ya sea endógeno o alterado (por ejemplo, alterado genéticamente) sea físicamente capaz de producir. Por ejemplo, el tejido renal puede secretar una o más hormonas, prohormonas, proteínas, factores de crecimiento, factores tróficos o cualquier combinación de los mismos. Como ejemplos adicionales, y como se describe más adelante en este documento, el tejido puede secretar una o más de eritropoyetina, MCP-1, adiponectina, leptina, y MMP-2. Los compuestos que el tejido renal genéticamente alterado puede segregar son teóricamente virtualmente ilimitados.

También se proporcionan implantes terapéuticos para uso en métodos para tratar un estado de enfermedad en un sujeto que comprende la implantación dentro del sujeto de un implante terapéutico que comprende el tejido renal encapsulado dentro de una perla de polímero. Debido a que los presentes implantes son capaces de secretar una serie de agentes beneficiosos, los implantes terapéuticos de la invención para uso en pueden usarse para tratar una amplia variedad de estados de enfermedad. Como se usa en este documento, "tratamiento" puede referirse a terapia profiláctica, o alivio de cualquier fenotipo patológico. El estado de la enfermedad para el cual se proporciona tratamiento mediante la presente invención puede ser anemia, accidente cerebrovascular, enfermedad cardiovascular o cualquier enfermedad renal, es decir, cualquier patología que está directa o indirectamente asociada con una función renal inadecuada, por ejemplo, que resulta en una función renal inadecuada, o que es causada, al menos en parte, por una función renal inadecuada . La enfermedad renal puede ser hereditaria, congénita o adquirida. Los ejemplos no limitantes de enfermedad renal incluyen enfermedad renal poliquística, síndrome de Alport, nefritis hereditaria, hiperoxaluria primaria, cistinuria, nefritis, síndrome nefrítico, hipertensión, diabetes, enfermedad renal aguda, enfermedad renal crónica (proteinuria persistente), acidosis tubular renal, enfermedades glomerulares , y el síndrome de Goodpasture. Los beneficios del tratamiento con Epo, por ejemplo, han sido ampliamente documentados con respecto a una serie de patologías, y es fácilmente apreciado por los expertos en la técnica. Las características de las perlas de polímero y el tejido renal para uso en los presentes métodos pueden ser como se describió previamente con respecto a los implantes terapéuticos de la invención.

La presente invención también se dirige a métodos para la fabricación de un implante de agente terapéutico. Los métodos para hacer un implante terapéutico dan como resultado con éxito la fabricación de composiciones terapéuticas que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgación. Los presentes métodos comprenden proporcionar tejido renal; mezclar el tejido renal con una solución que comprende un polímero, formando así una suspensión de polímero de tejido; expulsar la suspensión de polímero de tejido en una solución formadora de perlas, formando así un implante terapéutico que comprende perlas del polímero dentro de las cuales se encapsula el tejido renal.

El tejido renal se puede preparar de acuerdo con las técnicas descritas anteriormente, incluyendo la selección de un tipo de tejido y las dimensiones de procesamiento. La solución de polímero con la que se mezcla el tejido renal de acuerdo con la presente invención puede comprender una combinación de un polímero y un medio de crecimiento. Las características del polímero pueden determinarse como se describe anteriormente. Se puede usar cualquier medio de cultivo aceptable, caldo nutritivo o similar para el medio de crecimiento instantáneo; las características de un medio de crecimiento apropiado , que puede comprender una mezcla de medios, son determinadas fácilmente por los expertos en la técnica. Los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y presencia de otros componentes nutrientes, pero el medio de crecimiento debe cumplir al menos algunos de los requisitos nutricionales del tejido renal, y preferiblemente cumple con la mayoría o todos los requisitos nutricionales , y debe poseer el pH y otras características químicas necesarias para sostener y nutrir el tejido renal. Un ejemplo de un medio de crecimiento adecuado es el DUBELCOOS MODIFIED EAGLES MEDⁱU^m (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA). Los medios de crecimiento están disponibles comercialmente y los expertos en la técnica reconocen fácilmente los medios adecuados. Para prevenir la infección, se pueden agregar antibióticos, como penicilina, estreptomicina y similares. al medio de crecimiento. El suero, como el suero fetal bovino, también se puede agregar al medio de crecimiento .

La mezcla del tejido renal y la solución de polímero se puede lograr por cualquier medio que sea adecuado para formar una suspensión, es decir, una mezcla en la que el tejido renal se suspende de manera sustancialmente uniforme en la solución de polímero, como la agitación, la agitación, o vertiendo. Por ejemplo, la mezcla se puede lograr cargando el tejido renal y la solución de polímero en un primer recipiente, como una jeringa, transfiriendo la solución a otro recipiente, como expulsando el contenido de una jeringa a una segunda jeringa, transfiriendo la solución al primer recipiente, y luego repitiendo este ciclo según sea necesario hasta que se logre una suspensión.

Después de que se forma una suspensión, la suspensión se expulsa en solución que forma talón con el fin de formar perlas de polímero dentro del cual se encapsula el tejido renal. Los la extrusión puede comprender expulsar la suspensión de una jeringa, o transferir la suspensión de un recipiente a otro en el que está contenida la solución formadora de perlas, o alternativamente, transferir la solución formadora de perlas a un recipiente en el que la suspensión se lleva a cabo. La solución formadora de perlas puede ser iónica, puede ser una solución de reticulación, o ambas. En una realización, la solución formadora de perlas comprende CaC12. Las perlas de polímero con tejido renal encapsulado pueden formarse espontáneamente cuando se combinan con la solución formadora de perlas . El proceso de formación de perlas puede ser asistido adicionalmente, por ejemplo, agitando la mezcla de la suspensión y la solución formadora de perlas, modificando la temperatura de la mezcla (por ejemplo, elevando la temperatura), o ambos.

Después de la formación de las perlas de polímero, la reticulación química de las perlas puede conseguirse mediante la colocación de las perlas en una solución de reticulación. Para la reticulación, las perlas pueden transferirse a una solución diluida de polímero, preferiblemente un polímero diferente al componente principal de polímero de las perlas. Por ejemplo, si el componente principal de la perla de polímero comprende alginato, puede usarse una solución de dilución de poli-L-lisina para reticular las perlas de alginato. Opcionalmente, se puede agregar una capa de polímero adicional a las perlas de polímero después de su "producción" en la solución formadora de perlas, o después de la reticulación. Preferiblemente, la capa de polímero adicional comprende el mismo polímero que constituye el componente principal de las perlas de polímero. Por ejemplo, se puede agregar una capa de alginato adicional a una perla de la cual el componente principal es alginato. La adición de otra capa de polímero a las perlas de polímero se puede lograr colocando las perlas en una solución de polímero diluida que comprende el polímero del cual se fabricará la capa adicional.

La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos, si bien indican realizaciones de la invención, se proporcionan solo a modo de ilustración, y no deben interpretarse como limitantes de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 - Formación de implante terapéutico

Cuatro riñones de hembra, ratas Long Evans (ocho semanas de edad) se eliminaron quirúrgicamente, se enjuagaron en hielo frío tampón fosfato salino sin Ca2+ y Mg2 (PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y luego, utilizando un bisturí, se picaron en trozos pequeños (1 5 mm 3 ). Luego se usó un tamiz de acero 300 uM (Sigma, St. Louis, MO) para picar más los fragmentos de tejido. Luego, el tejido picado se lavó tres veces con 30-50 ml de medio de crecimiento que contenía Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) (Invitrogen) que contenía 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen) y 1% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone, Logan, UTAH). El lavado final se eliminó por completo y los fragmentos de tejido se cargaron en una jeringa de 1 mililitro de un sistema de mezcla de dos jeringas. Una solución de alginato al 1,8% (w/v) (Sigma) se preparó en Growth Medium y se cargó en la segunda jeringa de 1 mililitro. Las dos soluciones se mezclaron luego empujando el contenido hacia adelante y hacia atrás a través de ambos jeringas La suspensión de gel de tejido picado se expulso luego en una solución de CaCl² 100 mM. Las perlas de tejido encapsulados resultantes se incubaron a continuación a temperatura ambiente en CaCl² con agitación lenta durante 5 minutos. Las perlas fueron entonces reticuladas químicamente portransfiriéndose a poli-L-lisina al 0.05% (w/v), peso molecular 24.000 (Sigma) que contiene FBS al 1% durante 5 minutos y luego se reviste con otra capa de solución de alginato al 0.1% (w/v) Contiene 1% de FBS durante 5 minutos. Luego se transfirieron de cuatro a diez perlas a los pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con bajo contenido de 0,5 ml de medio de crecimiento o medios de crecimiento que contenían 100 ng/ml de ácido poli-D-glutámico (pDGA) (Sigma), y cultivado a 37 ° C durante cuatro días en condiciones atmosféricas normóxicas o hipóxicas (5% de oxígeno). Las perlas se examinaron visualmente y se tomaron imágenes con una cámara digital y un microscopio Eclipse TE2000-U (Nikon, Japón).

El examen visual de alginato encapsulado perlas de tejido mostró que la expulsión manual a través del sistema de jeringa de dos vías fue efectiva en la generación de imágenes esféricas, Del tejido que contiene perlas. Los fragmentos de tejido dentro de las perlas de alginato también fueron visibles, demostrando una distribución uniforme en todo el gel de alginato.

Ejemplo 2 - Mediciones del diámetro del cordón

Catorce perlas individuales que contienen tejido se colocaron en una placa de cultivo de tejido limpio y fotografiado usando un microscopio de disección Nikon equipado con una cámara digital. El diámetro de cada cuenta se midió utilizando el software IMAGE PRO PLUS.

El examen visual perlas de tejido de alginato encapsulado mostró que la extrusión manual a través del sistema de jeringa de dos vías fue eficaz en la generación de perlas esférica contenedoras de tejido. Los fragmentos de tejido dentro de las perlas de alginato también fueron visibles, demostrando una distribución uniforme en todo el gel de alginato. Se generaron ciento quince cuentas a partir de 3,72 g de tejido renal fragmentado, lo que dio como resultado aproximadamente 32 mg de tejido por perla. La tabla 1 muestra la distribución del diámetro de la perla.

TABLA 1

Se encontró que el diámetro promedio de catorce perlas individuales era 4.56 /- 0.44 mm.

Ejemplo 3 - Evaluación de la viabilidad celular

La viabilidad del tejido del riñón picado se evaluó utilizando ALAMAR BLUE (Invitrogen), un indicador REDOX colorimétrico que se reduce en respuesta a la actividad metabólica. Después de cuatro días en cultivo, se retiró el GROWTH MEDIUM gastado de las muestras de tejido renal no encapsulado, tejido renal encapsulado, tejido renal fijado con isopropanol y medio de crecimiento únicamente. Se añadió un mililitro de GROWTH MEDIUM, que contenía ALAM^a R BLUE al 10% , a las muestras y se incubó adicionalmente durante 2 a 4 horas a 37 ° C, 5% de CO2 con balanceo suave. Los medios gastados se analizaron espectrofotométricamente (SPECTRAMAX- 190, Molecular devices, Sunnyvale, CA) a 570nm y 600nm. Los medios de cada muestra se analizaron por triplicado. El porcentaje de reducción de ALAMAR BLUE se determinó siguiendo las instrucciones del fabricante y es una medida indirecta de la viabilidad celular.

Después de cuatro días de cultivo, se evaluó la viabilidad del tejido. En comparación con el tejido no encapsulado, la encapsulación mantuvo una mayor viabilidad tisular (Figura 1). El tejido renal no encapsulado, cultivado bajo normoxia o hipoxia mostró viabilidades medias relativas similares de 20.9% /- 3.4% y 21.0% /- 1.9%, respectivamente. Sin embargo, el tejido renal encapsulado, cultivado en condiciones normóxicas mostró un aumento en Viabilidad media relativa del tejido. El tejido encapsulado mostró una viabilidad media relativa del tejido de 83.5% /- 4.5%. El tejido renal encapsulado, cultivado en condiciones hipóxicas, dio como resultado una viabilidad tisular reducida del 31,3% /- 3,4%. Como se esperaba, la fijación del tejido resultó en una disminución significativa en la viabilidad del tejido a 5.0% /- 0.084%.

Ejemplo 4 - Análisis de la secreción de Epo

Después de cuatro días de cultivo, se recogió la media gastada y se determinó la cantidad de Epo liberado en el medio de cultivo usando un kit Quantikine Mouse/Rar eritropoyetina ELISA (R & D Systems, MN). La placa ELISA fue ensayada espectrofotométricamente (SPECTRAMAX-190, Molecular devices, Sunnyvale, CA) a 540 nm. Los datos se analizaron comparando los valores de absorbancia de muestras desconocidas con la regresión lineal de una curva estándar.

La cantidad de Epo liberado en el medio de cultivo se determinó en el día 4 post-encapsulación por ELISA. Los datos se normalizaron a valores de absorbencia obtenidos con Growth Medium (media corregida). Cada medición se realizó en medios gastados obtenidos de 8-10 perlas. También se calculó el error estándar de la media (SEM). Los datos mostrados en la Tabla 2, a continuación, se representan en forma gráfica en la FIG. 2.

Tabla 2

En la Fig. 2, las barras de datos representan el promedio de las mediciones triples, y las barras de error representan SEM. Cada medida fue llevada a cabo poe una media gastada obtenida por 8-10 perlas.

Los resultados mostraron que el tejido renal picado produjo 45.8 /- 3.3 pg / mL de Epo en el medio de cultivo circundante. Del mismo modo, la encapsulación de alginato no impidió la liberación de Epo del tejido picado, produciendo 79.3 /- 28.6 pg / mL de Epo. A fin de que determinar si la producción de Epo podría mejorarse químicamente, las perlas se prepararon y cultivaron en pDGA. Los resultados mostraron que el tratamiento con pDGA no afectó la producción de Epo, generando 60.9 /- 10.5 pg/mL de Epo. Como control negativo, se determinó la producción de Epo a partir de perlas sin tejido. Como se esperaba, no se detectó Epo medible en estas muestras. Ejemplo 5 - Análisis de la secreción de factor trófico

Después de cuatro días de cultivo, medio de cultivo usado se recogió de las perlas. Los restos celulares se eliminaron del medio de cultivo usado mediante centrifugación y el medio de cultivo se almacenó a -80°C. En el momento del análisis, el medio de cultivo usado se analizó mediante ELISA para los siguientes factores proteicos: interleucina-4 (IL-4), proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1), RANTES, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF) , interleucina-10 (IL-10), adiponectina, leptina, matriz metaloprotinasa-2 (MMP-2) con matrices de proteomas Searchlight (Pierce Biotechnology Inc.).

En comparación con medio de cultivo usado derivado de granos sin tejido encapsulación, perlas que contienen fragmentos de tejido renal segregaron cantidades elevadas de MCP-1 (50.6 /- 8.9 pg/mL), adiponectina (132,060.6 /- 11,226.7 pg / mL), leptina (10.3 /- 2.6 pg / mL) y MMP -2 (945.2 /- 13.3 pg / mL) y cantidades bajas a no detectables de IL-4, RANTES, GMCSF e lL-10. Como se muestra en la Tabla 3, a continuación, cada grupo de tratamiento contenía tres muestras (1,2, 3).

Tabla 3

Ejemplo 6 - Evaluación de la actividad estimulante de la eritropoyesis

Las eritroides de rata CD34 células (Lonza, Walkersville, MD) se resuspenden a 15.000 células / cm2 en IMDM con 10% de FBS. El medio acondicionado en perlas se añade luego al medio de ensayo que forma una colonia de metilcelulosa (MethoCult GF H4534, StemCell Technologies, Vancouver BC). Las células se agregan a la metilcelulosa y se plaquean con Incubación posterior a 37 ° C, en una incubadora con 5% de CO2 durante 12-14 días. Las colonias que contienen más de 50 células se cuentan por microscopía de contraste de fase.

La media condicionada derivada de tejido de riñón de rata encapsulado previamente ha demostrado que contienen Epo. Actualmente se muestra que los medios condicionados tienen actividad estimulante de la eritropoyesis (ESA) medida por la actividad BFU-E.

Ejemplo 7 - Evaluación de los efectos renoprotectores de fragmentos de tejido renal encapsulados

El objetivo de este estudio es evaluar los efectos renoprotective fragmentos de tejido de riñón de rata encapsulados de alginato en un modelo de rata de enfermedad renal de rata. Para estos experimentos se utilizan ratas Sprague Dawley (diabéticas o no diabéticas) con un peso inicial de 200-250 g. Las ratas se anestesian con una inyección intraperitoneal (5 mg/kg) de una solución 4: 1 de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina. La insuficiencia renal es inducida por un Nefrectomía en etapa de procedimiento. Las partes superior e inferior del riñón izquierdo (dos tercios de un riñón) se resecan utilizando una ligadura de seda mientras se preserva la cápsula renal. Diez días después, se extirpa el riñón derecho, dejando aproximadamente 1/6 de la masa renal total (5/6 nefrectomía). La aplicación de presión suave con metilcelulosa detiene el sangrado y el peritoneo y la piel se cierran en capas con suturas de Vicryl 4-0 reabsorbibles.

Cinco semanas después del procedimiento 5/6-nefrectomía, las perlas se trasplantan bajo la cápsula As como control, 5/6 ratas nefrectomizadas se inyectan con matriz de fibrina solamente. Las muestras de suero se obtienen los días 0 (antes de 5/6 nefrectomía) y el día 1 (día del trasplante de células ), los días 7, 14, 21, 28 y 35 (día de la necropsia). Nitrógeno ureico en sangre y La creatinina se cuantifica utilizando un ANALIZADOR DE QUÍMICA VETACE (Alpha Wassermann Diagnostic Technologies, LLC, West Caldwell, NJ).

Los animales de todos los grupos se sacrifican cinco semanas después del trasplante celular mediante dióxido de carbono axfitiatun. Los riñones son removidos para histología y análisis transcripcional. La mitad de cada riñón se congela instantáneamente en nitrógeno líquido para el análisis de RT-PCR. El mensajero RNA se aísla del tejido renal congelado por el coordinador del estudio y se somete a un análisis transcripcional utilizando tarjetas de microarrays de baja densidad que contienen pro-fibróticos y genes inflamatorios. La sección de riñón corneal restante se fija en formalina tamponada neutra al 10% para el análisis histológico posterior.

El tejido de riñón fijo para histología se procesa histológicamente, se seccionaron (5 pm de grosor) y se tiñeron con hematoxilina/eosina. La lesión tubular es evaluada y calificada por una patología veterinaria.

En este estudio, el trasplante subcapsular de riñón de alginato encapsulado fragmentos de tejido ralentiza la progresión de la lesión renal en 5/6 roedores nefrectomizadas o en modelos de roedores de la nefropatía diabética. Tanto los valores de creatinina sérica como de nitrógeno ureico en sangre se reducen significativamente en los animales tratados con hUTC en comparación con los animales de control. Además, el cordón disminuye los niveles de glucosa en la sangre en modelos de roedores de la nefropatía diabética. La evaluación de la lesión histológica revela una reducción de la necrosis tubular y la dilatación tubular en los animales tratados.

A pesar del creciente interés en la encapsulación de células como un método para suministrar agentes terapéuticos, se ha colocado escasa o ninguna atención en la encapsulación de todo el tejido fragmentos. Se ha demostrado en este documento que los fragmentos de tejido renal encapsulados secretan Epo y otros agentes beneficiosos en un medio de cultivo. Por lo tanto, los implantes terapéuticos descritos pueden proporcionar el tratamiento de numerosos estados de enfermedad.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un implante terapéutico que comprende tejido renal encapsulado dentro de una perla de polímero.

2. Un implante terapéutico que comprende tejido renal encapsulado dentro de una perla de polímero para uso en el tratamiento de la anemia, accidente cerebrovascular, enfermedad cardiovascular o enfermedad renal, comprendiendo dicho método la implantación del implante terapéutico dentro de un sujeto.

3. El implante terapéutico según la reivindicación 1, o el implante terapéutico según la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, en el que dicho tejido renal es tejido autólogo, tejido alogénico, tejido xenogénico, o cualquier combinación de los mismos.

4. Implante terapéutico según la reivindicación 1 o implante terapéutico según la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, en el que dicho tejido renal comprende células alteradas genéticamente.

5. Implante terapéutico según la reivindicación 1 o implante terapéutico según la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, en el que dicho tejido renal comprende fragmentos de tejido renal y en el que dichos fragmentos tienen un tamaño inferior a 1 mm.

6. Implante terapéutico según la reivindicación 1 o implante terapéutico según la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, que comprende al menos 30 mg de tejido renal.

7. El implante terapéutico de acuerdo con la reivindicación 1 o el implante terapéutico de acuerdo con la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, en el que dicha perla de polímero comprende alginato, ácido hialurónico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, dextrano, agarosa, poli-L lisina, carragenina, pectina, goma de tragacanto, goma xantana, goma guar, goma arábiga, colágeno tipo I , laminina, fibronectina, fibrina o cualquier combinación de los mismos.

8. El implante terapéutico según la reivindicación 1 o el implante terapéutico según la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, en el que dicha perla de polímero comprende alginato y poli-L-lisina.

9. El implante terapéutico según la reivindicación 1 o el implante terapéutico según la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, en el que dicha perla de polímero tiene un diámetro de 3 mm a 6 mm.

10. El implante terapéutico según la reivindicación 1 o el implante terapéutico según la reivindicación 2 para uso según la reivindicación 2, en el que dicho tejido secreta una o más hormonas, prohormonas, proteínas, factores de crecimiento, o cualquier combinación de los mismos.

11. El implante terapéutico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho tejido secreta una o más de eritropoyetina, MCP-1, adiponectina, leptina y MMP-2.

12. Un método para hacer un implante terapéutico que comprende: proporcionar tejido renal; mezclar dicho tejido renal con una solución que comprende un polímero, formando así una suspensión de polímero de tejido; expulsar dicha suspensión de polímero de tejido en una solución formadora de perlas, formando así un implante terapéutico que comprende perlas de dicho polímero dentro de las cuales se encapsula dicho tejido renal.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha solución que comprende un polímero comprende: alginato, ácido hialurónico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, dextrano, agarosa, poli-L-lisina, carragenina, pectina, goma tragacanto, goma xantana, guar goma, goma arábiga, colágeno tipo I, laminina, fibronectina, fibrina, o cualquier combinación de los mismos; y, un medio de crecimiento.

14. El método según la reivindicación 12, en donde dicha solución que forma una perla comprende una solución de reticulación, solución iónica o CaC 1².

15. Método según la reivindicación 12, que comprende además recubrir dichas perlas con una capa de polímero adicional.

16. El implante terapéutico de la reivindicación 1 o el implante terapéutico de acuerdo con la reivindicación 2 para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho tejido renal consiste en tejido endógeno natural .

17. El implante terapéutico según la reivindicación 16 o el implante terapéutico según la reivindicación 16 para uso según la reivindicación 16, en el que dicho tejido renal es humano.

18. El método de la reivindicación 12, en el que dicho tejido renal consiste en tejido endógeno de origen natural.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicho tejido renal es humano.