CN116574283B - 蚕丝蛋白块材的制备方法及蚕丝蛋白块材 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚕丝蛋白块材的制备方法及蚕丝蛋白块材，该制备方法包括：制备核黄素水溶液和丝素蛋白氟醇溶液；将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，将混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间；将静置第一预设时间后的混合溶液注入预设模具凝胶成型，得到丝素蛋白固体；将丝素蛋白固体照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用甲醇置换丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇；使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换；将用水置换后的丝素蛋白固体风干，得到蚕丝蛋白块材。本发明制备得到的蚕丝蛋白块材的降解速度适中、性质稳定、可加工性强、机械强度可调控，可以用于植入医疗器械等领域。
Description
技术领域
本发明属于高分子聚合物材料领域，尤其涉及一种蚕丝蛋白块材的制备方法及蚕丝蛋白块材。
背景技术
蚕丝是一种天然的蛋白质，主要由丝胶蛋白和丝素蛋白组成，而丝素蛋白具有高比表面积、良好生物相容性、生物降解性、低毒性、低免疫原性、优异的机械性能和生物活性，因而被广泛应用于组织工程、纳米材料、纺织品等领域。
丝素蛋白一般是由重链、轻链、糖蛋白P25三个多肽组成，其中重链和轻链通过二硫共价键连接，而糖蛋白P25通常是通过非共价作用方式与丝素蛋白的重链和轻链进行连接的。在丝素蛋白分子中，重链和轻链的N-末端和C-末端分别暴露在外，而糖蛋白P25的结构上则包含了很多的糖基部分。这些糖基可以与重链和轻链暴露在外的氨基酸残基上的一些阳离子相互作用，从而实现丝素蛋白的形成。
现有技术中的可植入材料，如聚乳酸、镁合金、羟基磷灰石等，虽然基本都具有生物相容性较好，生物可降解的优点，但是或多或少存在不尽人意的地方。聚乳酸在人体内虽可降解，但是降解速度较慢，容易长期存在人体内，增加感染和其他并发症的风险。镁合金在潮湿环境下易发生腐蚀，在植入人体后，可能会导致自身失效和对周围组织造成损伤。羟基磷灰石存在脆性大、降解慢、可加工性差的缺点，也容易增加感染的风险。所以有必要研发降解速度适中、性质稳定、可加工性强、机械强度可调控的新型材料应用于可植入块材中。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种蚕丝蛋白块材的制备方法及蚕丝蛋白块材。
为实现上述目的，一方面，本发明提供一种蚕丝蛋白块材的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
制备核黄素水溶液和丝素蛋白氟醇溶液；所述核黄素水溶液的质量浓度为0.5%mg/ml～1.6%mg/ml、2%mg/ml、5%mg/ml、10%mg/ml中的至少一种；
将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，将混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间；所述将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，包括：将第二预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构，在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；其中，所述第二预设体积和所述第三预设体积的比值为5：1.5～5：4；
将静置第一预设时间后的混合溶液注入预设模具凝胶成型，得到丝素蛋白固体；
将所述丝素蛋白固体照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇；
使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换；
将用水置换后的丝素蛋白固体风干，得到蚕丝蛋白块材。
在一些可选的实施例中，所述制备核黄素水溶液包括：
称取预设质量的核黄素；
基于所述核黄素水溶液的质量浓度确定溶解所述核黄素的超纯水的第一预设体积；
向所述核黄素中加入第一预设体积的超纯水，并搅拌均匀，得到所述核黄素水溶液。
在一些可选的实施例中，所述将第二预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，包括：
基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合中所释放的热量对蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔；
根据所述第二预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数；
基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第二预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构，在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
在一些可选的实施例中，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积不同，且下一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，小于本次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积。
在一些可选的实施例中，相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔不同，且第一时间间隔大于第二时间间隔；
其中，所述第一时间间隔为：第目标次核黄素水溶液的目标添加时间，与第目标次对应的下一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔；所述第二时间间隔为：第目标次核黄素水溶液的目标添加时间，与第目标次对应的上一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔。
在一些可选的实施例中，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为1ml～40ml，相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔为30s～1h。
在一些可选的实施例中，所述基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第二预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，包括：
将所述丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液；
对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液；
将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液；
30s～1h后重复对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液，将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液的操作，直至添加次数为2次～40次。
在一些可选的实施例中，所述混合得到的混合溶液注入预设模具凝胶成型的成型时间为15h～100h，所述混合得到的混合溶液注入预设模具凝胶成型的成型温度为30℃～100℃。
在一些可选的实施例中，所述将所述丝素蛋白固体照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇，包括：
将所述丝素蛋白固体用紫外光源照射第二预设时间后浸没于无水甲醇中，以使用所述无水甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇；
其中，所述紫外光源的功率为20W～60W，所述紫外光源的波长包括第一波长、第二波长和第三波长，所述第一波长为315nm～380nm，所述第二波长为280nm～315nm，所述第三波长为200nm～280nm，所述紫外光源照射距离为0cm～20cm；所述第二预设时间为0.1h～1h，所述无水甲醇的体积范围为1500ml～2000ml，每隔1h～50h更换一次无水甲醇，无水甲醇的更换次数为1次～50次。
在一些可选的实施例中，所述使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换，包括：
依次使用浓度梯度递减的甲醇水溶液浸泡丝素蛋白固体，直至丝素蛋白固体中的甲醇被置换出；
其中，所述甲醇水溶液中的甲醇浓度范围为100％～0且不为0，甲醇水溶液的更换时间间隔为1h～50h，甲醇水溶液的更换次数为1次～50次。
在一些可选的实施例中，制备丝素蛋白氟醇溶液，包括：
制备丝素蛋白冻干粉；
将第一预设质量的氟醇溶液加入第二预设质量的所述丝素蛋白冻干粉中，以通过所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，得到所述丝素蛋白氟醇溶液；
其中，所述氟醇溶液为六氟异丙醇，所述第二预设质量与所述第一预设质量的比值为1：(1～10)，所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉的温度范围为5℃～80℃，所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉的溶解时间范围为0.1h～100h。
在一些可选的实施例中，所述制备丝素蛋白冻干粉，包括：
称取第三预设质量的蚕茧于碳酸钠溶液中加热，以使所述蚕茧除去丝胶蛋白进行脱胶形成蚕丝；
对完成脱胶的蚕丝进行洗涤处理；
将洗涤后的蚕丝进行干燥；
将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温第三预设时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液；
将所述丝素蛋白锂盐水溶液进行透析处理；
将透析处理后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心装置进行离心处理，离心完成后收集上层清液得到丝素蛋白水溶液；
将所述丝素蛋白水溶液冷冻后干燥得到丝素蛋白冻干粉。
在一些可选的实施例中，所述蚕茧为去除蚕蛹的蚕茧；所述蚕茧的形状为长方形或者正方形，所述蚕茧的面积为1mm2～1000mm2。
在一些可选的实施例中，所述对完成脱胶的蚕丝进行洗涤处理，包括：
将完成脱胶的蚕丝置于超纯水中进行搅拌洗涤或静置浸泡处理；
其中，所述搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，所述磁力搅拌的速度为1r/min～2000r/min；单次洗涤过程中，蚕丝和超纯水的质量比为1:10～1:1000，洗涤时间为1s～200h，每次洗涤后取出蚕丝并挤干，洗涤重复次数为1次～50次。
在一些可选的实施例中，所述将洗涤后的蚕丝进行干燥，包括：
将所述洗涤后的蚕丝进行自然风干或加热通风干燥；
其中，所述加热通风干燥的加热温度为40℃～100℃，干燥时间为0.1h～100h。
在一些可选的实施例中，所述锂盐水溶液为硫氰酸锂溶液、溴化锂溶液中的至少一种，所述锂盐水溶液的浓度为0.01g/ml～2g/ml，干燥后的蚕丝的质量和所述锂盐水溶液的体积比为(1～100)：100g/ml；干燥后的蚕丝与所述锂盐水溶液搅拌混合均匀后的保温温度为20℃～100℃，保温时间为0.1h～100h。
在一些可选的实施例中，所述将所述丝素蛋白锂盐水溶液进行透析处理，包括：
将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，并置于超纯水中进行静置透析或磁力搅拌透析；
其中，所述透析袋的规格为10Da～10000000Da，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为1r/min～2000r/min，透析过程中更换超纯水的时间间隔为0.1h～100h，每次更换所需超纯水的体积为1mL～1000L。
在一些可选的实施例中，所述离心装置进行离心处理的转速为1r/min～40000r/min，离心时间为1s～10h，离心温度为-3℃～10℃。
在一些可选的实施例中，所述将所述丝素蛋白水溶液冷冻后干燥得到丝素蛋白冻干粉，包括：
将所述丝素蛋白水溶液置于-80℃～0℃的环境中冷冻，将冷冻后的所述丝素蛋白水溶液放入冷冻干燥装置中进行真空冷冻，真空冷冻的冷冻时间为1h～500h，真空冷冻的冷冻温度为-80℃～0℃，真空冷冻的压强为0.1Pa～100Pa。
在一些可选的实施例中，在所述称取第三预设质量的蚕茧于碳酸钠溶液中加热，以使所述蚕茧除去丝胶蛋白进行脱胶形成蚕丝的过程中，通过控制加热时间调整丝素蛋白的平均分子量，丝素蛋白的平均分子量范围为10KDa～300KDa。
在一些可选的实施例中，所述将混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间，包括：
将混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间，直至混合溶液中的气泡消除；
其中，所述注射装置包括规格为1ml～200ml的注射器，所述第一预设时间为1min～100h。
在一些可选的实施例中，所述将用水置换后的丝素蛋白固体风干，得到蚕丝蛋白块材，包括：
将用水置换后的丝素蛋白固体置于生物安全柜中进行风干，切削成型得到蚕丝蛋白块材；
其中，所述生物安全柜的风阀角度为0度～90度，风干环境温度为10℃～80℃，风干时间为1d～200d。
在一些可选的实施例中，所述蚕丝蛋白块材的体积为0.1cm3～1000cm3，所述蚕丝蛋白块材的形状为正方体、长方体、圆柱、三棱柱中的至少一种。
另一方面，本发明提供一种蚕丝蛋白块材，所述蚕丝蛋白块材通过上述制备方法制备得到。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明实施例加入适量的核黄素，由于核黄素属于天然物质，能够降低制备得到的蚕丝蛋白块材的植入风险；同时，核黄素的加入能够促进丝素蛋白交联，其目的是为了形成分子双网络（蚕丝蛋白本身的β-折叠结构和氧自由基交联网络），可以产生如下的效果：增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量；能够抑制长时间后β-折叠结构的进一步自发形成，从而避免材料变硬脆；可调控蚕丝蛋白块材的力学性能，使其变得更加柔韧，并且能长时间保持蚕丝蛋白块材的柔韧性；β-折叠结构的含量越高，丝素蛋白水溶性越低，从而加速溶液凝胶化，进而使得从溶液转变成凝胶的过程更加快速且可控。
2、本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，使得核黄素加量适中，避免因加入过多的核黄素而导致制备得到的蚕丝蛋白块材变脆，使制备得到的蚕丝蛋白块材具有较好的机械性能，从而使制备得到的蚕丝蛋白块材便于加工。
3、本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，该种混合方式使得混合得到的混合溶液的凝固时间小于21h，而单纯的丝素蛋白水溶液的凝胶成型时间要一个月以上，因此，本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀可以降低制备得到的混合溶液的凝固时间，从而提高蚕丝蛋白块材的生产效率和生产成本。
4、本发明实施例制备得到的丝素蛋白固体中的核黄素在照射第二预设时间后，可以激发生成三线态，转移生成单线态氧为主的活性氧自由基。活性氧自由基可与各种分子发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的氨基、苯酚基以及其他基团产生化学交联，从而进一步增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，进一步降低丝素蛋白水溶性，从而进一步加速溶液凝胶化。
5、本发明实施例采用氟醇溶液溶解丝素蛋白，相比于其他常见溶剂，丝素蛋白氟醇溶液对丝素蛋白的溶解性较高，在溶解丝素蛋白时，通常不会破坏丝素蛋白的结构。
6、本发明实施例制备得到的蚕丝蛋白块材在植入人体后降解速度适中，不会出现降解太快导致材质失效的情况，也不会出现降解太慢增加感染和并发症的风险的情况。例如，在对通过该蚕丝蛋白块材切削成的骨钉的临床实验中发现，植入丝素蛋白骨钉的12个月内，核磁共振成像（MRI）结果显示骨钉形态清晰可见，未见断裂、位移情况，并且无炎症产生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1是本发明实施例提供的一种蚕丝蛋白块材的制备方法的流程示意图。
图2是本发明实施例提供的一种制备丝素蛋白氟醇溶液的流程示意图。
图3是本发明实施例提供的一种制备丝素蛋白冻干粉的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
图1是本发明实施例提供的一种蚕丝蛋白块材的制备方法的流程示意图，如图1所示，所述制备方法包括：
步骤S1.制备核黄素水溶液和丝素蛋白氟醇溶液；所述核黄素水溶液的质量浓度为0.5%mg/ml～1.6%mg/ml、2%mg/ml、5%mg/ml、10%mg/ml中的至少一种。
步骤S2.将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，将混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间。
步骤S3.将静置第一预设时间后的混合溶液注入预设模具凝胶成型，得到丝素蛋白固体。
步骤S4.将所述丝素蛋白固体照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇。
步骤S5.使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换。
步骤S6.将用水替换后的丝素蛋白固体风干，得到蚕丝蛋白块材。
在一些可选的实施例中，图2是本发明实施例提供的一种制备丝素蛋白氟醇溶液的流程示意图，如图2所示，在上述步骤S1中，上述制备丝素蛋白氟醇溶液，可以包括：
步骤S11.制备丝素蛋白冻干粉。
步骤S12.将第一预设质量的氟醇溶液加入第二预设质量的所述丝素蛋白冻干粉中，以通过所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，得到所述丝素蛋白氟醇溶液；
其中，所述氟醇溶液为六氟异丙醇，所述第二预设质量与所述第一预设质量的比值为1：(1～10)，所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉的温度范围为5℃～80℃，所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉的溶解时间范围为0.1h～100h。
由于六氟异丙醇在溶解丝素蛋白时，通常不会破坏丝素蛋白的结构，因此该实施例通过第一预设质量的六氟异丙醇溶解第二预设质量的所述丝素蛋白冻干粉，使得制备得到的丝素蛋白氟醇溶液中的丝素蛋白的结构不会被破坏，进而确保制备得到的蚕丝蛋白块材中的蛋白结构不会被破坏。
需要说明的是，溶解时需要密封容器防止六氟异丙醇挥发，密封容器可以使用带盖子的密封玻璃瓶、密封注射器、或者聚合物薄膜密封的烧杯等。
在一些可行的实施例中，在上述步骤S11-上述步骤S12之间，上述方法还包括对丝素蛋白冻干粉进行固相增强颗粒掺杂的步骤。其中，固相增强颗粒包括陶瓷粉末、金属粉末、聚合物中的至少一种。相应地，溶解丝素蛋白冻干粉时，丝素蛋白冻干粉和固相增强颗粒的总质量与第一预设质量的比值为1：(1～10)。
在一些可行的实施例中，在上述步骤S11-上述步骤S12之间，上述方法还包括制备丝素蛋白冻干粉对应的复合材料的步骤。具体可以为：将丝素蛋白冻干粉添加至含硫酸钙的磷酸钙复合粉体中，混合均匀，制得固相体系。将含钠离子的固化液加入到固相体系中，调和成均匀的糊状物，经固化处理后得到复合材料。其中，磷酸钙复合粉体中所包含的硫酸钙的重量，与丝素蛋白冻干粉的重量比的范围为2～4，含钠离子的固化液可以包括但不限于：Na2HPO4、Na2HPO4和NaOH溶液。含硫酸钙的磷酸钙复合粉体可以为含硫酸钙的磷酸钙骨水泥基复合粉体。相应地，溶解丝素蛋白冻干粉时，丝素蛋白冻干粉和含硫酸钙的磷酸钙复合粉体的总质量（即复合材料）与第一预设质量的比值为1：(1～10)。由于制备得到的复合材料为与人体骨成分相似的羟基磷灰石。该复合材料可在体外环境中自固化后再植入体内，作为骨修复植入材料，该复合材料不仅其韧性和生物相容性较好，而且改善了磷酸钙骨水泥的孔结构，使其更接近人工骨。
在一些可行的实施例中，在上述步骤S11中，可以将蚕茧脱胶、洗涤、干燥、溶解、透析、离心、冻干后制得丝素蛋白冻干粉。图3是本发明实施例提供的一种制备丝素蛋白冻干粉的流程示意图，如图3所示，上述制备丝素蛋白冻干粉，可以包括：
步骤S111.称取第三预设质量的蚕茧于碳酸钠溶液中加热，以使所述蚕茧除去丝胶蛋白进行脱胶形成蚕丝。
示例性地，所述蚕茧为去除蚕蛹的碎蚕茧；所述蚕茧的形状为长方形或者正方形，所述蚕茧的面积为1mm2～1000mm2。其中，碎蚕茧的形状也可以为其他能大限度与溶液接触的形状，在此不做限制。
示例性地，所述碳酸钠溶液的浓度为0g/L～100g/L；加热温度为50℃～121℃，加热压强为0.1MPa～2MPa，加热时间为1s～1000h。
示例性地，在上述步骤S111中，可以通过控制加热时间调整丝素蛋白的平均分子量，丝素蛋白的平均分子量范围为10KDa～300KDa。
步骤S112.对完成脱胶的蚕丝进行洗涤处理。
示例性地，上述对完成脱胶的蚕丝进行洗涤处理，可以包括：
将完成脱胶的蚕丝置于超纯水中进行搅拌洗涤或静置浸泡处理；
其中，所述搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，所述磁力搅拌的速度为1r/min～2000r/min；单次洗涤过程中，蚕丝和超纯水的质量比为1:10～1:1000，洗涤时间为1s～200h，每次洗涤后取出蚕丝并挤干，洗涤重复次数为1次～50次。
步骤S113.将洗涤后的蚕丝进行干燥。
示例性地，上述将洗涤后的蚕丝进行干燥，可以包括：
将所述洗涤后的蚕丝进行自然风干或加热通风干燥；
其中，所述加热通风干燥的加热温度为40℃～100℃，干燥时间为0.1h～100h。
步骤S114.将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温第三预设时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液。
示例性地，所述锂盐水溶液为硫氰酸锂溶液、溴化锂溶液中的至少一种，所述锂盐水溶液的浓度为0.01g/ml～2g/ml，干燥后的蚕丝的质量和所述锂盐水溶液的体积比为(1～100)：100g/ml；干燥后的蚕丝与所述锂盐水溶液搅拌混合均匀后的保温温度为20℃～100℃，保温时间为0.1h～100h。
步骤S115.将所述丝素蛋白锂盐水溶液进行透析处理。
示例性地，在上述步骤S115中，上述将所述丝素蛋白锂盐水溶液进行透析处理，可以包括：
将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，并置于超纯水中进行静置透析或磁力搅拌透析；
其中，所述透析袋的规格为10Da～10000000Da(道尔顿)，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为1r/min～2000r/min，透析过程中更换超纯水的时间间隔为0.1h～100h，每次更换所需超纯水的体积为1mL～1000L。
步骤S116.将透析处理后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心装置进行离心处理，离心完成后收集上层清液得到丝素蛋白水溶液。
示例性地，所述离心装置进行离心处理的转速为1r/min～40000r/min，离心时间为1s～10h，离心温度为-3℃～10℃。
步骤S117.将所述丝素蛋白水溶液冷冻后干燥得到丝素蛋白冻干粉。
可选地，在上述步骤S117可以包括：将所述丝素蛋白水溶液置于-80℃～0℃的环境中冷冻，将冷冻后的所述丝素蛋白水溶液放入冷冻干燥装置中进行真空冷冻，真空冷冻的冷冻时间为1h～500h，真空冷冻的冷冻温度为-80℃～0℃，真空冷冻的压强为0.1Pa～100Pa。
示例性地，-80℃～0℃的环境中冷冻可以使用-80℃～0℃冰箱冷冻，或者使用液氮冷冻。冷冻干燥装置可以为冷冻干燥机。
在一些可选的实施例中，在上述步骤S1中，上述制备核黄素水溶液，包括：
称取预设质量的核黄素。
基于所述核黄素水溶液的质量浓度确定溶解所述核黄素的超纯水的第一预设体积。
向所述核黄素中加入第一预设体积的超纯水，并搅拌均匀，得到所述核黄素水溶液。
示例性地，可以用天平称取预设质量的核黄素，并根据核黄素水溶液的质量浓度，确定溶解所述核黄素的超纯水的第一预设体积，接着向预设质量的核黄素中加入第一预设体积的超纯水，并搅拌至溶液混合均匀，得到质量浓度为0.5%mg/ml～1.6%mg/ml、2%mg/ml、5%mg/ml、10%mg/ml中的至少一种的核黄素水溶液。
由于核黄素属于天然物质，因此核黄素的加入能够降低制备得到的蚕丝蛋白块材的植入风险；同时，核黄素的加入能够促进丝素蛋白交联，增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，而β-折叠结构的含量越高，丝素蛋白水溶性越低，从而加速溶液凝胶化；此外，将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，使得核黄素加量适中，避免因加入过多的核黄素而导致制备得到的蚕丝蛋白块材变脆，使制备得到的蚕丝蛋白块材具有较好的机械性能，从而使制备得到的蚕丝蛋白块材便于加工。
在一些可选的实施例中，在上述步骤S2中，上述将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，可以包括：
将第二预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构，在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；
其中，所述第二预设体积和所述第三预设体积的比值为5：1.5～5：4。
由于丝素蛋白的氟醇溶液是一种粘稠的液体，因此往其中加入核黄素水溶液更易操作，从而降低了蚕丝蛋白块材制备过程中的操作复杂度。且由于核黄素水溶液在与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会释放热量，蛋白分子吸热会改变空间结构，为了降低核黄素水溶液的加入过程对蛋白分子的空间结构的影响，使得蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件，可以将核黄素水溶液分多次缓慢加入丝素蛋白氟醇溶液中。此外，在实际生产中，快速加入大量的核黄素，不利于溶液混合均匀，为了使得核黄素水溶液和丝素蛋白氟醇溶液能够充分混合，可以将核黄素水溶液分多次缓慢加入丝素蛋白氟醇溶液中。
可选地，上述预设条件可以根据实际生产需求进行确定，在此不做具体限定。在一种实施方式中，针对改变数量或体积这一维度，该预设条件可以为：在丝素蛋白氟醇溶液中的所有蛋白分子中，空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中发生改变的蛋白分子的数量或体积，为丝素蛋白氟醇溶液中的所有蛋白分子的数量或体积的0%～5%。在另一种实施方式中，该预设条件可以为：在丝素蛋白氟醇溶液中的所有蛋白分子中，空间结构为β-折叠结构的蛋白分子转换为其他空间结构（例如，α-螺旋结构）的比例为0%～5%。
在一个具体的实施例中，上述将第二预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，可以包括：
基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合中所释放的热量对蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔。
根据所述第二预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数。
基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第二预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构，在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
该实施例中，由于核黄素水溶液在与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会释放热量，蛋白分子吸热会改变空间结构，可以预先确定核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合中所释放的热量对蛋白分子的空间结构的改变信息，即建立释放的热量与蛋白分子的空间结构的改变之间的映射关系。
可选地，上述映射关系可以通过实验进行确定得到。例如，可以预先配置样本核黄素水溶液和样本丝素蛋白氟醇溶液，并进行相应的实验。实验1：确定每次添加至所述样本丝素蛋白氟醇溶液中的样本核黄素水溶液的体积为A和相邻两次样本核黄素水溶液的添加时间间隔B，混合过程中释放的热量为热量1。实验2：确定每次添加至所述样本丝素蛋白氟醇溶液中的样本核黄素水溶液的体积为C和相邻两次样本核黄素水溶液的添加时间间隔D，混合过程中释放的热量为热量2。……，实验n：确定每次添加至所述样本丝素蛋白氟醇溶液中的样本核黄素水溶液的体积为X和相邻两次样本核黄素水溶液的添加时间间隔Y，混合过程中释放的热量为热量n。对实验1至实验n中混合得到的混合溶液中的蛋白分子的空间结构进行检测，发现实验2中的蛋白分子的空间结构改变满足上述预设条件，则可以将实验2中的体积为C作为每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，以及将添加时间间隔D作为相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔。
由于核黄素水溶液的第二预设体积是已知的，在确定了每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积之后，根据第二预设体积与“每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积”的比值，即可确定核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数。
在确定了预设添加次数和添加时间间隔之后，即可基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第二预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构，在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
由于预先通过实验确定核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合中所释放的热量对蛋白分子的空间结构的改变信息，该改变信息能够指示释放的热量与蛋白分子的空间结构的改变之间的映射关系，因此通过该改变信息，确定最佳的添加体积和最佳的添加时间间隔，能够使得蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件，从而降低核黄素水溶液的加入过程对蛋白分子的空间结构的影响。在最佳的添加体积之后，可以根据已知的第一预设体积确定出最佳的预设添加次数，从而进一步降低核黄素水溶液的加入过程对蛋白分子的空间结构的影响，使得蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
在一些可行的实施例中，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积随着所述预设添加次数的增加而减小；相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而增大。
在一个可选的实施例中，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积不同，且下一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，小于本次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积。
该实施例中，由于核黄素在与丝素蛋白氟醇溶液的混合过程中会释放热量，如果每次添加的核黄素水溶液的体积同样多，或者随着预设添加次数的增加，每次添加的核黄素水溶液的体积也增加，可能使得后一次添加的核黄素水溶液与本次添加的核黄素水溶液叠加效果较为明显，从而导致释放出较多的热量，进而进一步增加对蛋白分子的空间结构的影响。基于此，为了进一步降低对蛋白分子的空间结构的影响，可以使得每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积不同，且下一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，小于本次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，即添加体积随着所述预设添加次数的增加而减小，这样能够有效避免前后添加的核黄素水溶液叠加效果，从而避免释放出较多的热量，进而进一步降低核黄素水溶液对蛋白分子的空间结构的影响。
在一个可选的实施例中，相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔不同，且第一时间间隔大于第二时间间隔；
其中，所述第一时间间隔为：第目标次核黄素水溶液的目标添加时间，与第目标次对应的下一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔；所述第二时间间隔为：第目标次核黄素水溶液的目标添加时间，与第目标次对应的上一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔。
如果相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔相等，或者相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而减小，同样可能使得后一次添加的核黄素水溶液与本次添加的核黄素水溶液叠加效果较为明显，从而导致释放出较多的热量，进而进一步增加对蛋白分子的空间结构的影响。基于此，为了进一步降低对蛋白分子的空间结构的影响，可以使得相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔不同，即下一次添加的时间间隔大于本次添加的时间间隔，也即相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而增大，从而进一步避免前后添加的核黄素水溶液叠加效果，进而进一步避免释放出较多的热量，降低核黄素水溶液对蛋白分子的空间结构的影响。
示例性地，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为1ml～40ml，相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔为30s～1h。
在一个可选的实施例中，上述基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第二预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，可以包括：
将所述丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液。
对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液。
将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液。
30s～1h后重复对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液，将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液的操作，直至添加次数为2次～40次。
假设预设添加次数为3次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为20ml、10ml、5ml，添加时间间隔为30min、1h。则可以首先将丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液，对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入20ml的核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液。将当前得到的核黄素混合溶液重新作为当前溶液。30min后对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入10ml的核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液。将当前得到的核黄素混合溶液重新作为当前溶液。1h后对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入5ml的核黄素水溶液，混合均匀。
在一个可选的实施例中，在上述步骤S2中，上述将混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间，包括：
将所述混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间，直至混合溶液中的气泡消除；其中，所述注射装置包括规格为1ml～200ml的注射器，所述预设时间为1min～100h。
需要说明的是，所述注射装置还可以是其他具有液体注射功能的设备，在此不做限制。
作为示例，丝素蛋白氟醇和核黄素水溶液的混合溶液置于注射装置中静置时间为1min～100h，直至消除溶液中的气泡。
在一个可选的实施例中，在上述步骤S3中，所述混合得到的混合溶液注入预设模具凝胶成型得到丝素蛋白固体的凝胶成型的成型时间为15h～100h，所述混合得到的混合溶液注入预设模具凝胶成型的成型温度为30℃～100℃。作为示例，预设模具可以为多孔模具，多孔模具具有保护壳，防止溶液流出，所述保护壳为塑料硬保护壳、聚合物薄膜保护壳等，但不限于此。预设模具表面具有开孔，开孔直径范围为0.1毫米～2毫米，开孔密度范围1个/平方厘米～50个/平方厘米。
在一个可选的实施例中，在上述步骤S4中，上述将所述丝素蛋白固体照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇，可以包括：
将所述丝素蛋白固体用紫外光源照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用所述无水甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇；其中，所述紫外光源的功率为20W～60W，所述紫外光源的波长包括第一波长、第二波长和第三波长，所述第一波长为315nm～380nm，所述第二波长为280nm～315nm，所述第三波长为200nm～280nm，所述紫外光源照射距离为0cm～20cm；所述第二预设时间为0.1h～1h，所述无水甲醇的体积范围为1500ml～2000ml，每隔1h～50h更换一次无水甲醇，无水甲醇的更换次数为1次～50次。
该紫外光源可以为紫外灯手电筒，紫外灯手电筒的功率为20W～60W，波长包括第一波长、第二波长和第三波长，第一波长为315nm～380nm，第二波长为280nm～315nm，第三波长为200nm～280nm，照射距离为0cm～20cm；紫外光源照射丝素蛋白固体的时间为0.1h～1h。紫外光源照射后，可以将丝素蛋白固体浸没于无水甲醇中，以使用甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇，同时使丝素蛋白结晶固化，获得丝素蛋白固体。无水甲醇体积范围为1500ml～2000ml，每隔1h～50h更换一次无水甲醇，换液次数为1次～50次。
在一个可选的实施例中，在上述步骤S5中，上述使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换，可以包括：
依次使用浓度梯度递减的甲醇水溶液浸泡丝素蛋白固体，直至丝素蛋白固体中的甲醇被置换出；
其中，所述甲醇水溶液中的甲醇浓度范围为100％～0且不为0，甲醇水溶液的更换时间间隔为1h～50h，甲醇水溶液的更换次数为1次～50次。
该实施例中，所述丝素蛋白固体用浓度梯度递减的甲醇水溶液依次浸没，甲醇水溶液现配现用，甲醇水溶液梯度浓度为100％～0但不包含0，甲醇水溶液每隔1h～50h换液一次，换液次数包括1次～50次，直至所述丝素蛋白固体中的甲醇完全被置换出。
在一个可选的实施例中，在上述步骤S6中，上述将用水替换后的丝素蛋白固体风干，得到蚕丝蛋白块材，可以包括：
将用水置换后的丝素蛋白固体置于生物安全柜中进行风干，切削成型得到蚕丝蛋白块材；
其中，所述生物安全柜的风阀角度为0度～90度，风干环境温度为10℃～80℃，风干时间为1d～200d。
该实施例中，风干工艺是在通风环境下使丝素蛋白固体中的水分挥发并风干。
作为示例，所述切削修型工艺包括车、铣等方法，但不限于此；所述蚕丝蛋白块材的形状包括长方体、正方体、圆柱体、三角形，但不限于此；蚕丝蛋白块材的尺寸范围为0.1cm3～1000cm3。当然蚕丝蛋白块材的形状可以为其他合适加工的形状，在此不做限制。
在一些可行的实施例中，在得到蚕丝蛋白块材之后，上述方法还可以包括：
对所述蚕丝蛋白块材进行水蒸汽退火处理、空冷处理和致密化处理，以进一步调节蚕丝蛋白材料在人体内的溶解和降解速率，得到处理后的蚕丝蛋白块材。
示例性地，该水蒸汽退火处理可以包括：将蚕丝蛋白块材置于50%～60%相对湿度和室温下进行水蒸气退火，退火温度10℃～100℃，时间范围为30s～1000h。具体地，可以将蚕丝蛋白块材置于退火炉中，使退火炉内温度逐渐升温至10℃～100℃，保温时间为30s～1000h。
在水蒸汽退火过程中，水分子穿透了蚕丝蛋白块材，提高了丝素蛋白链网络的流动性，使其变得足够柔软，可以加工成任意形状。此外，退火处理增加了β-折叠结构的含量，降低了丝素蛋白在水中的溶解度，因此形成了相对稳定的刚性结构，从而提高了蚕丝蛋白块材的机械强度。
示例性地，该空冷处理可以包括：将水蒸汽退火处理后的蚕丝蛋白块材从炉中取出，并在空气中冷却1min～2h，以固定蚕丝蛋白块材的形状。
示例性地，致密化处理可以包括：将经过水蒸气退火的蚕丝蛋白块材垂直压缩以致密化，从而进一步提高蚕丝蛋白块材的机械强度。
通过上述水蒸汽退火处理、空冷处理和致密化处理后的蚕丝蛋白块材，可以被加工成任意形状，并植入人体中。且通过上述水蒸汽退火处理、空冷处理和致密化处理后的蚕丝蛋白块材显示出较好的生物降解性，其可以在35℃～37℃下，20天～30天内完全生物降解。此外，致密化处理后的蚕丝蛋白块材还可以承受自身重量的约500～1000倍的砝码。
在一些可选的实施例中，上述步骤S3可以包括：将混合得到的混合溶液注入至预设模具中，搅拌均匀；将所述预设模具密封后将其边缘锁扣打开，静置至溶液凝固，形成丝素蛋白固体，用夹板矫正固体。
示例性地，所述预设模具为上方带盖的长方体，模具盖边缘有控制模具打开和密封的锁扣。所述丝素蛋白固体取出用无尘布包裹好置于生物安全柜中进行夹板矫正，矫正时间范围为20天～30天。
相应地，上述步骤S4可以包括：将所述丝素蛋白固体照射第二预设时间后用甲醇浸没，用夹板矫正固体。
示例性地，将浸没无水甲醇的丝素蛋白固体用封口膜密封防止甲醇挥发，封口膜的厚度为0.127mm，密封层数范围为3层～5层。将所述丝素蛋白固体取出用无尘布包裹好置于生物安全柜中进行夹板矫正，矫正时间范围为20天～30天。
相应地，可以将所述丝素蛋白固体切割，用夹板矫正固体，晾干得到丝素蛋白板材。示例性地，将所述丝素蛋白固体沿着横截面切割成体积相等的两块，用无尘布包裹好置于生物安全柜中进行夹板矫正，矫正时间范围为20天～30天。
该实施例制备得到的丝素蛋白板材先后进行三次夹板矫正，外观形状规整、内部质地均匀柔软、可塑性强、易再次加工。
以下，以制备得到的蚕丝蛋白块材的形状为圆柱为例，对制备得到的蚕丝蛋白块材的力学性能进行分析：
将厚度为28.0mm、直径为14mm左右的圆柱体试样置于力学万能试验机上，设置实验速度为5mm/min，当试样被压至鼓形停止实验。试验结果的应力应变曲线符合试验预期，包括弹性阶段、屈服阶段和强化阶段，其力学性能如表1所示。如表1所示，通过本发明实施例制备的蚕丝蛋白块材具有较好的力学性能。
表1 蚕丝蛋白块材的力学性能
以下，对将蚕丝蛋白块材移入人体内的效果进行说明：在对通过该蚕丝蛋白块材切削成的骨钉的临床实验中发现，在植入丝素蛋白骨钉的12个月内，核磁共振成像（MRI）结果显示骨钉形态清晰可见，未见断裂、位移情况，并且无炎症产生。
以下，对上述步骤S2中，将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，得到的混合溶液的凝固时间进行说明：
表2是不同溶液的凝固时间，参见表2，采用本发明实施例提供的将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀的方式，可以降低制备得到的混合溶液的凝固时间，从而提高蚕丝蛋白块材的生产效率和生产成本。
表2 不同溶液的凝固时间
以下，对本发明实施例制备的蚕丝蛋白块材的水溶性进行说明：吸水倍数的测试方法为单位质量(1克)的丝素蛋白材料饱和吸水后增加的质量与原质量之比。如表3所示，核黄素的加入能够增加β-折叠结构的含量，而β-折叠结构的含量越高，丝素蛋白水溶性越低，因此，纯丝素蛋白水溶液制备得到的蚕丝蛋白材料的吸水倍数最高。而本发明实施例采用的是丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液相混合的方式，丝素蛋白氟醇溶液的添加能够进一步降低丝素蛋白水溶性，从而加速溶液凝胶化。
表3 不同原料制备得到的蚕丝蛋白材料的吸水倍数
实施例二
本发明实施例提供一种蚕丝蛋白块材的制备方法，所述制备方法包括：
首先，蚕茧脱胶、洗涤、干燥、溶解、透析、离心、冻干后制得丝素蛋白冻干粉，具体步骤如下：
称取一定量的碎蚕茧于浓度为50g/L的碳酸钠溶液中用电炉加热或高压锅加热，加热温度为80℃，加热压强为1Mpa，加热时间为2h，除去丝胶蛋白进行脱胶，形成蚕丝。
将所述完成脱胶的蚕丝置于超纯水中，多次洗涤蚕丝。洗涤方式为搅拌洗涤，搅拌洗涤的搅拌方式为磁力搅拌，磁力搅拌速度为50r/min；单次洗涤过程中，蚕丝和水质量比为1:50，时间为2h，每次洗涤后取出蚕丝并挤干，洗涤重复次数为30次。
将所述洗涤后的蚕丝进行干燥，干燥的方式为加热通风干燥，加热通风干燥的加热温度为60℃，干燥时间为10h。
将所述完成干燥的蚕丝与溴化锂溶液搅拌混合均匀，保温一段时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液。溴化锂溶液的浓度为1/ml，干燥的蚕丝质量和溴化锂溶液体积比为0.5g/ml；保温温度为50℃，保温时间为1h。
将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，置于超纯水中透析。所述透析袋规格为20Da，透析方式为静置透析或磁力搅拌透析，其中，磁力搅拌透析的搅拌速度为30r/min，透析过程中换水的时间间隔为2h，每次所需超纯水的体积为20mL。
将所述透析后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心管中，置于离心装置中离心，离心完成后收集上层清液得到丝素蛋白水溶液。所述离心装置的离心分离的转速为20r/min，时间为3h，离心温度为5℃。
将所述丝素蛋白水溶液先冷冻后干燥得到丝素蛋白冻干粉。所述丝素蛋白水溶液置于-40℃的环境中冷冻，然后放入冷冻干燥机中真空冷冻，冷冻时间为3h，冷冻温度为-4℃，压强为50Pa。
接着，制备丝素蛋白氟醇溶液。
所述氟醇为六氟异丙醇(HFIP)，溶解温度为40℃，溶解时间为50h，所述丝素蛋白和HFIP的质量比为1：5；溶解时密封容器防止HFIP挥发。
接着，制备核黄素水溶液。核黄素水溶液的质量浓度为1.5mg/ml。
将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5混合均匀，置于注射装置中静置第一预设时间，注入预设模具凝胶成型制得丝素蛋白固体。所述注射装置为规格为100mL的医用注射器。
丝素蛋白氟醇和核黄素水溶液的混合溶液置于注射装置中静置5h，直至消除溶液中的气泡；所述混合得到的混合溶液凝胶成型时间为20h，凝胶成型温度为50℃。
将所述丝素蛋白固体用紫外光源照射一段时间后浸没于无水甲醇，置换氟醇。所述紫外光源的功率为40W，波长为第一波长350nm，第二波长300nm，第三波长250nm，照射距离为5cm；紫外光源照射丝素蛋白固体的时间为30min。
使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换。所述丝素蛋白固体用浓度梯度递减的甲醇水溶液依次浸没，甲醇水溶液现配现用，甲醇水溶液梯度浓度为100％～0但不包含0，甲醇水溶液每隔2h换液一次，换液次数为25次。
将所述丝素蛋白固体风干，切削成型得到蚕丝蛋白块材。风阀角度为50度，风干环境温度为40℃，风干时间为10d；所述切削工艺为车或铣。
实施例三
与实施例二不同的是，本发明实施例中的核黄素水溶液的质量浓度为2mg/ml。且将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：2混合均匀，置于注射装置中静置第一预设时间。
实施例四
与实施例二不同的是，本发明实施例中的核黄素水溶液的质量浓度为5mg/ml。且将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：3混合均匀，置于注射装置中静置第一预设时间。
实施例五
与实施例二不同的是，本发明实施例中的核黄素水溶液的质量浓度为10mg/ml。且将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：4混合均匀，置于注射装置中静置第一预设时间。
表5是不同实施例所制备得到的蚕丝蛋白块材的性能数据对比表，如表5所示，核黄素能够增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，β-折叠结构的含量越高，丝素蛋白水溶性越低，从而加速溶液凝胶化，因此实施例五制备得到的蚕丝蛋白块材的吸水倍数最低，凝固时间最短，而实施例二制备得到的蚕丝蛋白块材的吸水倍数最高，凝固时间最长。
由于过多的核黄素会导致制备得到的蚕丝蛋白块材变脆，为了使得制备得到的蚕丝蛋白块材具有较好的机械性能，本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按不同体积比进行混合，丝素蛋白氟醇溶液体积越高，制备得到的蚕丝蛋白块材的机械性能越高，因此实施例二制备得到的蚕丝蛋白块材的机械性能最高，实施例五制备得到的蚕丝蛋白块材的机械性能较低。
表5不同实施例所制备得到的蚕丝蛋白块材的性能数据对比表
实施例六
本发明实施例还提供一种蚕丝蛋白块材，该蚕丝蛋白块材由上述的制备方法制备得到。
综上，本发明制备的蚕丝蛋白块材降解速度适中、性质稳定、可加工性强、机械强度可调控，可以用于植入医疗器械等领域。具体地，实施本发明实施例，具有如下有益效果：
1、本发明实施例加入适量的核黄素，由于核黄素属于天然物质，能够降低制备得到的蚕丝蛋白块材的植入风险；同时，核黄素的加入能够促进丝素蛋白交联，其目的是为了形成分子双网络（蚕丝蛋白本身的β-折叠结构和氧自由基交联网络），可以产生如下的效果：增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量；能够抑制长时间后β-折叠结构的进一步自发形成，从而避免材料变硬脆；可调控蚕丝蛋白块材的力学性能，使其变得更加柔韧，并且能长时间保持蚕丝蛋白块材的柔韧性；β-折叠结构的含量越高，丝素蛋白水溶性越低，从而加速溶液凝胶化，进而使得从溶液转变成凝胶的过程更加快速且可控。
2、本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，使得核黄素加量适中，避免因加入过多的核黄素而导致制备得到的蚕丝蛋白块材变脆，使制备得到的蚕丝蛋白块材具有较好的机械性能，从而使制备得到的蚕丝蛋白块材便于加工。
3、本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，该种混合方式使得混合得到的混合溶液的凝固时间小于21h，而单纯的丝素蛋白水溶液的凝胶成型时间要一个月以上，因此，本发明实施例将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀可以降低制备得到的混合溶液的凝固时间，从而提高蚕丝蛋白块材的生产效率和生产成本。
4、本发明实施例成型得到的丝素蛋白固体中的核黄素在照射第二预设时间后，可以激发生成三线态，转移生成单线态氧为主的活性氧自由基。活性氧自由基可与各种分子发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的氨基、苯酚基以及其他基团产生化学交联，从而进一步增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，进而进一步降低丝素蛋白水溶性，从而加速溶液凝胶化。
5、本发明实施例采用氟醇溶液溶解丝素蛋白，相比于其他常见溶剂，丝素蛋白氟醇溶液对丝素蛋白的溶解性较高，在溶解丝素蛋白时，通常不会破坏丝素蛋白的结构。
6、本发明实施例制备得到的蚕丝蛋白块材在植入人体后降解速度适中，不会出现降解太快导致材质失效的情况，也不会出现降解太慢增加感染和并发症的风险的情况。例如，在对通过该蚕丝蛋白块材切削成的骨钉的临床实验中发现，植入丝素蛋白骨钉的12个月内，核磁共振成像（MRI）结果显示骨钉形态清晰可见，未见断裂、位移情况，并且无炎症产生。
7、相比于现存的直接将丝素蛋白水溶液凝胶成型的方法，本发明实施例先将丝素蛋白水溶液制成冻干粉，降低水分子和丝素蛋白分子形成氢键的可能，即表现为分子间β-折叠结构减少，而分子内的β-折叠结构增加，增强蚕丝蛋白材料本身的机械强度。
8、本发明实施例采用合适、高效的方法（例如，洗涤蚕丝除去可见的蚕茧自带的杂质和钠离子；透析除去溴化锂；离心除去蚕丝原来的杂质；用甲醇浸泡除去六氟异丙醇；甲醇水溶液浸泡除去甲醇）去除蚕丝中多余的杂质和离子，增加蚕丝蛋白块材的安全性。本发明实施例还可以根据不同的要求调整参数，改变蚕丝蛋白的空间结构，进一步调控蚕丝蛋白块材的强度，满足实际应用的需求（例如，通过加热蚕丝改变丝素蛋白的平均分子质量，进而调整相应的性能，丝素蛋白的平均分子质量越大，材料的韧性就越强）。
以上所揭露的仅为本发明的几个较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (24)
1.一种蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
制备核黄素水溶液和丝素蛋白氟醇溶液；所述核黄素水溶液的质量浓度为0.5%mg/ml～1.6%mg/ml、2%mg/ml、5%mg/ml、10%mg/ml中的至少一种；
将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，将混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间；所述将所述丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，包括：将第二预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构，在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；其中，所述第二预设体积和所述第三预设体积的比值为5：1.5～5：4；所述预设条件为：在丝素蛋白氟醇溶液中的所有蛋白分子中，空间结构为折叠结构的蛋白分子转换为/>螺旋结构的比例为0%～5%；
将静置第一预设时间后的混合溶液注入预设模具凝胶成型，得到丝素蛋白固体；
将所述丝素蛋白固体照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇；
使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换；
将用水置换后的丝素蛋白固体风干，得到蚕丝蛋白块材；
对所述蚕丝蛋白块材进行水蒸汽退火处理，退火温度为10℃～100℃，时间范围为30s～1000h；将水蒸汽退火处理后的蚕丝蛋白块材在空气中冷却1min～2h，以固定蚕丝蛋白块材的形状。
2.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述制备核黄素水溶液包括：
称取预设质量的核黄素；
基于所述核黄素水溶液的质量浓度确定溶解所述核黄素的超纯水的第一预设体积；
向所述核黄素中加入第一预设体积的超纯水，并搅拌均匀，得到所述核黄素水溶液。
3.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述将第二预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，包括：
基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合中所释放的热量对蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔；
根据所述第二预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数；
基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第二预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构，在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。
4.根据权利要求3所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积不同，且下一次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，小于本次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积。
5.根据权利要求3所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔不同，且第一时间间隔大于第二时间间隔；
其中，所述第一时间间隔为：第目标次核黄素水溶液的目标添加时间，与第目标次对应的下一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔；所述第二时间间隔为：第目标次核黄素水溶液的目标添加时间，与第目标次对应的上一次核黄素水溶液的添加时间之间的时间间隔。
6.根据权利要求3所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为1ml～40ml，相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔为30s～1h。
7.根据权利要求6所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第二预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第三预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，包括：
将所述丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液；
对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液；
将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液；
30s～1h后重复对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液，将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液的操作，直至添加次数为2次～40次。
8.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述混合得到的混合溶液注入预设模具凝胶成型的成型时间为15h～100h，所述混合得到的混合溶液注入预设模具凝胶成型的成型温度为30℃～100℃。
9.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述将所述丝素蛋白固体照射第二预设时间后浸没于甲醇中，以使用甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇，包括：
将所述丝素蛋白固体用紫外光源照射第二预设时间后浸没于无水甲醇中，以使用所述无水甲醇置换所述丝素蛋白氟醇溶液中的氟醇；
其中，所述紫外光源的功率为20W～60W，所述紫外光源的波长包括第一波长、第二波长和第三波长，所述第一波长为315nm～380nm，所述第二波长为280nm～315nm，所述第三波长为200nm～280nm，所述紫外光源的照射距离为0cm～20cm；所述第二预设时间为0.1h～1h，所述无水甲醇的体积范围为1500ml～2000ml，每隔1h～50h更换一次无水甲醇，无水甲醇的更换次数为1次～50次。
10.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述使用梯度置换法将丝素蛋白固体中的甲醇用水置换，包括：
依次使用浓度梯度递减的甲醇水溶液浸泡丝素蛋白固体，直至丝素蛋白固体中的甲醇被置换出；
其中，所述甲醇水溶液中的甲醇浓度范围为100％～0且不为0，甲醇水溶液的更换时间间隔为1h～50h，甲醇水溶液的更换次数为1次～50次。
11.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，制备丝素蛋白氟醇溶液，包括：
制备丝素蛋白冻干粉；
将第一预设质量的氟醇溶液加入第二预设质量的所述丝素蛋白冻干粉中，以通过所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，得到所述丝素蛋白氟醇溶液；
其中，所述氟醇溶液为六氟异丙醇，所述第二预设质量与所述第一预设质量的比值为1：(1～10)，所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉的温度范围为5℃～80℃，所述氟醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉的溶解时间范围为0.1h～100h。
12.根据权利要求11所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述制备丝素蛋白冻干粉，包括：
称取第三预设质量的蚕茧于碳酸钠溶液中加热，以使所述蚕茧除去丝胶蛋白进行脱胶形成蚕丝；
对完成脱胶的蚕丝进行洗涤处理；
将洗涤后的蚕丝进行干燥；
将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温第三预设时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液；
将所述丝素蛋白锂盐水溶液进行透析处理；
将透析处理后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心装置进行离心处理，离心完成后收集上层清液得到丝素蛋白水溶液；
将所述丝素蛋白水溶液冷冻后干燥得到丝素蛋白冻干粉。
13.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述蚕茧为去除蚕蛹的蚕茧；所述蚕茧的形状为长方形或者正方形，所述蚕茧的面积为1mm2～1000mm2。
14.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述对完成脱胶的蚕丝进行洗涤处理，包括：
将完成脱胶的蚕丝置于超纯水中进行搅拌洗涤或静置浸泡处理；
其中，所述搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，所述磁力搅拌的速度为1r/min～2000r/min；单次洗涤过程中，蚕丝和超纯水的质量比为1:10～1:1000，洗涤时间为1s～200h，每次洗涤后取出蚕丝并挤干，洗涤重复次数为1次～50次。
15.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述将洗涤后的蚕丝进行干燥，包括：
将所述洗涤后的蚕丝进行自然风干或加热通风干燥；
其中，所述加热通风干燥的加热温度为40℃～100℃，干燥时间为0.1h～100h。
16.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述锂盐水溶液为硫氰酸锂溶液、溴化锂溶液中的至少一种，所述锂盐水溶液的浓度为0.01g/ml～2g/ml，干燥后的蚕丝的质量和所述锂盐水溶液的体积比为(1～100)：100g/ml；干燥后的蚕丝与所述锂盐水溶液搅拌混合均匀后的保温温度为20℃～100℃，保温时间为0.1h～100h。
17.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述将所述丝素蛋白锂盐水溶液进行透析处理，包括：
将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，并置于超纯水中进行静置透析或磁力搅拌透析；
其中，所述透析袋的规格为10Da～10000000Da，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为1r/min～2000r/min，透析过程中更换超纯水的时间间隔为0.1h～100h，每次更换所需超纯水的体积为1mL～1000L。
18.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述离心装置进行离心处理的转速为1r/min～40000r/min，离心时间为1s～10h，离心温度为-3℃～10℃。
19.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述将所述丝素蛋白水溶液冷冻后干燥得到丝素蛋白冻干粉，包括：
将所述丝素蛋白水溶液置于-80℃～0℃的环境中冷冻，将冷冻后的所述丝素蛋白水溶液放入冷冻干燥装置中进行真空冷冻，真空冷冻的冷冻时间为1h～500h，真空冷冻的冷冻温度为-80℃～0℃，真空冷冻的压强为0.1Pa～100Pa。
20.根据权利要求12所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，在所述称取第三预设质量的蚕茧于碳酸钠溶液中加热，以使所述蚕茧除去丝胶蛋白进行脱胶形成蚕丝的过程中，通过控制加热时间调整丝素蛋白的平均分子量，丝素蛋白的平均分子量范围为10KDa～300KDa。
21.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述将混合得到的混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间，包括：
将混合溶液置于注射装置中静置第一预设时间，直至混合溶液中的气泡消除；
其中，所述注射装置包括规格为1ml～200ml的注射器，所述第一预设时间为1min～100h。
22.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述将用水置换后的丝素蛋白固体风干，得到蚕丝蛋白块材，包括：
将用水置换后的丝素蛋白固体置于生物安全柜中进行风干，切削成型得到蚕丝蛋白块材；
其中，所述生物安全柜的风阀角度为0度～90度，风干环境温度为10℃～80℃，风干时间为1d～200d。
23.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白块材的制备方法，其特征在于，所述蚕丝蛋白块材的体积为0.1cm3～1000cm3，所述蚕丝蛋白块材的形状为正方体、长方体、圆柱、三棱柱中的至少一种。
24.一种蚕丝蛋白块材，其特征在于，所述蚕丝蛋白块材由权利要求1至23任一项所述的制备方法制备得到。
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