CN116554507A - 蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法，所述方法包括：S1.制备丝素蛋白冻干粉；S2.采用六氟异丙醇溶液溶解丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；S3.将丝素蛋白氟醇溶液与核黄素水溶液进行混合，得到混合溶液；丝素蛋白氟醇溶液与核黄素水溶液的体积比为5:1.5～5:4；S4.将混合溶液静置放置，直至混合溶液中气泡完全释放；S5.将静置后混合溶液注入模具中，静置形成丝素蛋白水凝胶；S6.采用紫外光源照射丝素蛋白水凝胶；S7.采用去离子水置换丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。本发明制得的蚕丝蛋白分子双网络水凝胶具有良好的生物弹性、生物兼容性和易加工性。
Description
技术领域
本发明涉及材料技术领域，尤其涉及一种蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法。
背景技术
蚕丝蛋白主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，丝素蛋白作为核心结构蛋白占据着蚕丝蛋白含量的70-80％。作为一种天然的蛋白质，丝素蛋白被发现有着良好的生物相容性、生物可吸收性、生物可降解性，在组织工程中具有巨大的应用潜力。研究者们通过设想丝素蛋白的潜在应用，已将丝素蛋白加工成薄膜、微粒、纳米球、纳米纤维基质、粘合剂、凝胶等形式，但是目前大多数的加工方式无法满足实际应用的需求，如直接将丝素蛋白加工成的凝胶有着脆而硬的特点，弹性模量较小，无法直接应用到组织工程中。所以现如今需要一种新的方法调控丝素蛋白的空间结构和结晶度，使其能够真正地得到应用。
水凝胶是以水为分散介质的凝胶，因其独特的三维网络结构，能贮存大量水分而不发生溶解，既有着固体的弹性又有着一定的流动性。除此之外，一般的水凝胶细胞毒性低、生物相容性好。所以，水凝胶在组织工程中具有巨大的应用潜力。但是水凝胶的机械强度较低，无法直接作为组织替换和修复的材料。所以人们正在寻找能够提升水凝胶机械强度的方法，而双网络水凝胶就是其中一种。所谓的双网络水凝胶就是通过物理交联或者化学交联的方法构建互相穿插的分子双网络，一个网络保证水凝胶的柔韧性，另一个网络限制水凝胶的变形，从而提升水凝胶的机械强度。目前，双网络水凝胶大多数由两个聚合物互穿网络构成，多种聚合物的引入势必会增加组织工程的风险。
丝素蛋白有着巨大的潜力，但是现如今丝素蛋白加工体系的不成熟阻碍了丝素蛋白实际应用；一般水凝胶应用受限于其机械强度。
发明内容
本发明提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法，其制得的蚕丝蛋白分子双网络水凝胶，具有材料来源天然、机械强度高，且具有良好的生物弹性、生物兼容性和易加工性。
一方面，本发明提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1.制备丝素蛋白冻干粉；
S2.采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；
S3.将所述丝素蛋白氟醇溶液与核黄素水溶液进行混合，得到混合溶液；所述核黄素水溶液的浓度为0.5% mg/ml～1.5%mg/ml、2%mg/ml、5% mg/ml、10%mg/ml中的至少一种，所述丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比为5:1.5～5:4；步骤S3包括：
S301.用天平称取适量的核黄素，向所述核黄素中加入超纯水，搅拌至溶液混合均匀，得到所述核黄素水溶液；
S302. 将第一预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；
其中，所述第一预设体积与所述第二预设体积的比值为5：1.5～5：4。
S4.将所述混合溶液静置放置，直至所述混合溶液中气泡完全释放；
S5.将静置后混合溶液注入模具中，静置形成丝素蛋白水凝胶；
S6.采用紫外光源照射所述丝素蛋白水凝胶；
S7.采用去离子水置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。
可选的，步骤S1包括：
S101.制备丝素蛋白水溶液；
S102.将所述丝素蛋白水溶液置于-30℃～-5℃的环境中冷冻；
S103.将冷冻后丝素蛋白水溶液置于冷冻干燥机中进行真空冷冻处理，得到所述丝素蛋白冻干粉；其中，真空冷冻的时间为5h～8h，真空冷冻的温度为-20℃～-5℃，真空冷冻的压强为0.005mBar～0.8mBar。
可选的，步骤S101包括：
S1011.称取干燥洁净的蚕茧置于碳酸钠溶液中，进行加热处理，除去所述蚕茧的丝胶蛋白进行脱胶，形成蚕丝；
S1012.将所述蚕丝置于超纯水中，进行多次洗涤；
S1013.将洗涤后的蚕丝进行干燥处理，并将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温一段时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液；
S1014.将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，置于超纯水中透析；
S1015.将透析后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心管中，进行离心处理，收集离心后的上层清液，得到所述丝素蛋白水溶液。
可选的，步骤S1011中，所述蚕茧为去除蚕蛹后的蚕茧；所述蚕茧的形状为长方形或者正方形，所述蚕茧的面积为1 mm2～1000mm2；所述碳酸钠溶液的浓度为20 g/L～80g/L，所述蚕茧的质量与所述碳酸钠溶液的体积比为（1：2 ）g/L。
可选的，步骤S1011中，所述碳酸钠溶液的加热方式为电炉加热或高压锅加热，加热温度为60℃～100℃，加热压强为0.5MPa～1MPa，加热时间为1s～1000h；所述蚕丝中丝素蛋白的平均分子量由加热时长控制，所述丝素蛋白的平均分子量为10KDa～300KDa。
可选的，步骤S1012中，所述蚕丝的洗涤方式为搅拌洗涤或静置浸泡，其中，搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，磁力搅拌速度为1 r/min～2000r/min；单次洗涤过程中，所述蚕丝与所述超纯水的质量比为1:20～1:50，时间为60s～5h；每次洗涤后取出所述蚕丝并挤干，重复洗涤次数为1次～50次。
可选的，步骤S1013中，所述干燥处理的干燥方式为自然风干或加热通风干燥，所述加热通风干燥的温度为50℃～70℃，干燥时间为1h～5h。
可选的，步骤S1013中，所述锂盐水溶液为硫氰酸锂溶液或溴化锂溶液，所述锂盐水溶液的浓度为0.01g/ml～2g/ml，干燥后的蚕丝的质量与所述锂盐水溶液的体积比为(1～100)：100g/ml；保温温度为30℃～50℃，保温时间为0.5h～5h。
可选的，步骤S1014中，所述透析袋的规格为10Da～10000000Da，透析方式为静置透析或磁力搅拌透析；其中，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为1 r/min～2000r/min，透析过程中换水的时间间隔为0.1h～100h，每次透析所需超纯水的体积为1mL～1000L。
可选的，步骤S1015中，所述离心处理的转速为10 r/min～20000r/min，时间为6s～2h，温度为1℃～5℃。
可选的，步骤S2中，所述丝素蛋白冻干粉与所述六氟异丙醇溶液的质量比为1：(1～10)，溶解温度为30℃～50℃，溶解时间为1h～5h，溶解时密封容器。
可选的，步骤S302包括：
基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合过程中所释放的热量对所述蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔；
根据所述第一预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数；
基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第一预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
可选的，步骤S302中，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为1ml～40ml，相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔为30s～1h。
可选的，步骤S302中，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积随着所述预设添加次数的增加而减小；相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而增大。
可选的，步骤S302包括：
S3021.将所述丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液；
S3022.对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液；
S3023.将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液；30s～1h后重复所述对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液，所述将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液的操作，直至添加次数为2次～40次。
可选的，步骤S4中，所述混合溶液静置放置的时间为30min～2h。
可选的，步骤S5包括：
S501.采用20ml～100ml的医用注射器，将所述静置后混合溶液注入所述模具中；
S502.在所述模具中静置形成所述丝素蛋白水凝胶；凝胶化温度为1℃～20℃，时间为0.1h～10h。
可选的，步骤S6中：
所述紫外光源的波长为长波315nm～380nm、中波280nm～315nm或短波200nm～280nm。
可选的，步骤S6包括：
S601.采用功率为20W～30W、波长为320nm～330nm的紫外光源，以第一照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h～0.3h；所述第一照射距离为1cm～2cm；
S602.采用功率为30W～40W、波长为335nm～345nm的紫外光源，以第二照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h～0.3h；所述第二照射距离为3cm～5cm；
S603.采用功率为50W～60W、波长为350nm～380nm的紫外光源，以第三照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.4h～0.9h；所述第三照射距离为6cm～10cm。
可选的，步骤S7包括：
S701. 采用温度为70℃～80℃的去离子水，第一次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.3h；
S703. 采用温度为50℃～60℃的去离子水，第二次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.3h～0.4h；
S705.采用温度为10℃～20℃的去离子水，第三次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.5h，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。
另一方面提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶采用如上所述的制备方法制备得到，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶的形状为L型、颜色为白色，在7.1Mpa的外力下的最大变形量为25.5mm，拉伸伸长率为800%～900%。
另一方面提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的应用，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶采用如上所述的制备方法制备得到，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶应用于在鼻部医美整形中进行鼻部的填充和修复。
本发明提供的蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法，具有如下技术效果：
（1）本发明采用丝素蛋白作为水凝胶的主要材料，不仅在生产过程中就减少了有机溶剂的添加，使得操作简单，成分安全，同时蛋白质作为一种天然高分子材料，对人体具有高度亲和性，能够被人体自然吸收，从而大大降低了手术后发生炎症感染的几率，提高了手术的安全性。
（2）相比于现存大多数的丝素蛋白材料的制备方法（直接将丝素蛋白水溶液凝胶成型的方法），本发明先将丝素蛋白水溶液制成冻干粉，降低水分子和丝素蛋白分子形成氢键的可能，即表现为分子间β-折叠结构减少，而分子内的β-折叠结构增加，增强了蚕丝蛋白材料本身的机械强度。
（3）本发明中六氟异丙醇相比于其他常见溶剂对丝素蛋白的溶解性较高，且六氟异丙醇在溶解丝素蛋白时，不会破坏丝素蛋白的结构；采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；得到的丝素蛋白氟醇溶液与核黄素混合后的混合溶液，能够形成具有优异溶胀性能、生物力学性能、生物相容性的丝素蛋白水凝胶。
（4）本发明将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，使得核黄素加量适中，促进丝素蛋白交联，进一步增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，使其水溶性降低，加速溶液凝胶化；加入核黄素可以形成分子双网络结构，蚕丝蛋白本身的β-折叠网络和氧自由基交联网络，可抑制长时间后β-折叠网络的进一步自发形成，从而避免材料变硬脆；使材料的力学性能更加柔韧、并且能够长期保持其柔韧性；且从溶液转变成凝胶的过程更加快速且可控。
（5）本发明通过控制丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比，可以使得混合溶液形成丝素蛋白水凝胶的时间小于10h，大大缩短了凝胶成型时间，缩短了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的制备时间，提高了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的生产效率。
（6）本发明实施例采用合适、高效的方法（例如，洗涤蚕丝除去可见的蚕茧自带的杂质和Na+；透析除去LIBr；离心除去蚕丝原来的杂质；用甲醇浸泡除去六氟异丙醇；甲醇水溶液浸泡除去甲醇），去除蚕丝中多余的杂质和离子，增加蚕丝蛋白双网络水凝胶的安全性。本发明实施例还可以根据不同的要求调整参数，改变蚕丝蛋白的空间结构，进一步调控蚕丝蛋白双网络水凝胶的强度，满足实际应用的需求（例如，通过加热蚕丝改变丝素蛋白的平均分子质量，进而调整相应的性能，丝素蛋白的平均分子质量越大，材料的韧性就越强）。
（7）本发明制得的蚕丝蛋白分子双网络水凝胶，具有材料来源天然、机械强度高，且具有良好的生物弹性、生物兼容性和易加工性等优点，在组织修复和替换中有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本说明书实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1是本说明书实施例提供的一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的其制备方法的流程示意图；
图2是本说明书实施例提供的一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的应力应变曲线图。
具体实施方式
下面将结合本说明书实施例中的附图，对本说明书实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，本实施例提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的制备方法，所述方法可以包括以下步骤：
S1.制备丝素蛋白冻干粉；
S2.采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；
S3.将所述丝素蛋白氟醇溶液与核黄素水溶液进行混合，得到混合溶液；所述核黄素水溶液的浓度为0.5%mg/ml～1.5%mg/ml、2%mg/ml、5% mg/ml、10%mg/ml中的至少一种，所述丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比为5:1.5～5:4；
S4.将所述混合溶液静置放置，直至所述混合溶液中气泡完全释放；
S5.将静置后混合溶液注入模具中，静置形成丝素蛋白水凝胶；
S6.采用紫外光源照射所述丝素蛋白水凝胶；
S7.采用去离子水置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。
在本说明书实施例中，相比于现存大多数的丝素蛋白材料的制备方法（直接将丝素蛋白水溶液凝胶成型的方法），本发明先将丝素蛋白水溶液制成冻干粉，降低水分子和丝素蛋白分子形成氢键的可能，即表现为分子间β-折叠结构减少，而分子内的β-折叠结构增加，增强了蚕丝蛋白材料本身的机械强度。
本发明中六氟异丙醇相比于其他常见溶剂对丝素蛋白的溶解性较高，且六氟异丙醇在溶解丝素蛋白时，不会破坏丝素蛋白的结构；采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；其中，丝素蛋白氟醇溶液与核黄素混合后的混合溶液，能够形成具有优异溶胀性能、生物力学性能、生物相容性的丝素蛋白水凝胶。
示例性的，步骤S1包括：
S101.制备丝素蛋白水溶液；
S102.将所述丝素蛋白水溶液置于-30℃～-5℃的环境中冷冻；
S103.将冷冻后丝素蛋白水溶液置于冷冻干燥机中进行真空冷冻处理，得到所述丝素蛋白冻干粉；其中，真空冷冻的时间为5h～8h，真空冷冻的温度为-20℃～-5℃，真空冷冻的压强为0.005mBar～0.8mBar。
在本说明书实施例中，本发明采用丝素蛋白作为水凝胶的主要材料，不仅在生产过程中就减少了有机溶剂的添加，使得操作简单，成分安全，同时蛋白质作为一种天然高分子材料，对人体具有高度亲和性，能够被人体自然吸收，从而大大降低了手术后发生炎症感染的几率，提高了手术的安全性。
示例性的，步骤S101包括：
S1011.称取干燥洁净的蚕茧置于碳酸钠溶液中，进行加热处理，除去所述蚕茧的丝胶蛋白进行脱胶，形成蚕丝；
S1012.将所述蚕丝置于超纯水中，进行多次洗涤；
S1013.将洗涤后的蚕丝进行干燥处理，并将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温一段时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液；
S1014.将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，置于超纯水中透析；
S1015.将透析后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心管中，进行离心处理，收集离心后的上层清液，得到所述丝素蛋白水溶液。
在本说明书实施例中，步骤S1011中，所述蚕茧为去除蚕蛹后的蚕茧；所述蚕茧的形状为长方形或者正方形，所述蚕茧的面积为1mm2～1000mm2；所述碳酸钠溶液的浓度为20g/L～80g/L，所述蚕茧的质量与所述碳酸钠溶液的体积比为（1：2 ）g/L。
示例性的，步骤S1011中，所述碳酸钠溶液的加热方式为电炉加热或高压锅加热，加热温度为60℃～100℃，加热压强为0.5MPa～1MPa，加热时间为1s～1000h；所述蚕丝中丝素蛋白的平均分子量由加热时长控制，所述丝素蛋白的平均分子量为10KDa～300KDa。丝素蛋白平均分子量越大，材料韧性越好，材料的可延展性越好；平均分子量越小，材料脆性越大，材料的可延展性越差。
在本说明书实施例中，洗涤蚕丝可以除去可见的蚕茧自带的杂质和Na+；透析除去锂盐；离心可以除去蚕丝中的杂质。主要通过加热蚕丝改变丝素蛋白的平均分子质量，进而调整相应的性能，丝素蛋白的平均分子质量越大，材料的韧性就越强。
示例性的，步骤S1012中，所述蚕丝的洗涤方式为搅拌洗涤或静置浸泡，其中，搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，磁力搅拌速度为1 r/min～2000r/min；单次洗涤过程中，所述蚕丝与所述超纯水的质量比为1:20～1:50，时间为60s～5h；每次洗涤后取出所述蚕丝并挤干，重复洗涤次数为1次～50次。
示例性的，步骤S1013中，所述干燥处理的干燥方式为自然风干或加热通风干燥，所述加热通风干燥的温度为50℃～70℃，干燥时间为1h～5h。
示例性的，步骤S1013中，所述锂盐水溶液为硫氰酸锂溶液或溴化锂溶液，所述锂盐水溶液的浓度为0.01g/ml～2g/ml，干燥后的蚕丝的质量与所述锂盐水溶液的体积比为(1～100)：100g/ml；保温温度为30℃～50℃，保温时间为0.5h～5h。
示例性的，步骤S1014中，所述透析袋的规格为10Da～10000000Da，透析方式为静置透析或磁力搅拌透析；其中，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为1 r/min～2000r/min，透析过程中换水的时间间隔为0.1h～100h，每次透析所需超纯水的体积为1mL～1000L。
示例性的，步骤S1015中，所述离心处理的转速为10 r/min～20000r/min，时间为6s～2h，温度为1℃～5℃。
在一些可行的实施例中，在上述步骤S1-上述步骤S2之间，上述方法还包括对丝素蛋白冻干粉进行固相增强颗粒掺杂的步骤。其中，固相增强颗粒包括陶瓷粉末、金属粉末、聚合物中的至少一种。相应地，溶解丝素蛋白冻干粉时，丝素蛋白冻干粉和固相增强颗粒的总质量与第一预设质量的比值为：1：(1～10)。
在一些可行的实施例中，在上述步骤S1-上述步骤S2之间，上述方法还包括制备丝素蛋白冻干粉对应的复合材料的步骤。具体可以为：将丝素蛋白冻干粉添加至含硫酸钙的磷酸钙复合粉体中，混合均匀，制得固相体系。将含Na+的固化液加入到固相体系中，调和成均匀的糊状物，经固化处理后得到复合材料。其中，磷酸钙复合粉体中所包含的硫酸钙的重量，与丝素蛋白冻干粉的重量比的范围为2～4，含Na+的固化液可以包括但不限于：Na2HPO4、NaH2PO4和NaOH 溶液。含硫酸钙的磷酸钙复合粉体可以为含硫酸钙的磷酸钙骨水泥基复合粉体。相应地，溶解丝素蛋白冻干粉时，丝素蛋白冻干粉和含硫酸钙的磷酸钙复合粉体的总质量（即合材料）与第一预设质量的比值为：1：(1～10)。由于制备得到的复合材料为与人体骨成分相似的羟基磷灰石。该复合材料可在体外环境中自固化后再植入体内，作为骨修复植入材料，该复合材料不仅其韧性和生物相容性较好，而且改善了磷酸钙骨水泥的孔结构、使其更接近人工骨。
示例性的，步骤S2中，所述丝素蛋白冻干粉与所述六氟异丙醇溶液的质量比为1：(1～10)，溶解温度为30℃～50℃，溶解时间为1h～5h，溶解时密封容器，从而可以防止所述六氟异丙醇溶液挥发，密封容器可以使用带盖子的密封玻璃瓶、密封注射器、或者聚合物薄膜密封的烧杯等。
在本说明书实施例中，步骤S3包括：
S301.用天平称取适量的核黄素，向所述核黄素中加入超纯水，搅拌至溶液混合均匀，得到所述核黄素水溶液；
S302. 将第一预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；
其中，所述第一预设体积与所述第二预设体积的比值为5：1.5～5：4。
在一对比实施例中，采用了第一预设体积和所述第二预设体积的比值分别为5：1、5：2、5：3、5：4的7ml的混合溶液置于模具中使其凝固形成丝素蛋白水凝胶，实验结果是5：1的混合溶液需要48h凝固，而其他比例的混合溶液的凝固时间小于10h。显然，本实施例中核黄素水溶液与丝素蛋白氟醇溶液的体积比的设置能够减少凝胶成型时间，缩短了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的制备时间，提高了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的生产效率。
示例性的，步骤S302包括：
基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合过程中所释放的热量对所述蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔；
根据所述第一预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数；
基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第一预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
在本说明书实施例中，核黄素为黄色或橙黄色结晶性粉末，分子量为376.37；其属于维生素B族成员之一，也称之为维生素B2，常被用作药物和食品添加剂；核黄素在紫外光的照射下，激发生成三线态，转移生成单线态氧为主的活性氧自由基，活性氧自由基可与各种分子发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的氨基、苯酚基以及其他基团产生化学交联。
该实施例中，由于核黄素水溶液在与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会释放热量，蛋白分子吸热会改变空间结构，可以预先确定核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合过程中所释放的热量对所述蛋白分子的空间结构的改变信息，即建立释放的热量与蛋白分子的空间结构的改变之间的映射关系。
可选地，上述映射关系可以通过实验进行确定得到。例如，可以预先配置样本核黄素水溶液和样本丝素蛋白氟醇溶液，并进行相应的实验。实验1：确定每次添加至所述样本丝素蛋白氟醇溶液中的样本核黄素水溶液的体积为A和相邻两次样本核黄素水溶液的添加时间间隔B，混合过程中释放的热量为热量1。实验2：确定每次添加至所述样本丝素蛋白氟醇溶液中的样本核黄素水溶液的体积为C和相邻两次样本核黄素水溶液的添加时间间隔D，混合过程中释放的热量为热量2。实验n：确定每次添加至所述样本丝素蛋白氟醇溶液中的样本核黄素水溶液的体积为X和相邻两次样本核黄素水溶液的添加时间间隔Y，混合过程中释放的热量为热量n。对实验1至实验n中混合得到的混合溶液中的蛋白分子的空间结构进行检测，发现实验2中的蛋白分子的空间结构改变满足上述预设条件，则可以将实验2中的体积为C作为每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，以及将添加时间间隔D作为相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔。
由于预先通过实验确定核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合过程中所释放的热量对所述蛋白分子的空间结构的改变信息，该改变信息能够指示释放的热量与蛋白分子的空间结构的改变之间的映射关系，因此通过该改变信息，确定最佳的添加体积和最佳的添加时间间隔，能够使得蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件，从而降低核黄素水溶液的加入过程对蛋白分子的空间结构的影响。在最佳的添加体积之后，可以根据已知的预设体积确定出最佳的预设添加次数，从而进一步降低核黄素水溶液的加入过程对蛋白分子的空间结构的影响，使得蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
纯丝素蛋白水凝胶的蛋白质结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主，所以丝素蛋白水凝胶的机械强度较低，而通过增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，在理论上可以增加丝素蛋白的机械强度。
本实施例通过加入适量的核黄素促进丝素蛋白交联，可以进一步增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，使其水溶性降低，加速溶液凝胶化，提高了材料的机械强度；核黄素加量适中，避免因加入过多的核黄素而导致蚕丝蛋白材料变脆，使其适合进行加工；核黄素属于天然物质，降低了植入风险。将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，使得核黄素加量适中，避免因加入过多的核黄素而导致制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶变脆，使制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶具有较好的机械性能。
示例性的，步骤S302中，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为1ml～40ml，相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔为30s～1h。
在本说明书实施例中，由于丝素蛋白的氟醇溶液是一种粘稠的液体，因此往其中加入核黄素水溶液更易操作，从而降低了蚕丝蛋白双网络水凝胶准备过程中的操作复杂度。且由于核黄素水溶液在与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会释放热量，蛋白分子吸热会改变空间结构，为了降低核黄素水溶液的加入过程对蛋白分子的空间结构的影响，使得蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件，可以将核黄素水溶液分多次缓慢加入丝素蛋白氟醇溶液中。此外，在实际生产中，快速加入大量的核黄素，不利于溶液混合均匀，为了使得核黄素水溶液和丝素蛋白氟醇溶液能够充分混合，可以通过分多次缓慢加入的方式，向丝素蛋白氟醇溶液中加入核黄素水溶液。且在实际生产中，快速加入大量的核黄素，不利于混合均匀，本实施例通过少量多次的加入方式有利于溶液快速混合均匀。
示例性的，步骤S302中，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积随着所述预设添加次数的增加而减小；相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而增大。
由于丝素蛋白的氟醇溶液是一种粘稠的液体，因此往其中加入核黄素水溶液更易操作，从而降低了蚕丝蛋白双网络水凝胶准备过程中的操作复杂度。且由于核黄素水溶液在与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会释放热量，蛋白分子吸热会改变空间结构，为了降低核黄素水溶液的加入过程对蛋白分子的空间结构的影响，使得蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件，可以将核黄素水溶液分多次缓慢加入丝素蛋白氟醇溶液中。此外，在实际生产中，快速加入大量的核黄素，不利于溶液混合均匀，为了使得核黄素水溶液和丝素蛋白氟醇溶液能够充分混合，可以将核黄素水溶液缓慢加入丝素蛋白氟醇溶液中。
示例性的，上述预设条件可以根据实际生产需求进行确定，在此不做具体限定。在一种实施方式中，针对改变数量或体积这一维度，该预设条件可以为：在丝素蛋白氟醇溶液中的所有蛋白分子中，空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变蛋白分子的数量或体积，为丝素蛋白氟醇溶液中的所有蛋白分子的数量或体积的0%～5%。在另一种实施方式中，该预设条件可以为：在丝素蛋白氟醇溶液中的所有蛋白分子中，空间结构为β-折叠结构的蛋白分子转换为其他空间结构（例如，α-螺旋结构）的比例为0%～5%。
示例性的，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积不同，且下一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，小于上一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积。
在本说明书实施例中，由于核黄素在与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会释放热量，如果每次添加的核黄素水溶液的体积同样多，或者预设添加次数的增加，每次核黄素水溶液的体积也增加，可能使得后一次添加的核黄素水溶液与前一次添加的核黄素水溶液叠加效果较为明显，从而导致释放出较多的热量，进而进一步增加对蛋白分子的空间结构的影响。基于此，为了进一步降低对蛋白分子的空间结构的影响，可以使得每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积不同，且下一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，小于上一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，即添加体积随着所述预设添加次数的增加而减小，这样能够有效避免前后添加的核黄素水溶液叠加效果，避免释放出较多的热量，进而进一步降低核黄素水溶液对蛋白分子的空间结构的影响。
示例性的，任意相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔不同，其第一时间间隔大于第二时间间隔；其中，所述第一时间间隔为：第目标次核黄素水溶液的目标添加时间与下一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔；所述第二时间间隔为所述第目标次核黄素水溶液的目标添加时间与上一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔。
在本说明书实施例中，若相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔相等，或者相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而减小，同样可能使得后一次添加的核黄素水溶液与前一次添加的核黄素水溶液叠加效果较为明显，从而导致释放出较多的热量，进而进一步增加对蛋白分子的空间结构的影响。基于此，为了进一步降低对蛋白分子的空间结构的影响，可以使得任意相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔不同，即下一次添加的时间间隔大于上一次添加的时间间隔，也即相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而增大，从而进一步避免前后添加的核黄素水溶液叠加效果，进而进一步避免释放出较多的热量，降低核黄素水溶液对蛋白分子的空间结构的影响。
在本说明书实施例中，由于核黄素与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会放热，而蛋白分子吸热会改变空间结构，通过不断减少核黄素水溶液的加料体积，不断延长核黄素水溶液的加料时间间隔，可以有效降低对蛋白分子材料结构的影响。
示例性的，步骤S302包括：
S3021.将所述丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液；
S3022.对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液；
S3023.将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液；30s～1h后重复所述对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液，所述将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液的操作，直至添加次数为2次～40次。
示例性的，假设预设添加次数为3次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为20ml、10ml、5ml，添加时间间隔为30min、1h。则可以首先将丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液，对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入20ml的核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液。将当前核黄素混合溶液重新作为当前溶液。30min后对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入10ml的核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液。将当前核黄素混合溶液重新作为当前溶液。1h后对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入5ml的核黄素水溶液，混合均匀。
示例性的，步骤S302包括：
对所述丝素蛋白氟醇溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入20mL的所述核黄素水溶液，得到一次混合溶液；然后间隔40s后，边搅拌边向所述一次混合溶液中缓慢加入15mL的所述核黄素水溶液，得到二次混合溶液；最后间隔20s后，边搅拌边向所述二次混合溶液中缓慢加入10mL的核黄素水溶液，得到所述混合溶液。
在本说明书实施例中，由于核黄素与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会放热，蛋白分子吸热会改变空间结构，为了降低对材料结构的影响，本实施例通过三次加料法，最大程度地降低了对蛋白分子的结构改变。
示例性的，步骤S4中，可以根据丝素蛋白氟醇溶液的浓度和流动性，设置静置时间以及静置温度，所述混合溶液静置放置的时间为30min～2h，温度可以为10℃～50℃。
示例性的，步骤S5包括：
S501.采用20～100ml的医用注射器，将所述静置后混合溶液注入所述模具中；
S502.在所述模具中静置形成所述丝素蛋白水凝胶；凝胶化温度为1℃～20℃，时间为0.1h～10h。其中，模具的结构和形状可以根据实际需要进行设置，例如，模具可以为定制的医美整形鼻假体模具。
在本说明书实施例中，通过控制丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比，可以使得混合溶液形成丝素蛋白水凝胶的时间小于10h，大大缩短了凝胶成型时间，缩短了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的制备时间，提高了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的生产效率。
示例性的，步骤S6中所述紫外光源的功率为20 W～60W，所述紫外光源的波长为长波315nm～380nm、中波280nm～315nm或短波200nm～280nm，照射距离为1cm～10cm；紫外光源照射所述丝素蛋白水凝胶的时间为0.2h～0.9h。
在本说明书实施例中，传统丝素水凝胶中的交联点多为物理交联点，在干燥过程中容易沿分子链滑移产生大量结晶结构，从而大大限制其吸水能力；通过核黄素能促进丝素蛋白的交联，核黄素在紫外光源的照射下，产生的活性氧自由基可与丝素蛋白分子链上的酪氨酸发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的氨基产生化学交联，获得以无规卷曲结构为主的光固化水凝胶。
示例性的，步骤S6包括：
S601.采用功率为20W～30W、波长为320nm～330nm的紫外光源，以第一照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h～0.3h；所述第一照射距离为1cm～2cm；
S602.采用功率为30W～40W、波长为335nm～345nm的紫外光源，以第二照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h～0.3h；所述第二照射距离为3cm～5cm；
S603.采用功率为50 W～60W、波长为350nm～380nm的紫外光源，以第三照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.4h～0.9h；所述第三照射距离为6cm～10cm。
在本说明书实施例中，通过不同功率、不同波长的紫外光源对所述丝素蛋白水凝胶分别进行照射，可以提高核黄素能与丝素蛋白的交联效率，提高蚕丝蛋白双网络水凝胶的稳定性以及生物弹性。
示例性的，步骤S7中，所述去离子水的温度为10℃～80℃，置换时间为0.2h～100h。
示例性的，步骤S7包括：
S701. 采用温度为70℃～80℃的去离子水，第一次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.3h；
S703. 采用温度为50℃～60℃的去离子水，第二次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.3h～0.4h；
S705.采用温度为10℃～20℃的去离子水，第三次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.5h，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。
在本说明书实施例中，通过不同温度的去离子水，对丝素蛋白水凝胶进行多次置换，可以提高置换效率；先采用高温的去离子水进行置换，再采用低温的去离子水进行置换，相比于现有技术中使用同一温度的去离子水进行置换的方式，本实施例的多次置换方式可以在保证置换效果的情况下，提高置换效率。
在一些可行的实施例中，在得到蚕丝蛋白双网络水凝胶之后，上述方法还可以包括：
对所述蚕丝蛋白双网络水凝胶进行水蒸汽退火处理、空冷处理和致密化处理，以进一步调节蚕丝蛋白材料在人体内的溶解和降解速率，得到处理后的蚕丝蛋白双网络水凝胶。
示例性地，该水蒸汽退火处理可以包括：将蚕丝蛋白双网络水凝胶置于50%～60%相对湿度和室温下进行水蒸气退火，退火温度10℃～100℃，时间范围为30s～1000h。具体地，可以将蚕丝蛋白双网络水凝胶置于退火炉中，使退火炉内温度逐渐升温至10℃～100℃，保温时间为30s～1000h。
在水蒸汽退火过程中，水分子穿透了蚕丝蛋白双网络水凝胶，提高了丝素蛋白链网络的流动性，使其变得足够柔软，可以加工成任意形状。此外，退火处理增加了丝蛋白β-折叠结构的含量，降低了丝蛋白在水中的溶解度，因此形成了相对稳定的刚性结构，从而提高了蚕丝蛋白双网络水凝胶的机械强度。
示例性地，该空冷处理可以包括：将水蒸汽退火处理后的蚕丝蛋白双网络水凝胶从炉中取出，并在空气中冷却1min～2h，以固定蚕丝蛋白双网络水凝胶的形状。
示例性地，致密化处理可以包括：将经过水蒸气退火的蚕丝蛋白双网络水凝胶垂直压缩以致密化，从而进一步提高蚕丝蛋白双网络水凝胶的机械强度。
通过上述水蒸汽退火处理、空冷处理和致密化处理后的蚕丝蛋白双网络水凝胶，可以被加工成任意形状，并植入人体中。且通过上述水蒸汽退火处理、空冷处理和致密化处理后的蚕丝蛋白双网络水凝胶显示出较好的生物降解性，其可以在35℃～37℃下，20天～30天内完全生物降解。此外，致密化处理后的蚕丝蛋白双网络水凝胶还可以承受相当于自身重量约500～1000倍的砝码。
实施例2
本实施例提供了一种丝素蛋白双网络的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取干燥洁净的蚕茧置于碳酸钠溶液中，进行加热处理，除去所述蚕茧的丝胶蛋白进行脱胶，形成蚕丝；所述蚕茧为去除蚕蛹后的蚕茧；可以是整体开口的蚕茧，也可以是剪碎的蚕茧。如果采用剪碎的蚕茧，则形状为条形或者方形，当然，也可以是其他合适的形状，在此不作限定。所述蚕茧的面积为100mm2；所述碳酸钠溶液的浓度为10g/L，所述蚕茧的质量与所述碳酸钠溶液的体积比为（1：2 ）g/L。所述碳酸钠溶液的加热方式为电炉加热，加热温度为80℃，加热压强为0.8MPa，加热时间为1h；所述丝素蛋白的平均分子量为100KDa。
（2）将所述蚕丝置于超纯水中，进行多次洗涤；所述蚕丝的洗涤方式为搅拌洗涤或静置浸泡，其中，搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，磁力搅拌速度为300r/min；单次洗涤过程中，所述蚕丝与所述超纯水的质量比为1:30，时间为2h；每次洗涤后取出所述蚕丝并挤干，重复洗涤次数为10次。
（3）将洗涤后的蚕丝进行干燥处理，并将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温一段时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液；所述干燥处理的干燥方式为加热通风干燥，所述加热通风干燥的温度为60℃，干燥时间为2h。所述锂盐水溶液为溴化锂溶液，溴化锂溶液的浓度为0.15g/ml，干燥后的蚕丝的质量与所述锂盐水溶液的体积比为3：10g/ml；保温温度为35℃，保温时间为2h。
（4）将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，置于超纯水中透析；所述透析袋的规格为1000Da（道尔顿），透析方式磁力搅拌透析；其中，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为200r/min，透析过程中换水的时间间隔为2h，每次透析所需超纯水的体积为10L。
（5）将透析后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心管中，进行离心处理，收集离心后的上层清液，得到所述丝素蛋白水溶液。所述离心处理的转速为10～20000r/min，时间为0.5h，温度为2℃。
（6）将所述丝素蛋白水溶液置于-8℃的环境中冷冻；将冷冻后丝素蛋白水溶液置于冷冻干燥机中进行真空冷冻处理，得到所述丝素蛋白冻干粉；其中，真空冷冻的时间为6h，真空冷冻的温度为-8℃，真空冷冻的压强为0.2mBar。
（7）采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；所述丝素蛋白冻干粉与所述六氟异丙醇溶液的质量比为1：2；溶解温度为40℃，溶解时间为2h，溶解时密封容器。
（8）用天平称取适量的核黄素，向所述核黄素中加入超纯水，搅拌至溶液混合均匀，得到所述核黄素水溶液；所述核黄素水溶液的浓度为2%mg/ml。
（9）将第一预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀得到混合溶液，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；
其中，所述第一预设体积与所述第二预设体积的比值为5：2。
具体的，基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合过程中所释放的热量对所述蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔；根据所述第一预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数；基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第一预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
（10）将所述混合溶液静置放置50min，直至所述混合溶液中气泡完全释放。
（11）采用80ml的医用注射器，将所述静置后混合溶液注入所述模具中；在所述模具中静置形成所述丝素蛋白水凝胶；凝胶化温度为10℃，时间为8h。
（12）先采用功率为25W、波长为325nm的紫外光源，以第一照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h；所述第一照射距离为1cm；再采用功率为30W、波长为335nm的紫外光源，以第二照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h；所述第二照射距离为3cm；然后，采用功率为40W、波长为365nm的紫外光源，以第三照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.5h；所述第三照射距离为6cm。
（13）采用温度为70℃的去离子水，第一次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h；再采用温度为50℃的去离子水，第二次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.3h；然后采用温度为10℃的去离子水，第三次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。
实施例3
与实施例二不同的是，本发明实施例中的核黄素水溶液质量溶度为2mg/ml。且将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：2混合均匀。
实施例4
与实施例二不同的是，本发明实施例中的核黄素水溶液质量溶度为5mg/ml。且将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：3混合均匀。
实施例5
与实施例二不同的是，本发明实施例中的核黄素水溶液质量溶度为10mg/ml。且将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：4混合均匀。
实施例6
本实施例提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶采用上述实施例1-5的制备方法制备得到， 表1为不同实施例所制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶的性能数据对比表，如表1所示，核黄素能够增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，β-折叠结构的含量越高，丝素蛋白水溶性越低，从而加速溶液凝胶化，因此实施例5制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶的吸水倍数最低，凝固时间最短，而实施例2制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶的吸水倍数最高，凝固时间最长。
由于过多的核黄素会导致制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶变脆，为了提高制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶具有较好的机械性能，本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按不同体积比进行混合，丝素蛋白氟醇溶液体积越高，制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶的机械性能越高，因此实施例2制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶的机械性能最高，实施例5制备得到的蚕丝蛋白双网络水凝胶的机械性能最低。
表1
采用实施例2的方法制备了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶的形状为可以为L型的鼻假体形状、颜色为白色。对本实施例制备的蚕丝蛋白双网络水凝胶进行力学性能测试，截取长度28.54mm、直径13.03mm的一段圆柱体进行性能测试，将上述圆柱体试样置于力学万能试验机上，设置实验速度为5mm/min，当试样被压至鼓形停止实验；得到如图2所示的应力应变曲线，横坐标为应变位移，纵坐标为外加的应力；由应力应变曲线图可知，随着应力的增加，材料的塑性变形逐渐增大，至应力达到强度极限之后，材料将开始发生不均匀的塑性变形，产生缩颈，变形量迅速增大至K点，而发生断裂，故强化阶段拉伸强度最大。试验结果的应力应变曲线符合试验预期，其包括弹性阶段、屈服阶段和强化阶段。测试数据的结果如下表2所示，其中，Fmc表示施加在圆柱体横截面积上的力，Rmc表示圆柱体在压缩过程中所受的最大应力。在7.1Mpa的外力下的最大变形量为25.5mm，最大应力为713.0N，拉伸伸长率为800%～900%。
表2
实施例7
本实施例提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的应用，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶采用上述的制备方法制备得到，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶应用于在鼻部医美整形中进行鼻部的填充和修复。
综上所述，本发明提供的蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法，具有如下技术效果：
（1）本发明采用丝素蛋白作为水凝胶的主要材料，不仅在生产过程中就减少了有机溶剂的添加，使得操作简单，成分安全，同时蛋白质作为一种天然高分子材料，对人体具有高度亲和性，能够被人体自然吸收，从而大大降低了手术后发生炎症感染的几率，提高了手术的安全性。
（2）相比于现存大多数的丝素蛋白材料的制备方法（直接将丝素蛋白水溶液凝胶成型的方法），本发明先将丝素蛋白水溶液制成冻干粉，降低水分子和丝素蛋白分子形成氢键的可能，即表现为分子间β-折叠结构减少，而分子内的β-折叠结构增加，增强了蚕丝蛋白材料本身的机械强度。
（3）本发明中六氟异丙醇相比于其他常见溶剂对丝素蛋白的溶解性较高，且六氟异丙醇在溶解丝素蛋白时，不会破坏丝素蛋白的结构；采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；得到的丝素蛋白氟醇溶液与核黄素混合后的混合溶液，能够形成具有优异溶胀性能、生物力学性能、生物相容性的丝素蛋白水凝胶。
（4）本发明将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，使得核黄素加量适中，促进丝素蛋白交联，进一步增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，使其水溶性降低，加速溶液凝胶化；加入核黄素可以形成分子双网络结构，蚕丝蛋白本身的β-折叠网络和氧自由基交联网络，可抑制长时间后β-折叠网络的进一步自发形成，从而避免材料变硬脆；使材料的力学性能更加柔韧、并且能够长期保持其柔韧性；且从溶液转变成凝胶的过程更加快速且可控。
（5）本发明通过控制丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比，可以使得混合溶液形成丝素蛋白水凝胶的时间小于10h，大大缩短了凝胶成型时间，缩短了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的制备时间，提高了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的生产效率。
（6）本发明实施例采用合适、高效的方法（例如，洗涤蚕丝除去可见的蚕茧自带的杂质和Na+；透析除去LIBr；离心除去蚕丝原来的杂质；用甲醇浸泡除去六氟异丙醇；甲醇水溶液浸泡除去甲醇），去除蚕丝中多余的杂质和离子，增加蚕丝蛋白双网络水凝胶的安全性。本发明实施例还可以根据不同的要求调整参数，改变蚕丝蛋白的空间结构，进一步调控蚕丝蛋白双网络水凝胶的强度，满足实际应用的需求（例如，通过加热蚕丝改变丝素蛋白的平均分子质量，进而调整相应的性能，丝素蛋白的平均分子质量越大，材料的韧性就越强）。
（7）本发明制得的蚕丝蛋白分子双网络水凝胶，具有材料来源天然、机械强度高，且具有良好的生物弹性、生物兼容性和易加工性等优点，在组织修复和替换中有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (20)
1.一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1.制备丝素蛋白冻干粉；
S2.采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；
S3.将所述丝素蛋白氟醇溶液与核黄素水溶液进行混合，得到混合溶液；所述核黄素水溶液的浓度为0.5%mg/ml～1.5%mg/ml、2%mg/ml、5%mg/ml、10%mg/ml中的至少一种，所述丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比为5:1.5～5:4；步骤S3包括：
S301.用天平称取适量的核黄素，向所述核黄素中加入超纯水，搅拌至溶液混合均匀，得到所述核黄素水溶液；
S302. 将第一预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；
其中，所述第一预设体积与所述第二预设体积的比值为5：1.5～5：4；
S4.将所述混合溶液静置放置，直至所述混合溶液中气泡完全释放；
S5.将静置后混合溶液注入模具中，静置形成丝素蛋白水凝胶；
S6.采用紫外光源照射所述丝素蛋白水凝胶；
S7.采用去离子水置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1包括：
S101.制备丝素蛋白水溶液；
S102.将所述丝素蛋白水溶液置于-30℃～-5℃的环境中冷冻；
S103.将冷冻后丝素蛋白水溶液置于冷冻干燥机中进行真空冷冻处理，得到所述丝素蛋白冻干粉；其中，真空冷冻的时间为5h～8h，真空冷冻的温度为-20℃～-5℃，真空冷冻的压强为0.005mBar～0.8mBar。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S101包括：
S1011.称取干燥洁净的蚕茧置于碳酸钠溶液中，进行加热处理，除去所述蚕茧的丝胶蛋白进行脱胶，形成蚕丝；
S1012.将所述蚕丝置于超纯水中，进行多次洗涤；
S1013.将洗涤后的蚕丝进行干燥处理，并将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温一段时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液；
S1014.将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，置于超纯水中透析；
S1015.将透析后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心管中，进行离心处理，收集离心后的上层清液，得到所述丝素蛋白水溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1011中，所述蚕茧为去除蚕蛹后的蚕茧；所述蚕茧的形状为长方形或者正方形，所述蚕茧的面积为1mm2～1000mm2；所述碳酸钠溶液的浓度为20g/L～80g/L，所述蚕茧的质量与所述碳酸钠溶液的体积比为（1：2 ）g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1011中，所述碳酸钠溶液的加热方式为电炉加热或高压锅加热，加热温度为60℃～100℃，加热压强为0.5MPa～1MPa，加热时间为1s～1000h；所述蚕丝中丝素蛋白的平均分子量由加热时长控制，所述丝素蛋白的平均分子量为10KDa～300KDa。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1012中，所述蚕丝的洗涤方式为搅拌洗涤或静置浸泡，其中，搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，磁力搅拌速度为1r/min～2000r/min；单次洗涤过程中，所述蚕丝与所述超纯水的质量比为1:20～1:50，时间为60s～5h；每次洗涤后取出所述蚕丝并挤干，重复洗涤次数为1次～50次。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1013中，所述干燥处理的干燥方式为自然风干或加热通风干燥，所述加热通风干燥的温度为50℃～70℃，干燥时间为1h～5h。
8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1013中，所述锂盐水溶液为硫氰酸锂溶液或溴化锂溶液，所述锂盐水溶液的浓度为0.01g/ml～2g/ml，干燥后的蚕丝的质量与所述锂盐水溶液的体积比为(1～100)：100g/ml；保温温度为30℃～50℃，保温时间为0.5 h～5h。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1014中，所述透析袋的规格为10Da～10000000Da，透析方式为静置透析或磁力搅拌透析；其中，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为1r/min～2000r/min，透析过程中换水的时间间隔为0.1h～100h，每次透析所需超纯水的体积为1mL～1000L。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1015中，所述离心处理的转速为10r/min～20000r/min，时间为6s～2h，温度为1℃～5℃。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述丝素蛋白冻干粉与所述六氟异丙醇溶液的质量比为1：(1～10)，溶解温度为30℃～50℃，溶解时间为1h～5h，溶解时密封容器。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S302包括：
基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合过程中所释放的热量对所述蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔；
根据所述第一预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数；
基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第一预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤S302中，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为1ml～40ml，相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔为30s～1h。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤S302中，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积随着所述预设添加次数的增加而减小；相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而增大。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S302包括：
S3021.将所述丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液；
S3022.对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液；
S3023.将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液；30s～1h后重复所述对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液，所述将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液的操作，直至添加次数为2次～40次。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述混合溶液静置放置的时间为30min～2h。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5包括：
S501.采用20ml～100ml的医用注射器，将所述静置后混合溶液注入所述模具中；
S502.在所述模具中静置形成所述丝素蛋白水凝胶；凝胶化温度为1℃～20℃，时间为0.1h～10h。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6中：
所述紫外光源的波长为长波315nm～380nm、中波280nm～315nm或短波200nm～280nm。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S7包括：
S701. 采用温度为70℃～80℃的去离子水，第一次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.3h；
S703. 采用温度为50℃～60℃的去离子水，第二次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.3h～0.4h；
S705.采用温度为10℃～20℃的去离子水，第三次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.5h，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。
20.一种蚕丝蛋白双网络水凝胶，其特征在于，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶采用如权利要求1-19任一项所述的制备方法制备得到，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶的形状为L型、颜色为白色，在7.1Mpa的外力下的最大变形量为25.5mm，拉伸伸长率为800%～900%。
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