CN116554103A - 苯基吡唑类化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苯基吡唑类化合物。本发明还公开了前述化合物在制备治疗前列腺癌药物中的应用。本发明所提供的苯基吡唑类化合物对雄激素受体具有明显的拮抗活性，为前列腺癌的药物开发提供了新的途径。

Description

苯基吡唑类化合物及其应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及了一种作为雄激素受体拮抗剂的苯基吡唑类化合物及其在前列腺癌治疗药物的制备中的应用。
技术背景
前列腺癌是男性之中最为常见的恶性肿瘤之一，在西方国家，它是第二大癌症导致死亡的病因，仅次于肺癌。估算，2021年美国将新增248530例前列腺癌患者，其中新增死亡病例将达到34130人。目前，前列腺癌在我国的发病率也在逐年上升。70多年前，CharlesHuggins证明了前列腺癌是雄激素依赖的，通过睾丸切除术可以诱导肿瘤的消退。因此，雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy，ADT)成为了主要的治疗方法。在治疗早期，症状确实能得到一定程度的缓解，但最终绝大多数患者会发展成为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)。在CRPC中，尽管雄激素的浓度已经降低到极低的水平，但是肿瘤依然继续生存，患者一般在2-4年后死亡。研究表明，CRPC的生长仍然是AR依赖的，因此靶向AR信号通路对于治疗前列腺癌仍然具有重要意义。
雄激素受体(androgen receptor，AR)属于核受体超家族，它是一种配体依赖型的转录因子，与其他核受体具有相似的结构和功能，调控某些特定基因的表达。AR蛋白包含919个氨基酸，由四个重要的结构域组成，N-末端结构域(N-terminal domain，NTD)，DNA结合域(DNA binding domain，DBD)，C-末端配体结合域(ligand binding domain，LBD)，DBD和LBD之间通过一个铰链区(hinge)连接。男性的睾酮等雄激素主要由睾丸合成，一旦被合成出来，睾酮就与血清中的性激素结合球蛋白和白蛋白结合。游离的睾酮进入前列腺细胞中，在5α-还原酶的催化下生成活性更高的二氢睾酮(DHT)，在正常情况下，雄激素受体是与热休克蛋白结合的，当雄激素与AR结合后产生构象变化，诱导AR与热休克蛋白解离，随后转运至细胞核内。在细胞核内形成AR同源二聚体，识别目标基因启动子区域的雄激素反应元件，募集更多共调控蛋白，来促进AR靶基因的转录。
雄激素受体拮抗剂(Androgen receptor antagonists)或抗雄激素(Antiandrogen)通过直接结合或阻断AR配体结合域，抑制AR活性，阻止雄激素发挥相应的生物活性。
根据化学结构的不同，抗雄激素可以分为甾体类和非甾体类。甾体类抗雄激素醋酸环丙孕酮由于其口服生物利用度和选择性差，易引起不良反应，从而限制了其临床应用。目前，已经上市的非甾体类抗雄激素包括第一代的氟他胺(Flutamide)、尼鲁米特(Nilutamide)、和比卡鲁胺(Bicalutamide)以及第二代的恩杂鲁胺(Enzalutamide)、阿帕鲁胺(Apalutamide)和达洛鲁胺(Darolutamide)。这些拮抗剂对AR具有基本相同的作用机制，它们均作用于AR LBD的配体结合口袋(ligand binding pocket，LBP)，具体来说，它们与AR LBP结合后引起AR蛋白的构象变化，从而阻止了AR的激活。虽然在治疗初期，这些抗雄激素能够抑制肿瘤的生长，但是在长期治疗中会不可避免地产生耐药性，甚至还有可能将拮抗剂转变为激动剂，从而促进肿瘤的生长。比如，已有文献报道第二代拮抗剂恩杂鲁胺的长期使用会导致AR LBD发生错义突变F876L，从而产生恩杂鲁胺耐药性，使其由拮抗剂变为激动剂。因此，研发新型的、安全有效的AR拮抗剂显得十分迫切，这对于提供前列腺癌治疗策略，提高患者生存率和生活质量有着重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的具有雄激素受体拮抗活性的化合物，并将其应用于抗前列腺癌药物中。
本发明所提供的一种结构式如式(I)所示的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐：
R1选自氢、卤素、氰基、硝基；
R2选自氢、三氟甲基、卤素、氰基、硝基、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基；
R3选自氢、卤素、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基、芳基；
环A选自C5-12碳环、杂环、芳环、芳杂环、苯并杂环，其中环上的碳原子可被一个或多个杂原子取代；
R4和R5分别独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基、羟基取代的C1-6烷基、氰基、硝基、酰胺基、酯基、芳环、芳杂环；
n为0，1，2或3；
X选自–NHC(O)–、–NHS(O)2–、–NHC(O)NH–、–C(O)NH–；
术语说明：所述的C1-6烷基，是指包含1-6个碳原子的直链或支链烃链。实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基和取代的烷基。
所述的烷氧基是指-O-烷基基团，其中烷基如上所述。实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基和取代的烷氧基。
所述的芳环是指5-12个碳原子的全碳单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子系统。实例包括苯环、萘环、蒽环。
所述的芳杂环是指5-12个碳原子的非全碳单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子系统。实例包括但不限于吡啶、咪唑、吡唑、呋喃、噻唑、吲哚、噻吩。
所述的卤素是指氟、氯、溴或碘。
作为优选，R1选自氰基、硝基；R2选自氯、三氟甲基；R3为氢或甲基。
作为优选，环A选自
作为优选，R4和R5分别独立地选自氢、氟、氯、甲基、甲氧基、三氟甲基、2-羟基-丙-2-基、氰基、硝基、氨基甲酰基。
作为优选，X选自
作为进一步的优选，R1为氰基；R2为三氟甲基或氯；R3为氢；n为1；X为–C(O)NH–；环A为吡啶环或者苯环；R4和R5分别独立地选自氢、F、氰基或硝基。
作为优选，所述化合物的结构式如下式所示。
作为优选，所述的药学上可接受的盐为盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、苯磺酸盐、磷酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或富马酸盐。
本发明研究表明，所述化合物具有显著的雄激素受体转录抑制活性，并且能明显抑制前列腺癌细胞的增殖，且没有明显的细胞毒性。
本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备雄激素受体拮抗剂中的应用。
本发明还提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
本发明还提供了所述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其反应路线如下所示：
中间体按照下列路线合成：
或者
或者
或者
n为0，1，2或3；
化合物1和2按照下列路线制备：
化合物3-24按照下列路线制备：
化合物25-27按照下列路线制备：
化合物28-48按照下列路线制备：
R1，R2，R3，R4，R5分别如上文所述。
附图说明
图1为化合物33，40，47在一系列浓度梯度下对LNCaP细胞增殖抑制的实验结果。
图2为化合物33，40，47在一系列浓度梯度下对22Rv1细胞增殖抑制的实验结果。
图3为化合物33，40，47在一系列浓度梯度下对DU145细胞增殖抑制的实验结果。
图4为化合物33，40，47在一系列浓度梯度下对PC3细胞增殖抑制的实验结果。
图5为化合物33，40，47在一系列浓度梯度下对GES-1细胞增殖抑制的实验结果。
图6为化合物33，40，47在一系列浓度梯度下对Chang细胞增殖抑制的实验结果。
图7为化合物33，40，47在一系列浓度梯度下在LNCaP细胞中对前列腺特异性抗原(PSA)蛋白水平的抑制结果。
具体实施方式
以下是本发明结合具体实施例作进一步的说明。具体实施例是为了举例说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：1-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-3-(4-氟苯基)脲(1)的合成
a)中间体1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸甲酯
在100mL两口圆底烧瓶中，分别加入4-溴-2-三氟甲基苯腈(7.50g，30mmol)，3-吡唑羧酸甲酯(4.54g，36mmol)，碘化亚铜(1.14g，6mmol)，L-脯氨酸(1.38g，12mmol)，碳酸钾(8.29g，60mmol)，氩气交换后加入50mL二甲基亚砜，加热至100℃反应3h。经TLC监测，反应完全后，冷却至室温，加入乙酸乙酯和水搅拌30min，过滤除去不溶物，滤液使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用大量水洗，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，所得粗品用PE/EA重结晶，过滤得白色固体(6.20g，70％)。
b)中间体1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸
在100mL单口圆底烧瓶中，称取上一步的产物(4.43g，15mmol)溶于30mL四氢呋喃中，随后加入氢氧化锂(1.08g，45mmol)和6mL水，室温搅拌2h。经TLC监测，反应完全后，向反应液中加入2N HCl溶液，调节pH至3～4，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体(4.01g，95％)。
c)中间体(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)氨基甲酸叔丁酯
称取上一步的产物羧酸(2.81g，10mmol)置于100mL两口圆底烧瓶中，氩气交换后加入20mL叔丁醇和20mL二氧六环溶解，分别加入叠氮磷酸二苯酯(2.59mL，3.30g，12mmol)和三乙胺(1.67mL，1.21g，12mmol)，加热至100℃过夜。经TLC监测，反应完全后，冷却至室温，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后用PE/EA(v/v，5/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得黄色液体(2.22g，63％)。
d)中间体4-(3-氨基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
称取上一步的产物(1.76g，5mmol)置于50mL单口圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷溶解，随后加入三氟乙酸(1.91mL，2.85g，25mmol)，加热回流5h。经TLC监测，反应完全后，旋掉残留的三氟乙酸，加入饱和碳酸氢钠，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后用DCM/MeOH(v/v，100/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得黄色固体(1.07g，85％)。
e)1-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-3-(4-氟苯基)脲(1)
称取上一步的产物胺(126mg，0.5mmol)置于25mL两口圆底烧瓶中，氩气交换后加入无水四氢呋喃溶解，冷却至0℃，滴加4-氟苯基异氰酸酯(85μL，103mg，0.75mmol)，随后滴加三乙胺(104μL，76mg，0.75mmol)，滴加完毕后恢复室温反应过夜。经TLC监测，反应完全后，加入水，过滤出不溶的固体，加水洗涤，粗品用DCM/MeOH(v/v，30/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得产物。
白色固体；收率：82％；m.p.315.6-316.7℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ9.53(br,1H),8.87(br,1H),8.75(d,J＝2.5Hz,1H),8.32–8.21(m,3H),7.48(dd,J＝9.0,5.0Hz,2H),7.14(t,J＝9.0Hz,2H),6.80(d,J＝2.5Hz,1H)。
实施例2：1-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-3-(4-氟苯基)脲(2)的合成
a)中间体4-(3-羟甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
在100mL两口圆底烧瓶中，加入制备实施例1(b)所得的中间体1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸(4.22g，15mmol)，氩气交换后加入15mL无水四氢呋喃，冷却至-5℃，缓慢滴加1.0mol/L的硼烷四氢呋喃络合物(75mL，75mmol)，滴加完毕后，保持低温搅拌5h。经TLC监测，反应完全后，向反应液中缓慢滴加10mL甲醇淬灭，然后移至室温搅拌30min，旋干溶剂，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后用DCM/MeOH(v/v，50/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得白色固体(3.49g，87％)。
b)中间体(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基-4-甲基苯磺酸酯
称取上一步产物(2.67g，10mmol)，4-二甲氨基吡啶(0.12g，1mmol)加入100mL单口圆底烧瓶中，加入三乙胺(2.02g，20mmol)，用20mL无水二氯甲烷溶解，冷却至0℃。随后将对甲苯磺酰氯(1.91g，10mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，在0℃下缓慢滴加入圆底烧瓶中，滴加完毕后，保持低温反应2h。经TLC监测，反应完全后，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后得粗品白色固体，直接投下一步。
c)中间体4-(3-叠氮甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
将上一步得到的产物置于100mL单口圆底烧瓶中，加入20mL丙酮溶解，于室温下搅拌。将叠氮化钠(1.63g，25mmol)缓慢加入圆底烧瓶中，然后升温至60℃加热回流3h。经TLC监测，反应完全后，旋掉丙酮，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后用PE/EA(v/v，4/1)为洗脱剂经硅胶柱层析分离得黄色固体(2.63g，90％)。
d)中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
将上一步得到的产物(2.63g，9mmol)置于100mL单口圆底烧瓶中，加入20mL四氢呋喃溶解，于室温下搅拌。依次缓慢加入三苯基膦(2.60g，9.9mmol)和5mL水，室温下反应12h。经TLC监测，反应完全后，加入2N HCl溶液调节pH至酸性，使用乙酸乙酯萃取，弃去有机层，水层加入氢氧化钠调节pH至碱性，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩，所得粗品用PE/EA重结晶，过滤得白色固体(1.96g，82％)。
e)1-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-3-(4-氟苯基)脲(2)
利用实施例1(e)所述的方法，由上一步的中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氟苯基异氰酸酯反应得到。
白色固体；收率：85％；m.p.264.6-265.5℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ8.77(d,J＝2.0Hz,1H),8.70(br,1H),8.38(s,1H),8.34–8.28(m,2H),7.41(dd,J＝8.5,5.0Hz,2H),7.06(t,J＝8.5Hz,2H),6.65(t,J＝5.5Hz,1H),6.58(d,J＝2.0Hz,1H),4.37(d,J＝5.5Hz,2H)。
实施例3：N-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基-1H-吡唑-3-基)-4-氟苯甲酰胺(3)的合成
在25mL二口圆底烧瓶中，分别加入4-氟苯甲酸(84mg，0.6mmol)，HATU(228mg，0.6mmol)，氩气交换后加入5mL无水二氯甲烷溶解，随后加入N,N-二异丙基乙胺(105μL，77mg，0.6mmol)，室温下搅拌10min，将实施例1(d)所得的中间体4-(3-氨基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈(126mg，0.5mmol)加入反应体系中，室温下反应过夜。经TLC监测，反应完全后，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用PE/EA(v/v，2/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得白色固体。
白色固体；收率：90％；m.p.205.4-206.5℃；1H NMR(400MHz,Acetone–d6)δ10.35(br,1H),8.62(d,J＝2.5Hz,1H),8.34(s,1H),8.29–8.17(m,4H),7.31(t,J＝8.8Hz,2H),7.22(d,J＝2.5Hz,1H)。
实施例4：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氟苯甲酰胺(4)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氟苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：90％；m.p.200.1-201.6℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.60(d,J＝2.5Hz,1H),8.41–8.37(m,1H),8.36–8.29(m,2H),8.19(d,J＝8.5Hz,1H),8.06–8.00(m,2H),7.28–7.18(m,2H),6.65(d,J＝2.5Hz,1H),4.68(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例5：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氯苯甲酰胺(5)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氯苯甲酸经缩合反应制备而成。
淡黄色固体；收率：89％；m.p.183.9-184.7℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.58(d,J＝2.6Hz,1H),8.41–8.36(m,2H),8.32–8.28(m,1H),8.18(d,J＝8.5Hz,1H),7.97(d,J＝9.0Hz,2H),7.50(d,J＝9.0Hz,2H),6.64(d,J＝2.6Hz,1H),4.69(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例6：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(6)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-三氟甲基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：87％；m.p.218.9-220.6℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.60(d,J＝2.5Hz,1H),8.53(br,1H),8.39(d,J＝2.0Hz,1H),8.31(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),8.18(d,J＝8.5Hz,1H),8.15(d,J＝8.0Hz,2H),7.83(d,J＝8.0Hz,2H),6.66(d,J＝2.5Hz,1H),4.72(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例7：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氰基苯甲酰胺(7)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氰基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：82％；m.p.205.8-207.1℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.60(d,J＝3.0Hz,1H),8.55(br,1H),8.38(d,J＝2.0Hz,1H),8.31(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),8.19(d,J＝8.5Hz,1H),8.12(d,J＝8.5Hz,2H),7.90(d,J＝8.6Hz,2H),6.66(d,J＝3.0Hz,1H),4.71(d,J＝5.5Hz,2H)。
实施例8：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-硝基苯甲酰胺(8)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-硝基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：80％；m.p.209.7-210.8℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.63(t,J＝6.0Hz,1H),8.60(d,J＝2.5Hz,1H),8.38(d,J＝2.0Hz,1H),8.34–8.29(m,3H),8.21–8.17(m,3H),6.67(d,J＝2.5Hz,1H),4.73(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例9：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-(2-羟基丙-2-基)苯甲酰胺(9)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-(2-羟基丙-2-基)苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：64％；m.p.181.3-182.7℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ8.57(d,J＝2.5Hz,1H),8.39(d,J＝2.0Hz,1H),8.31(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),8.25(t,J＝6.0Hz,1H),8.17(d,J＝8.5Hz,1H),7.91(d,J＝8.5Hz,2H),7.62(d,J＝8.5Hz,2H),6.64(d,J＝2.5Hz,1H),4.69(d,J＝6.0Hz,2H),4.19(s,1H),1.53(s,6H)。
实施例10：N4-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-2-氟-N1-甲基对苯二甲酰胺(10)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-(甲基氨基甲酰基)-3-氟苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：57％；m.p.261.4-262.8℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ9.26(t,J＝5.5Hz,1H),8.78(d,J＝2.5Hz,1H),8.40–8.35(m,2H),8.34–8.28(m,2H),7.80–7.68(m,3H),6.61(d,J＝2.5Hz,1H),4.56(d,J＝5.5Hz,2H),2.78(d,J＝4.5Hz,3H)。
实施例11：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-5-(1-羟基乙基)-1H-吡唑-3-甲酰胺(11)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和5-(1-羟基乙基)-1H-吡唑-3-甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：63％；m.p.188.0-189.8℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ12.32(br,1H),8.57(d,J＝2.5Hz,1H),8.39(d,J＝2.0Hz,1H),8.30(dd,J＝8.5,2.0Hz,2H),8.18(d,J＝8.5Hz,1H),8.01(br,1H),6.67–6.57(m,2H),5.03–4.96(m,1H),4.66(d,J＝6.0Hz,2H),4.60(br,1H),1.50(d,J＝6.5Hz,5H)。
实施例12：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-6-氟吡啶酰胺(12)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和6-氟烟酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：92％；m.p.226.4-227.6℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ9.31(br,1H),8.83–8.69(m,2H),8.47–8.26(m,4H),7.32(d,J＝7.2Hz,1H),6.63(s,1H),4.57(d,J＝4.8Hz,2H)。
实施例13：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-5-氟吡啶酰胺(13)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和5-氟-2-吡啶羧酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：88％；m.p.220.7-221.8℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ9.30(t,J＝6.0Hz,1H),8.75(d,J＝2.2Hz,1H),8.66(d,J＝2.4Hz,1H),8.35(s,1H),8.32–8.25(m,2H),8.13(dd,J＝8.8,4.8Hz,1H),7.91(td,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.57(d,J＝2.2Hz,1H),4.57(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例14：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氟苯甲酰胺(14)的合成
中间体4-(3-(氨基乙基)-4-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈利用实施例1(a-b)和实施例2(a-d)所述的方法，将3-吡唑羧酸甲酯替换为4-甲基-1H-吡唑-3-羧酸甲酯制备而成，再利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(氨基乙基)-4-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氟苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：84％；m.p.208.2-209.4℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ8.99(t,J＝5.5Hz,1H),8.58(s,1H),8.33–8.21(m,3H),7.96(dd,J＝8.5,5.5Hz,2H),7.29(t,J＝8.8Hz,2H),4.54(d,J＝5.5Hz,2H),2.08(s,3H)。
实施例15：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氰基苯甲酰胺(15)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(氨基乙基)-4-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氰基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：82％；m.p.237.1-238.1℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ9.24(br,1H),8.59(s,1H),8.34–8.20(m,3H),8.03(d,J＝8.0Hz,2H),7.96(d,J＝8.0Hz,2H),4.56(d,J＝4.5Hz,2H),2.09(s,3H)。
实施例16：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-硝基苯甲酰胺(16)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(氨基乙基)-4-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-硝基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：81％；m.p.249.8-250.5℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ9.33(t,J＝5.5Hz,1H),8.59(s,1H),8.33–8.30(m,3H),8.27(d,J＝8.5Hz,1H),8.23(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),8.11(d,J＝9.0Hz,2H),4.57(d,J＝5.5Hz,2H),2.10(s,3H)。
实施例17：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-4-三氟甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氟苯甲酰胺(17)的合成
中间体4-(3-氨基甲基-4-三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈利用实施例1(a-b)和实施例2(a-d)所述的方法，将3-吡唑羧酸甲酯替换为4-三氟甲基-1H-吡唑-3-羧酸甲酯制备而成，再利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-4-三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氟苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：86％；m.p.192.4-193.5℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ9.50(s,1H),9.09(t,J＝5.5Hz,1H),8.48(s,1H),8.39–8.35(m,2H),7.94(dd,J＝9.0,5.5Hz,2H),7.32(t,J＝9.0Hz,2H),4.66(d,J＝5.5Hz,2H)。
实施例18：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-4-苯基-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氟苯甲酰胺(18)的合成
中间体4-(3-氨基甲基-4-苯基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈利用实施例1(a-b)和实施例2(a-d)所述的方法，将3-吡唑羧酸甲酯替换为4-苯基-1H-吡唑-3-羧酸甲酯制备而成，再利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-氨基甲基-4-苯基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氟苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：79％；m.p.207.0-208.2℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ9.14(s,1H),9.01(t,J＝5.5Hz,1H),8.46–8.43(m,1H),8.37–8.31(m,2H),7.87(dd,J＝9.0,6.0Hz,2H),7.61(d,J＝7.5Hz,2H),7.44(t,J＝7.5Hz,2H),7.33(t,J＝7.5Hz,1H),7.27(t,J＝9.0Hz,2H),4.73(d,J＝5.5Hz,2H)。
实施例19：N-(2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙基)-4-氟苯甲酰胺(19)的合成
a)中间体4-(3-甲酰基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
将实施例2(a)所得的中间体4-(3-羟甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈(2.67g，10mmol)置于100mL单口圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷溶解，加入二氧化锰(4.35g，50mmol)，加热至45℃回流5h。经TLC监测，反应完全后，反应液经硅藻土过滤除去二氧化锰，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩后用DCM/MeOH(v/v，100/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得白色固体(2.44g，92％)。
b)中间体4-(3-乙烯基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
称取甲基三苯基溴化膦(4.82g，13.5mmol)和60％的氢化钠(0.86g，36mmol)置于100mL两口圆底烧瓶中，氩气交换，冷却至-20℃，加入15mL无水四氢呋喃溶解，搅拌30min，转移至室温搅拌2h。将反应液重新冷却至0℃，将上一步的产物醛(2.39g，9mmol)溶于15mL无水四氢呋喃中，缓慢滴加到圆底烧瓶中，随后转移至室温反应过夜。经TLC监测，反应完全后，加入饱和氯化铵淬灭，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后用PE/EA(v/v，4/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得白色固体(2.66g，75％)。
c)中间体4-(3-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼-2-基)乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
称取上一步的产物(1.32g，5mmol)，联硼酸频那醇酯(1.90g，7.5mmol)，碳酸铯(4.07g，12.5mmol)，置于100mL两口圆底烧瓶中，氩气交换后，加入15mL二氧六环溶解，随后加入甲醇(1.01mL，0.8g，25mmol)，加热至100℃反应过夜。然后向反应液中加入乙酸乙酯稀释，经硅藻土过滤除去不溶物，乙酸乙酯洗涤滤渣，滤液浓缩后得粗品黄色固体，直接投下一步反应。
d)中间体4-(3-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
将上一步得到的粗品产物置于50mL单口圆底烧瓶中，加入15mL四氢呋喃溶解，冷却至0℃，称取氢氧化钠(1.0g，25mmol)加入圆底烧瓶中，随后缓慢滴加30％的双氧水(2.55mL，2.83g，25mmol)，滴加完毕后保持低温反应2h。经TLC监测，反应完全后，加入水淬灭，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后用DCM/MeOH(v/v，100/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得白色固体(703mg，50％)。
e)中间体4-(3-(2-氨基乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
利用实施例2(b-d)所述的方法，以上一步得到的中间体4-(3-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈为原料制备而成。
f)N-(2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙基)-4-氟苯甲酰胺(19)
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(2-氨基乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氟苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：75％；m.p.165.4-166.7℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ8.74(d,J＝2.5Hz,1H),8.64(t,J＝5.5Hz,1H),8.36–8.33(m,1H),8.32–8.26(m,2H),7.89(dd,J＝8.8,5.5Hz,2H),7.28(t,J＝8.8Hz,2H),6.58(d,J＝2.5Hz,1H),3.63–3.55(m,2H),2.94(t,J＝7.5Hz,2H)。
实施例20：N-(2-(1-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑-3-基)乙基)-4-氰基苯甲酰胺(20)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(2-氨基乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氰基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率74％；m.p.236.7-237.9℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ8.88(t,J＝6.0Hz,1H),8.75(d,J＝2.5Hz,1H),8.33(s,1H),8.31–8.26(m,2H),7.99–7.93(m,4H),6.58(d,J＝2.5Hz,1H),3.64–3.58(m,2H),2.95(t,J＝7.5Hz,2H)。
实施例21：N-(2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙基)-4-硝基苯甲酰胺(21)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(2-氨基乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-硝基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：71％；m.p.206.0-207.5℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ8.96(t,J＝5.5Hz,1H),8.75(d,J＝2.5Hz,1H),8.35–8.33(m,1H),8.32–8.27(m,4H),8.05(d,J＝9.0Hz,2H),6.59(d,J＝2.5Hz,1H),3.66–3.60(m,2H),2.96(t,J＝7.0Hz,2H)。
实施例22：N-(3-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)丙基)-4-氟苯甲酰胺(22)的合成
a)中间体(E)-3-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)丙烯酸
称取丙二酸(1.56g，15mmol)置于50mL单口圆底烧瓶中，加入5mL吡啶和0.5mL哌啶溶解，加热至85℃，将实施例19(a)所得的中间体4-(3-甲酰基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈(2.65g，10mmol)缓慢加入圆底烧瓶中，反应液继续加热反应6h。经TLC监测，反应完全后，冷却至室温，反应液加入2N HCl溶液中和，析出白色固体，过滤，加水洗涤三次，滤渣用乙醇重结晶得白色固体(2.76g，90％)。
b)中间体3-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)丙酸
在100mL两口圆底烧瓶中，加入上一步的产物(2.76g，9mmol)，Pd/C(276mg，10％Pd)，加入15mL甲醇溶解，室温下于氢气环境中反应8h。经TLC监测，反应完全后，加入乙酸乙酯稀释，经硅藻土过滤除去不溶物，用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩后用DCM/MeOH(v/v，50/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得白色固体(2.48g，89％)。
c)中间体4-(3-(3-氨基丙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈
利用实施例2(a-d)所述的方法，以上一步得到的中间体3-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)丙酸为原料制备而成。
d)N-(3-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)丙基)-4-氟苯甲酰胺(22)
/>
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(3-氨基丙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氟苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：77％；m.p.151.9-153.0℃；1H NMR(400MHz,Acetone–d6)δ8.56(d,J＝2.4Hz,1H),8.37(d,J＝2.0Hz,1H),8.29(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),8.17(d,J＝8.4Hz,1H),7.95(dd,J＝8.8,5.6Hz,2H),7.86(br,1H),7.19(t,J＝8.8Hz,2H),6.56(d,J＝2.4Hz,1H),3.55–3.47(m,2H),2.90–2.79(m,2H),2.09–2.04(m,2H)。
实施例23：N-(3-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)丙基)-4-氰基苯甲酰胺(23)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(3-氨基丙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-氰基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：75％；m.p.200.2-201.1℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ8.76(t,J＝5.2Hz,1H),8.72(d,J＝2.4Hz,1H),8.34–8.25(m,3H),8.00–7.91(m,4H),6.57(d,J＝2.4Hz,1H),3.40–3.33(m,2H),2.72(t,J＝7.6Hz,2H),1.99–1.89(m,2H)。
实施例24：N-(3-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)丙基)-4-硝基苯甲酰胺(24)的合成
利用实施例3所述的方法，由中间体4-(3-(3-氨基丙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈和4-硝基苯甲酸经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：69％；m.p.170.3-171.8℃；1H NMR(400MHz,Acetone–d6)δ8.55(d,J＝2.4Hz,1H),8.36(d,J＝1.6Hz,1H),8.30–8.25(m,3H),8.19–8.08(m,4H),6.56(d,J＝2.6Hz,1H),3.59–3.52(m,2H),2.90–2.80(m,2H),2.12–2.06(m,2H)。
实施例25：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氟苯磺酰胺(25)的合成
将实施例2(d)所得的中间体4-(3-氨基甲基-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈(133mg，0.5mmol)置于25mL单口圆底烧瓶中，加入5mL无水四氢呋喃溶解，随后加入三乙胺(83μL，61mg，0.6mmol)，冷却至0℃，缓慢加入4-氟苯磺酰氯(117mg，0.6mmol)，加完后恢复室温反应2h。经TLC监测，反应完全后，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用PE/EA(v/v，2/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得产物。
白色固体；收率：91％；m.p.196.7-198.1℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.51(d,J＝2.5Hz,1H),8.30(d,J＝2.0Hz,1H),8.24(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),8.18(d,J＝8.5Hz,1H),7.92(dd,J＝8.8,5.0Hz,2H),7.26(t,J＝8.8Hz,2H),7.15(t,J＝6.0Hz,1H),6.51(d,J＝2.5Hz,1H),4.30(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例26：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-三氟甲基苯磺酰胺(26)的合成
利用实施例25所述的方法，将4-氟苯磺酰氯替换为4-三氟甲基苯磺酰氯制备而成。
白色固体；收率：88％；m.p.165.9-167.9℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.48(d,J＝2.5Hz,1H),8.25(d,J＝2.0Hz,1H),8.21–8.16(m,2H),8.03(d,J＝8.0Hz,2H),7.80(d,J＝8.5Hz,2H),7.39(t,J＝6.0Hz,1H),6.51(d,J＝2.5Hz,1H),4.38(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例27：N-((1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-氰基苯磺酰胺(27)的合成
利用实施例25所述的方法，将4-氟苯磺酰氯替换为4-氰基苯磺酰氯制备而成。
白色固体；收率：78％；m.p.212.4-213.5℃；1H NMR(500MHz,Acetone–d6)δ8.50(d,J＝2.5Hz,1H),8.26(s,1H),8.23–8.17(m,2H),7.99(d,J＝8.5Hz,2H),7.88(d,J＝8.5Hz,2H),7.44(t,J＝6.0Hz,1H),6.51(d,J＝2.5Hz,1H),4.38(d,J＝6.0Hz,2H)。
实施例28：1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-N-(4-氟苯基)-1H-吡唑-3-甲酰胺(28)的合成
在25mL两口圆底烧瓶中，分别加入实施例1(b)所得的中间体1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸(140mg，0.5mmol)和HATU(228mg，0.6mmol)，氩气交换后加入5mL无水二氯甲烷溶解，加入N,N-二异丙基乙胺(105μL，77mg，0.6mmol)，室温下搅拌10min，称取4-氟苯胺(57μL，67mg，0.6mmol)加入反应体系中，室温下反应过夜。经TLC监测，反应完全后，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，依次用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用PE/EA(v/v，2/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得产物。
白色固体；收率：82％；m.p.229.3-230.0℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.39(br,1H),8.98(d,J＝2.4Hz,1H),8.65(d,J＝1.5Hz,1H),8.56(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),8.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.83(dd,J＝8.8,4.8Hz,2H),7.22(t,J＝8.9Hz,2H),7.14(d,J＝2.4Hz,1H)。
实施例29：1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-N-(4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-甲酰胺(29)的合成
利用实施例28所述的方法，将4-氟苯胺替换为4-氰基苯胺制备而成。
黄色固体；收率：60％；m.p.301.2-302.3℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.69(br,1H),9.00(d,J＝2.4Hz,1H),8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.57(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.43(d,J＝8.8Hz,1H),8.05(d,J＝8.8Hz,2H),7.85(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.4Hz,1H)。
实施例30：1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-N-(6-氟吡啶-3-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺(30)的合成
利用实施例28所述的方法，将4-氟苯胺替换为2-氟-5-氨基吡啶制备而成。
白色固体；收率：79％；m.p.200.3-201.0℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.64(br,1H),9.00(d,J＝2.4Hz,1H),8.66–8.62(m,2H),8.56(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.44(d,J＝8.8Hz,1H),8.39–8.33(m,1H),7.24(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H),7.16(d,J＝2.4Hz,1H)。
实施例31：1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-N-(5-氟吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺(31)的合成
利用实施例28所述的方法，将4-氟苯胺替换为2-氨基-5-氟吡啶制备而成。
白色固体；收率：70％；m.p.218.5-219.9℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.71(br,1H),8.97(d,J＝2.4Hz,1H),8.71(d,J＝2.0Hz,1H),8.60(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),8.43(d,J＝2.8Hz,1H),8.40(d,J＝8.4Hz,1H),8.23(dd,J＝9.2,4.4Hz,1H),7.87–7.80(m,1H),7.20(d,J＝2.4Hz,1H)。
实施例32：1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-N-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺(32)的合成
利用实施例28所述的方法，将4-氟苯胺替换为4-氨基吡啶制备而成。
白色固体；收率：81％；m.p.236.8-237.2℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.65(br,1H),9.00(d,J＝2.4Hz,1H),8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.57(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.53–8.49(m,2H),8.44(d,J＝8.4Hz,1H),7.87–7.83(m,2H),7.19(d,J＝2.4Hz,1H)。
实施例33：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺(33)的合成
a)中间体2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸
称取实施例19(d)所得的中间体4-(3-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-1-基)-2-三氟甲基苯腈(844mg，3mmol)，2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(47mg，0.3mmol)置于50mL单口圆底烧瓶中，加入10mL乙腈和10mL磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.7)溶解，加热至35℃。称取80％的亚氯酸钠(1.36g，15mmol)分五批，每次间隔30min加入圆底烧瓶中，向反应液中滴加若干滴次氯酸钠溶液(6-14％活性氯)，使反应液维持酒红色。经TLC监测，反应完全后，加入氢氧化钠溶液调节pH至碱性，使用乙酸乙酯萃取，弃掉有机层，水层加1N HCl溶液调节pH至酸性，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，使用饱和氯化钠洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后用DCM/MeOH(v/v，50/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得白色固体(646mg，73％)。
b)2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺(33)
在25mL两口圆底烧瓶中，分别加入上一步的产物(148mg，0.5mmol)和HATU(228mg，0.6mmol)，氩气交换后加入5mL无水二氯甲烷溶解，加入N,N-二异丙基乙胺(105μL，77mg，0.6mmol)，室温下搅拌10min，称取4-氟苯胺(57μL，67mg，0.6mmol)加入反应体系中，室温下反应过夜。经TLC监测，反应完全后，加入水，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，依次用1NHCl溶液，饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用PE/EA(v/v，2/1)为展开剂经硅胶柱层析分离得产物。
白色固体；收率：82％；m.p.227.5-228.6℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.30(br,1H),8.77(d,J＝2.4Hz,1H),8.37(s,1H),8.33–8.27(m,2H),7.62(dd,J＝8.8,5.2Hz,2H),7.15(t,J＝8.8Hz,2H),6.64(d,J＝2.4Hz,1H),3.78(s,2H)。
实施例34：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(4-氰基苯基)乙酰胺(34)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为4-氰基苯胺制备而成。
黄色固体；收率：81％；m.p.215.4-216.4℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.67(br,1H),8.78(d,J＝2.0Hz,1H),8.37(s,1H),8.34–8.26(m,2H),7.82–7.74(m,4H),6.65(d,J＝2.0Hz,1H),3.86(s,2H)。
实施例35：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(4-硝基苯基)乙酰胺(35)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为4-硝基苯胺制备而成。
黄色固体；收率：79％；m.p.227.4-228.9℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.86(br,1H),8.79(d,J＝2.0Hz,1H),8.37(s,1H),8.32–8.20(m,4H),7.85(d,J＝8.8Hz,2H),6.66(d,J＝2.0Hz,1H),3.89(s,2H)。
实施例36：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(4-甲基苯基)乙酰胺(36)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为4-甲基苯胺制备而成。
白色固体；收率：86％；m.p.214.2-215.6℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.13(br,1H),8.77(d,J＝2.4Hz,1H),8.37(s,1H),8.33–8.27(m,2H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.63(d,J＝2.4Hz,1H),3.77(s,2H),2.24(s,3H)。
实施例37：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-甲氧基苯基)乙酰胺(37)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为4-甲氧基苯胺制备而成。
米白色固体；收率：93％；m.p.208.9-210.4℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.08(br,1H),8.77(d,J＝2.4Hz,1H),8.37(s,1H),8.33–8.27(m,2H),7.51(d,J＝9.0Hz,2H),6.88(d,J＝9.0Hz,2H),6.63(d,J＝2.4Hz,1H),3.75(s,2H),3.71(s,3H)。
实施例38：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺(38)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为3,4-二氟苯胺制备而成。
白色固体；收率：83％；m.p.183.6-184.7℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.48(br,1H),8.75(d,J＝2.4Hz,1H),8.35(s,1H),8.31–8.24(m,2H),7.81–7.73(m,1H),7.42–7.26(m,2H),6.63(d,J＝2.4Hz,1H),3.79(s,2H)。
实施例39：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(3-氰基-4-氟苯基)乙酰胺(39)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为5-氨基-2-氟苯腈制备而成。
白色固体；收率：81％；m.p.238.6-239.7℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.62(br,1H),8.78(d,J＝2.4Hz,1H),8.37(s,1H),8.33–8.27(m,2H),8.12(dd,J＝5.6,2.4Hz,1H),7.88–7.82(m,1H),7.50(t,J＝8.8Hz,1H),6.65(d,J＝2.4Hz,1H),3.82(s,2H)。
实施例40：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(6-氟吡啶-3-基)乙酰胺(40)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为2-氟-5-氨基吡啶制备而成。
淡黄色固体；收率：78％；m.p.232.8-233.9℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.54(br,1H),8.78(d,J＝2.4Hz,1H),8.44–8.36(m,2H),8.34–8.27(m,2H),8.19–8.13(m,1H),7.16(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H),6.65(d,J＝2.4Hz,1H),3.83(s,2H)。
实施例41：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基-1H-吡唑-3-基)-N-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺(41)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为2-氨基-5-氟吡啶制备而成。
白色固体；收率：72％；m.p.205.1-205.9℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.86(br,1H),8.77(d,J＝2.4Hz,1H),8.38–8.26(m,4H),8.10(dd,J＝9.2,4.0Hz,1H),7.73(td,J＝8.8,3.2Hz,1H),6.64(d,J＝2.4Hz,1H),3.89(s,2H)。
实施例42：2-(1-(4-氰基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(吡啶-4-基)乙酰胺(42)的合成
利用实施例33所述的方法，将4-氟苯胺替换为4-氨基吡啶制备而成。
淡黄色固体；收率：83％；m.p.232.8-233.3℃；1H NMR(400MHz,DMSO–d6)δ10.62(br,1H),8.78(d,J＝2.6Hz,1H),8.43(d,J＝6.0Hz,2H),8.38–8.36(m,1H),8.33–8.27(m,2H),7.59–7.55(m,2H),6.65(d,J＝2.6Hz,1H),3.85(s,2H)。
实施例43：N-(4-氟苯基)-2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酰胺(43)的合成
a)中间体1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸
利用实施例1(a-b)所述的方法，将起始原料4-溴-2-三氟甲基苯腈替换为5-溴-2-硝基三氟甲苯制备而成。
b)中间体(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲醇
利用实施例2(a)所述的方法，由中间体1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸制备而成。
c)中间体2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙-1-醇
利用实施例19(a-d)所述的方法，由中间体(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)甲醇制备而成。
d)中间体2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸
利用实施例33(a)所述的方法，由中间体2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙-1-醇制备而成。
e)N-(4-氟苯基)-2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酰胺(43)
利用实施例33(b)所述的方法，由中间体2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸和4-氟苯胺经缩合反应制备而成。
淡黄色固体；收率：84％；m.p.196.9-198.4℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ10.30(br,1H),8.78(d,J＝2.5Hz,1H),8.38(s,1H),8.35–8.33(m,2H),7.62(dd,J＝9.0,5.5Hz,2H),7.15(t,J＝9.0Hz,2H),6.65(d,J＝2.5Hz,1H),3.79(s,2H)。
实施例44：N-(6-氟吡啶-3-基)-2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酰胺(44)的合成
利用实施例33(b)所述的方法，由中间体2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸和2-氟-5-氨基吡啶经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：80％；m.p.199.8-201.2℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ10.56(br,1H),8.79(d,J＝2.5Hz,1H),8.44–8.42(m,1H),8.38(s,1H),8.36–8.33(m,2H),8.19–8.14(m,1H),7.17(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H),6.66(d,J＝2.5Hz,1H),3.84(s,2H)。
实施例45：N-(5-氟吡啶-2-基)-2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酰胺(45)的合成
利用实施例33(b)所述的方法，由中间体2-(1-(4-硝基-3-三氟甲基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸和2-氨基-5-氟吡啶经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：84％；m.p.181.5-182.4℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ10.88(br,1H),8.77(d,J＝2.5Hz,1H),8.37(s,1H),8.36–8.32(m,3H),8.11(dd,J＝9.0,4.0Hz,1H),7.77–7.71(m,1H),6.65(d,J＝2.5Hz,1H),3.89(s,2H)。
实施例46：2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺(46)的合成
a)中间体1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸
利用实施例1(a-b)所述的方法，将起始原料4-溴-2-三氟甲基苯腈替换为4-溴-2-氯苯腈制备而成。
b)中间体2-氯-4-(3-羟基甲基-1H-吡唑-1-基)苯腈
利用实施例2(a)所述的方法，由中间体1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸制备而成。
c)中间体2-氯-4-(3-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-1-基)苯腈
利用实施例19(a-d)所述的方法，由中间体2-氯-4-(3-羟基甲基-1H-吡唑-1-基)苯腈制备而成。
d)中间体2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸
利用实施例33(a)所述的方法，由中间体2-氯-4-(3-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-1-基)苯腈制备而成。
e)2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺(46)
利用实施例33(b)所述的方法，由中间体2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸和4-氟苯胺经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：90％；m.p.191.3-193.0℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ10.28(br,1H),8.66(d,J＝3.0Hz,1H),8.21(d,J＝2.0Hz,1H),8.09(d,J＝8.5Hz,1H),8.00(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),7.62(dd,J＝9.0,5.0Hz,2H),7.14(t,J＝9.0Hz,2H),6.61(d,J＝3.0Hz,1H),3.76(s,2H)。
实施例47：2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(6-氟吡啶-3-基)乙酰胺(47)的合成
利用实施例33(b)所述的方法，由中间体2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸和2-氟-5-氨基吡啶经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：86％；m.p.238.2-239.1℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ10.53(br,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.44–8.41(m,1H),8.21(d,J＝2.5Hz,1H),8.18–8.14(m,1H),8.09(d,J＝9.0Hz,1H),8.00(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),7.16(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H),6.62(d,J＝2.5Hz,1H),3.81(s,2H)。
实施例48：2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)-N-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺(48)的合成
利用实施例33(b)所述的方法，由中间体2-(1-(3-氯-4-氰基苯基)-1H-吡唑-3-基)乙酸和2-氨基-5-氟吡啶经缩合反应制备而成。
白色固体；收率：84％；m.p.212.6-213.6℃；1H NMR(500MHz,DMSO–d6)δ10.86(br,1H),8.66(d,J＝2.5Hz,1H),8.34(d,J＝3.0Hz,1H),8.21(d,J＝2.5Hz,1H),8.13–8.07(m,2H),7.99(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),7.74(td,J＝8.5,3.0Hz,1H),6.61(d,J＝2.5Hz,1H),3.87(s,2H)。
生物学试验例1：雄激素受体拮抗能力评价试验
检测原理：雄激素受体(AR)作为转录因子，需要与特定的序列结合才能发挥其转录活性。在本发明检测方法中，在雄激素受体依赖的前列腺癌细胞(LNCaP)中导入ARR2PB启动子控制的报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)，使得LNCaP细胞表达雄激素受体调控的EGFP前列腺癌细胞系(LNCaP-ARR2PB-EGFP)。经不同浓度梯度测试化合物处理后，检测LNCaP-ARR2PB-EGFP细胞中EGFP的表达量的高低，即可测得化合物对雄激素受体拮抗能力的强弱。
检测步骤：将LNCaP-ARR2PB-eGFP细胞在不含雄激素的完全培养基中饥饿处理3-5天，检测背景荧光值，待其降低至较低水平后，以3.5×104细胞/孔的密度接种到96孔板中，将培养板置于5％CO2培养箱中37℃培养24小时。等细胞稳定贴壁后，加入5nM DHT和不同浓度的待测化合物(50、16.667、5.556、1.852、0.617、0.206、0.069及0.023μM)，设置3个复孔，继续置于培养箱中孵育72小时。使用多功能酶标仪(Synergy H1，BioTek)在波长485nm激发光下检测530nm波长附近荧光强度值，计算待测化合物在细胞水平的AR拮抗活性。
检测结果：如表1所示，IC50值小于0.2μM的化合物有33，34，35，38，40，47和48。由于以上这些化合物都表现出良好的雄激素受体拮抗活性，这些活性化合物进一步做前列腺癌细胞的增殖抑制活性的检测。
表1化合物对LNCaP细胞转录水平的抑制活性
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生物学试验例2：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测化合物多种前列腺癌细胞系的增殖抑制活性。
检测原理：本试验的基本原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，沉积于细胞中，而死细胞则无此功能，加入缓冲液溶解细胞中形成的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可定量反映活细胞数量。
检测步骤：选择对数期生长的细胞，以每孔3～8×103个细胞接种至96孔板中，将培养板置于5％CO2培养箱中37℃处理24小时。加入含有不同浓度待测化合物的培养基，继续培养72小时。然后，每孔加入10μL 5mg/mL MTT溶液，继续孵育3-5小时，随后加入100μLSDS-HCl-PBS三联缓冲液，37℃过夜孵育，使用酶标仪在570nm处检测吸光度值。
检测结果：如图1所示，化合物33，40，47和恩杂鲁胺均能剂量依赖性地抑制雄激素受体依赖的LNCaP细胞。化合物33，40，47在表达雄激素受体剪接体的22Rv1细胞中也表现出显著的抑制增殖的活性，而恩杂鲁胺对22Rv1几乎没有抑制效果(图2)。在雄激素受体非依赖性的脑转移前列腺癌细胞(DU145)中，化合物33，40，47表现出明显的抑制活性，在骨转移前列腺癌细胞(PC3)中，化合物33，40，47表现出较弱的抑制增殖活性，而恩杂鲁胺只有在高浓度下才有一点抑制作用(图3和图4)。
生物学试验例3：MTT法检测化合物的安全性
检测原理：为了进一步阐明化合物的抑制活性并非由化合物毒性所致，本发明采用两种常用的正常细胞，包括人胃黏膜上皮细胞(GES-1)人张氏肝细胞(Chang)进行毒性检测，以确定其安全性。
检测步骤：用完全培养基以5×103个/孔密度的GES-1和Chang细胞接种在96孔板中。细胞贴壁后，37℃孵育24小时，随后采用不同浓度的化合物处理细胞，继续孵育72小时。之后，每孔加入10μL 5mg/ml MTT，孵育4小时。然后每孔加入100μL SDS-HCl-PBS三联缓冲液，37℃孵育过夜。最后，在酶标仪下检测570nm处各孔吸光度值，换算为存活率。
实验结果：如图5-6所示，化合物33，40，47对GES-1和Chang细胞的毒性都很小。
生物学试验例4：检测前列腺特异性抗原(PSA)的表达
检测原理：PSA是临床检测前列腺癌的关键指标之一，其表达与雄激素受体的转录水平呈正相关。
检测步骤：LNCaP-ARR2PB-eGFP细胞检测完成后，提取样品的上清液，使用2000XPi免疫分析系统测定PSA水平。
检测结果：如图7所示，化合物33，40，47都能以剂量依赖的方式抑制PSA在蛋白水平的表达。其中，化合物47表现相对最好，抑制活性约为恩杂鲁胺的一半。
以上结果说明本发明的化合物具有良好的雄激素受体拮抗活性，并且具有较高的安全性。

Claims (10)

1.一种苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述苯基吡唑类化合物的结构如式(I)所示：
其中：
R1选自氢、卤素、氰基或硝基；
R2选自氢、三氟甲基、卤素、氰基、硝基、C1-6烷基或卤素取代的C1-6烷基；
R3选自氢、卤素、C1-6烷基、卤素取代的C1-6烷基或芳基；
环A选自C5-12碳环、杂环、芳环、芳杂环、苯并杂环，其中环上的碳原子可被一个或多个杂原子取代；
R4和R5分别独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的C1-6烷基、羟基取代的C1-6烷基、氰基、硝基、酰胺基、酯基、芳环、芳杂环；
n为0，1，2或3；
X选自–NHC(O)–、–NHS(O)2–、–NHC(O)NH–、–C(O)NH–。
2.根据权利要求1所述的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的环A具有如下所示的结构：
其中，表示取代位置。
3.根据权利要求1所述的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的药学上可接受的盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或富马酸盐。
4.根据权利要求1所述的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R1为氰基；
R2为三氟甲基或氯；
R3为氢；
n为1；
X为–C(O)NH–；
环A为吡啶环或者苯环；
R4和R5分别独立地选自氢、F、氰基或硝基。
5.根据权利要求1所述的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的苯基吡唑类化合物为以下化合物中的一种：
6.如权利要求1-5任一项所述的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐在制备雄激素受体拮抗剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述雄激素受体包括雄激素受体的突变体。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化合物用于制备治疗前列腺癌、前列腺增生、多毛症、脱发、乳腺癌、男性性功能障碍或艾滋病的药物。
9.如权利要求1-5任一项所述的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐在制备前列腺癌治疗药物中的应用。
10.如权利要求1-5任一项所述的苯基吡唑类化合物或其药学上可接受的盐在制备转移性前列腺癌治疗药物中的应用。
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