CN116554270A - 一种Fmoc法固相合成亮脑啡肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Fmoc法固相合成亮脑啡肽的方法，该方法以Fmoc保护的氨基酸为单体，将氨基酸按顺序连接到树脂上，在合成亮脑啡肽时，采用的氨基酸均不带有任何侧链保护基团，采用含1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的四氢呋喃溶液脱除所有Fmoc保护基，最后以三氟乙酸水溶液除去树脂得亮脑啡肽。本发明首次以咪唑与三环己基膦为Fmoc脱保护剂的组分，取代了传统的吡啶。该脱保护剂不受“易制毒化学品”管制，廉价易得，性质稳定，低毒低挥发低腐蚀；清除Fmoc能力优异，不会造成酪氨酸侧链的酚环酰化副反应，无须任何侧链保护，简化了多肽的生产流程，降低了多肽的制备成本，对含有碱性敏感的侧链保护基多肽的合成策略设计提供了极大的改良空间。
Description
所属技术领域：
本发明涉及多肽类药物的制备，具体其涉及一种固相合成人类前脑啡肽的方法，属于多肽固相合成技术领域。
背景技术：
亮脑啡肽(Leu-enkephalin)是一种内源性啡肽，由五个氨基酸组成，序列为H-酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯胺酸-亮氨酸-NH2(H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2)。它属于内啡肽家族，主要存在于人体或多种动物中枢神经系统中，特别是在前脑区域。亮脑啡肽具有镇痛和镇静的作用，通过与μ-和δ-阿片受体结合来产生药理效应。它是一种天然的镇痛剂，参与调节疼痛传递和情绪反应。人类前脑啡肽的合成和释放受到多种因素的调控，包括神经递质、压力和疼痛刺激等。它在神经系统中的存在对于疼痛调节和情绪稳定起着重要作用。研究表明，亮脑啡肽与镇痛药物和药物滥用有关，其调节功能对于理解疼痛机制和药物滥用行为具有重要意义。
9-芴基甲氧基羰基保护基(Fmoc)多肽固相合成方法在多肽合成的快速、高效、可控方面具有优势。它被广泛应用于药物研发、生物医学研究和生物工程等领域。通过合理的设计和优化反应条件，可以实现高产率、高纯度的多肽合成，并为合成复杂肽类化合物和药物提供了可行的路线。Fmoc多肽固相合成方法具有操作简便、反应条件温和、合成效率高等优点，成为目前化学合成多肽最为常用的方法。Fmoc脱保护不仅要求脱保护剂具有适当的碱性，使得临近Fmoc芴环系的9-H被除去，也需要足够的亲核性将随之生成的二苯并富烯副产物进行清除，同时要维持温和的脱保护环境以保证多肽的侧链保护基安全。常规Fmoc脱保护使用20-50％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液。需要注意的是，哌啶在全球多国(包括中国)都属于易制毒类化合物，受到了政府部分的严厉管控，企业高校购买和使用都受到严格限制。
亮脑啡肽已被成功通过Fmoc固相方法合成。几乎所有报道的方法均选用Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBu))作为原料，这是因为哌啶具有较强的碱性，容易导致亮脑啡肽包含的酪氨酸的未保护侧链酚形成酚盐离子，进而发生酰化副反应。实验证明，在存在一定浓度哌啶的碱性条件下，酪氨酸的侧链酚基的烷基型保护基远不如其他氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)的保护基稳定(Albert Isidro-Llobet et al.Chemical Reviews,2009,Vol.109,No.6)。酪氨酸作为亮脑啡肽固相合成的第一个氨基酸，在整个合成过程中需要经历最多次的脱保护步骤。如果使用低浓度的哌啶，虽然能降低碱性，减少副反应，但亲核性也将相应大幅降低，影响Fmoc的脱保护效率和副产物二苯并富烯的清除，甚至导致脱保护失败。目前尚未有无需保护Fmoc酪氨酸侧链的前提下实现亮脑啡肽固相合成的成功例子。
磷原子孤对电子的离域远比氮来得大，不易受到邻近中小基团的位阻影响。大多数膦类化合物的相对碱性比其对应结构的含氮有机碱更低，却往往具有更优秀的亲核性。三烷基膦类化合物常作为配合亲核试剂的催化剂使用，可以大幅提升不少含氮有机弱碱的亲核能力。譬如，三烷基膦具有亲核性，进攻双键后会导致电子云的偏移，从而催化发生胺参与的加成反应；三烷基膦可以催化不饱和烃与芳香胺的偶联反应；三烷基膦也是最常用的1,4-加成氮杂环反应的催化剂。迄今为止尚未有膦类化合物和有机碱配合作为Fmoc脱保护剂的多肽合成方法的报道，不过三烷基膦这样促使“弱碱强亲核”的催化特性恰恰是亮脑啡肽的化学合成中脱保护时最需要的。我们认为，在亮脑啡肽的固相合成中，三烷基膦作为催化剂的情况下，优选的弱有机碱作为Fmoc脱保护剂可能较哌啶等传统强碱表现相当甚至更佳，从而在无需保护Fmoc酪氨酸侧链的前提下实现亮脑啡肽的固相合成。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种Fmoc法固相合成亮脑啡肽的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种Fmoc法固相合成亮脑啡肽的方法，该方法中Fmoc脱保护剂采用咪唑与三环己基膦混合溶液。
进一步的，上述咪唑与三环己基膦混合溶液的溶剂为四氢呋喃(THF)。
进一步的，上述咪唑与三环己基膦混合溶液中咪唑的体积摩尔浓度为1.00mol/L。
进一步的，上述咪唑与三环己基膦混合溶液中三环己基膦的体积摩尔浓度为0.02mol/L。
一种Fmoc法固相合成亮脑啡肽的方法，该方法中第一个氨基酸酪氨酸使用Fmoc-Tyr-OH作为原料，无需侧链保护基。
所述的采用咪唑与三环己基膦混合溶液的Fmoc脱保护过程可能是：
，R为任意除N端胺基以外的树脂加载多肽部分，生成的为(9-芴基甲基)-1-咪唑。
与应用哌啶脱保护剂的方法相比，本发明所述的一种固相合成人类前脑啡肽的方法的创新与优势在于：
1.咪唑为温和稳定的有机弱碱，在常温下比哌啶的理化性质更稳定，低毒低挥发低腐蚀，
使用更安全；咪唑在常温下为固体白色晶体，相对于有一定粘度和腐蚀性的液态哌啶，咪唑更便于运输和储存；咪唑不属于易制毒易制爆化学品，不受《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》管制，科研机构和企业均能在购买和使用过程中轻易获得；咪唑本身的成本也比哌啶更低。
2.本发明使用的催化剂三环己基膦具有大的配体锥角(170°)，可以作为优秀的亲核催化剂促进咪唑对副产物二苯并富烯的化学清除，迅速形成二苯并富烯-咪唑加合物，从而推动整个反应的正向进行。三环己基膦只需要咪唑当量的五十分之一即可有效进行反应催化，碱性适中，对整个脱保护体系的稳定性几乎没有影响。
3.本发明以咪唑与三环己基膦混合四氢呋喃溶液实现无任何侧链保护基的亮脑啡肽固相合成，且未发现传统哌啶法造成的酪氨酸侧链酰化的副产物生成。使用本发明的新方法得到的亮脑啡肽粗产品的纯度已经达到86％，大幅降低了后续纯化的成本和难度，体现了本方法在固相合成亮脑啡肽中的优越性，对其他多肽的生产制备也具有很大的参考意义。
4.本发明提出的亮脑啡肽合成方法与常规Fmoc合成法的操作步骤和工艺流程并无明显差异，无须对现有操作人员进行额外培训，对现有设备也没有额外更新要求。
说明附图
图1.以1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的THF溶液脱保护Fmoc-丙氨酸的Fmoc标准曲线图。
图2.实施例2(应用哌啶作为脱保护剂组分的亮脑啡肽固相合成(酪氨酸侧链无保护基))、实施例3(应用哌啶作为脱保护剂组分的亮脑啡肽固相合成(酪氨酸侧链带保护基))和实施例4应用咪唑与三环己基膦混合溶液作为脱保护剂组分的亮脑啡肽固相合成(酪氨酸侧链无保护基))多肽产物的HPLC对比图。
具体实施方式：
下述实施例中所使用的实验材料、试剂等均可通过商业途径或已知实验方法获得。下面将结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.脱保护方法测试与制作Fmoc标准曲线
步骤1.以Fmoc-丙氨酸(Fmoc-L-Ala)为标准物质，准确称量Fmoc-L-Ala 62.22mg，以2.0mL含1.00mol/L咪唑(136.2mg)与0.02mol/L三环己基膦(11.2mg)的THF溶液处理15分钟。取其中1.0mL，以薄层色谱分离各产物，并与丙氨酸标样对比确定反应终点；以质谱表征确认产物丙氨酸([M+H]+＝90.0513)与副产物1-((9H-芴-9-基)甲基)-1H-咪唑([M+H]+＝247.1194)。取剩余的1.0mL中的0.1mL溶液稀释到10.0mL。
步骤2.以步骤1稀释后的溶液，继续稀释配置成浓度为27、45、68、87、105和126μmol/L的标准溶液。对比THF溶液空白样品(λ＝290nm)，以紫外可见分光光度计测得吸光度分别为：0.23、0.43、0.51、0.60、0.72和0.88。
步骤3.制作Fmoc的标准曲线，其线性回归方程为Y＝0.0067X+0.0237(X轴：浓度(μmol/L)，Y轴：吸光度A，线性相关系数：R2＝0.9988)(图1)。
实施例2，应用哌啶作为脱保护剂组分的亮脑啡肽固相合成(酪氨酸侧链无保护基)
步骤1，预载树脂的制备：称量200.4mg的Wang树脂(载量0.82mmol/g)置于带筛板的针筒式反应器中。用5mL二氯甲烷(DCM)和5mL二甲基甲酰胺(DMF)依次溶胀树脂。将99.5mg Fmoc-L-Tyr-OH(1.5当量)和128.3mg 1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP，1.5当量)完全溶解于5mL DMF，添加85.9μL N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA，3.0当量)，移入反应器与溶胀后的树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。添加含有31.0μL乙酸酐(2.0当量)和57.3μL DIPEA(2.0当量)的DCM溶液。在室温下再搅拌30分钟，对树脂上未反应的羟基进行封端。随后，过滤树脂依次用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用DMF洗涤2次，最后用DCM洗涤3次。真空干燥树脂。
步骤2.脱除树脂上预载Fmoc-L-Tyr的Fmoc保护基：添加5mL 20％哌啶的DMF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比20％(v/v)哌啶的DMF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。
步骤3.依次加载氨基酸Gly、Gly、Phe和Leu及其Fmoc脱保护：以DMF清洗预载树脂5次；将73.2mg Fmoc-L-Gly-OH(1.5当量)、85.9μL DIPEA(3.0当量)和128.3mg PyBOP(1.5当量)混合，溶解于5mL DMF，移入反应器与树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用DMF洗涤3次。添加5mL 20％哌啶的DMF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比20％(v/v)哌啶的DMF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。重复以上步骤，依次以73.2mg Fmoc-L-Gly-OH、95.3mg Fmoc-L-Phe-OH和87.0mg Fmoc-L-Leu-OH为反应物加载其余氨基酸L-Gly、L-Phe和L-Leu至树脂上。茚三酮检测显示，每个氨基酸加载后20％哌啶的DMF溶液均能实现脱保护完全。完成所有氨基酸加载及脱保护后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，用DMF洗涤3次，再用DCM洗涤5次。冻干树脂。
步骤4.从树脂上切割多肽：向冻干后的树脂添加95％的三氟乙酸(TFA)水溶液，震荡反应1小时，过滤树脂收集液相产物。旋蒸除去大部分TFA，余下溶液(约1mL)在50mL冷乙醚中沉淀并以乙醚清洗三次，离心分离并冻干后得到63.1mg亮脑啡肽粗品(HPLC纯度26.17％)。
步骤5.纯化多肽：将亮脑啡肽粗品溶解在少量90％乙腈(2mL)中，离心并0.2μm滤膜过滤。注入制备型RP-HPLC柱进行纯化。移动相为0.1％TFA的水和乙腈。流速10mL/min，梯度30％-50％(100分钟)，波长设置为220nm。分离冻干后得到15.2mg亮脑啡肽产品(最终产率16.7％，HPLC纯度91％)。
实施例3.应用哌啶作为脱保护剂组分的亮脑啡肽固相合成(酪氨酸侧链带保护基)
步骤1，预载树脂的制备：称量200.4mg的Wang树脂(载量0.82mmol/g)置于带筛板的针筒式反应器中。用5mL DCM和5mL DMF依次溶胀树脂。将113.06mg Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH(1.5当量)和128.3mg PyBOP(1.5当量)完全溶解于5mL DMF，添加85.9μL DIPEA(3.0当量)，移入反应器与溶胀后的树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。添加含有31.0μL乙酸酐(2.0当量)和57.3μL DIPEA(2.0当量)的DCM溶液。在室温下再搅拌30分钟，对树脂上未反应的羟基进行封端。随后，过滤树脂依次用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用DMF洗涤2次，最后用DCM洗涤3次。真空干燥树脂。
步骤2.脱除树脂上预载Fmoc-L-Tyr(tBu)的Fmoc保护基：添加5mL 20％哌啶的DMF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比20％(v/v)哌啶的DMF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。
步骤3.依次加载氨基酸Gly、Gly、Phe和Leu及其Fmoc脱保护：以DMF清洗预载树脂5次；将73.2mg Fmoc-L-Gly-OH(1.5当量)、85.9μL DIPEA(3.0当量)和128.3mg PyBOP(1.5当量)混合，溶解于5mL DMF，移入反应器与树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用DMF洗涤3次。添加5mL 20％哌啶的DMF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比20％(v/v)哌啶的DMF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。重复以上步骤，依次以73.2mg Fmoc-L-Gly-OH、95.3mg Fmoc-L-Phe-OH和87.0mg Fmoc-L-Leu-OH为反应物加载其余氨基酸L-Gly、L-Phe和L-Leu至树脂上。茚三酮检测显示，每个氨基酸加载后20％哌啶的DMF溶液均能实现脱保护完全。完成所有氨基酸加载及脱保护后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，用DMF洗涤3次，再用DCM洗涤5次。冻干树脂。
步骤4.从树脂上切割多肽：向冻干后的树脂添加95％的TFA水溶液，震荡反应1小时，过滤树脂收集液相产物。旋蒸除去大部分TFA，余下溶液(约1mL)在50mL冷乙醚中沉淀并以乙醚清洗三次，离心分离并冻干后得到111.7mg亮脑啡肽粗品(HPLC纯度54.20％)。
步骤5.纯化多肽：将亮脑啡肽粗品溶解在少量90％乙腈(2mL)中，离心并0.2μm滤膜过滤。注入制备型RP-HPLC柱进行纯化。移动相为0.1％TFA的水和乙腈。流速10mL/min，梯度30％-50％(100分钟)，波长设置为220nm。分离冻干后得到58.5mg亮脑啡肽产品(相对于树脂理论收率的实际收率61.7％，HPLC纯度96％)。
实施例4.应用咪唑与三环己基膦混合溶液作为脱保护剂组分的亮脑啡肽固相合成(酪氨酸侧链无保护基)
步骤1，预载树脂的制备：称量200.2mg的Wang树脂(载量0.82mmol/g)置于带筛板的针筒式反应器中。用5mL DCM和5mL DMF依次溶胀树脂。将99.5mg Fmoc-L-Tyr-OH(1.5当量)和128.3mg PyBOP(1.5当量)完全溶解于5mL DMF，添加85.9μLDIPEA(3.0当量)，移入反应器与溶胀后的树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。添加含有31.0μL乙酸酐(2.0当量)和57.3μL DIPEA(2.0当量)的DCM溶液。在室温下再搅拌30分钟，对树脂上未反应的羟基进行封端。随后，过滤树脂依次用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用DMF洗涤2次，最后用DCM洗涤3次。真空干燥树脂。
步骤2.脱除树脂上预载Fmoc-L-Tyr的Fmoc保护基：添加含1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的THF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比含1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的THF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。
步骤3.依次加载氨基酸Gly、Gly、Phe和Leu及其Fmoc脱保护：以DMF清洗预载树脂5次；将73.2mg Fmoc-L-Gly-OH(1.5当量)、85.9μL DIPEA(3.0当量)和128.3mg PyBOP(1.5当量)混合，溶解于5mL DMF，移入反应器与树脂充分混合后震荡反应40分钟。反应完毕后过滤树脂。用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，再用THF洗涤3次。添加5mL含1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的THF溶液，在室温下震荡10分钟后过滤。对比含1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的THF溶液空白样品(λ＝290nm)，测量脱保护样品的吸光度确认反应进度，并取极少树脂进行茚三酮检测，呈深蓝色，证明脱保护完全。重复以上步骤，依次以73.2mg Fmoc-L-Gly-OH、95.3mg Fmoc-L-Phe-OH和87.0mg Fmoc-L-Leu-OH为反应物加载其余氨基酸L-Gly、L-Phe和L-Leu至树脂上。茚三酮检测显示，每个氨基酸加载后含1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的THF溶液均能实现脱保护完全。完成所有氨基酸加载及脱保护后，用DMF洗涤3次，用DCM洗涤2次，用DMF洗涤3次，再用DCM洗涤5次。冻干树脂。
步骤4.从树脂上切割多肽：向冻干后的树脂添加95％的TFA水溶液，震荡反应1小时，过滤树脂收集液相产物。旋蒸除去大部分TFA，余下溶液(约1mL)在50mL冷乙醚中沉淀并以乙醚清洗三次，离心分离并冻干后得到90.5mg亮脑啡肽粗品(HPLC纯度85.43％)。
步骤5.纯化多肽：将亮脑啡肽粗品溶解在少量90％乙腈(2mL)中，离心并0.2μm滤膜过滤。注入制备型RP-HPLC柱进行纯化。移动相为0.1％TFA的水和乙腈。流速10mL/min，梯度30％-50％(100分钟)，波长设置为220nm。分离冻干后得到60.2mg亮脑啡肽产品(相对于树脂理论收率的实际收率63.5％，HPLC纯度97％)。即使侧链无保护基，实施例3的实际收率相比实施例1依然提高至近四倍，且最终产物的收率和纯度也与需要额外侧链保护基的常规方法的实施例2相当甚至更高(图2)。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均包括在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (1)
1.一种Fmoc法固相合成亮脑啡肽的方法，其特征在于：该方法中Fmoc脱保护剂采用含1.00mol/L咪唑与0.02mol/L三环己基膦的四氢呋喃溶液，且采用的氨基酸均不带有任何侧链保护基团。
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