CN116549650A - 一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，所述组合物的活性成分包括抗炎成分和源自动物奶的外泌体。该组合物通过外泌体和抗炎成分的共同作用提升整体疗效，通过工程化手法利用外泌体独特的囊泡结构对PDA产生黏附和包裹，延缓有效活性成分释放，提高组合物的持效性和整体疗效。

Description

一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及源自奶中的外泌体技术领域，A61K35/20，尤其涉及一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物及其制备方法。
背景技术
外泌体是一类由细胞分泌到胞外的囊泡，其组成包括脂质、蛋白质、RNA、DNA等物质，还包括广泛的信号传导因子，可作为胞间信号传导介质调控细胞行为如：靶细胞的激活、生长、迁移、分化、凋亡、坏死等。研究发现外泌体可存在于血液、尿液、唾液、母乳、胸腔积液等体液中，不同细胞生产的外泌体表现出各自的特异性；受婴儿可以用牛奶缓解皮肤炎症的经验启发，对奶或初乳中的外泌体进行了研究，并进行了抗氧化工程化改造，并发现其对皮肤伤口表现出了一定的愈合和修复能力。
但是，目前外泌体的提取中还存在很多问题，如：(1)损坏外泌体的完整性，导致外泌体中生物活性物质的损失或破坏；(2)和外泌体存在相似参数的其他囊泡影响外泌体的提取纯度等。另外，当外泌体用作伤口治疗时，其活性物质在体内的半衰期短，在皮肤伤口处容易被清除或降解而失效，由此降低了其效能的发挥。
中国专利CN114790439A公开了牛奶外泌体及其制备方法，技术中通过使用不同质量浓度的柠檬酸钠控制外泌体提取环境的酸碱度，提高外泌体和蛋白的分离度，但是这种酸碱环境的增加可能会破坏外泌体的结构完整性，导致活性成分的流失。中国专利CN115361879A公开了一种牛奶外泌体产品和方法、营养组合物和治疗方法，通过梯度离心分离出外泌体和与其尺寸具有重叠的酪蛋白，但是该外泌体是以粉末状施用于受试者，使用灵活性低，并且作用过程中其活性物质可能会在人体胃部或肠道内被降解而失活，导致药效降低。
基于以上因素，如何提高外泌体对皮肤伤口处的治疗效果，促进伤口的快速愈合，并提高外泌体的使用灵活性，是本申请所研究的主要方面。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，所述组合物的活性成分包括抗炎成分和源自动物奶的外泌体；所述外泌体有助于伤口修复和血管新生。
进一步地，所述动物奶为商业奶、初乳、原料奶中的至少一种。
进一步地，所述动物奶包括但不限于山羊奶、绵羊奶、牛奶、骆驼奶、驴奶、鹿奶中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述动物奶为山羊奶、牛奶或骆驼奶中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述动物奶为牛奶。
在一种实施方式中，组合物的活性成分来源于非变性或巴氏杀菌牛奶。
进一步地，本申请不对所述牛奶的来源做严格限定，可选择的有水牛奶、牦牛奶、普通牛奶、野牛奶、黄牛奶等。
进一步地，本申请提供了所述外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将乳源在10000-30000g转速下离心15-40分钟，收集上清液A；
(2)将上清液A以80000-130000g转速离心40-80分钟，收集上清液B；
(3)将上清液B以140000-160000g转速离心80-150分钟，收集沉淀；
(4)使用0.1-0.37μm的微滤膜对沉淀过滤除菌，即可得外泌体。
优选地，所述步骤(1)转速为11000-15000g，更优选为12000-14000g；离心时间为25-35分钟；除去脂肪、细胞和细胞碎片。
外泌体体积小、密度低、粒径分布范围窄，一般的分离过程控制离心转速和时间就可使样品中的脂肪、细胞等杂质和外泌体分离，但是样品中总是存在一些与外泌体具有相似参数的其他囊泡，影响外泌体的有效提取和纯度，因此，需要严格控制提取工艺参数，实现外泌体的快速高效提取，并使提取的外泌体具有纯度高、粒径均一、特异性治疗效果好的特点。
优选地，所述步骤(2)转速为90000-110000g，离心时间为50-70分钟；除去大颗粒和参数相近的部分微囊泡。
优选地，所述步骤(3)的转速为140000-150000g，离心时间为100-130分钟，将外泌体沉淀并进一步都其与其他微囊泡分离。
优选地，所述步骤(4)的微滤膜孔径为0.2-0.25μm。
优选地，所述步骤(1)-(3)的操作环境为2-8℃，优选为4-6℃。
进一步地，所述抗炎成分可选择的有维生素C、维生素E、聚多巴胺、抗炎药物、对羟基苯甲酸、丹参素等中的至少一种。在一种实施方式中，抗炎成分为聚多巴胺(PDA)。
进一步地，所述聚多巴胺的合成方法为：将3-羟酪胺盐酸盐与氢氧化钠溶液在室温下混合搅拌反应3-10小时，之后对液体离心，收集沉淀，即为PDA。使用时将PDA溶于超纯水制成PDA的溶液。
进一步地，所述3-羟酪胺盐酸盐与氢氧化钠的摩尔比为(0.005-0.5)：1，优选为(0.008-0.05)：1。
进一步地，组合物活性成分的组合方式为物理混合、化学交联、分层包覆中的至少一种。
优选地，组合物活性成分的组合方式为分层包覆。
在一种实施方案中，组合物的活性成分为动物奶外泌体包覆的聚多巴胺(缩写为：PDA@MEs)。
进一步地，所述组合物活性成分的制备方法为：将源自动物奶的外泌体溶液和聚多巴胺溶液按照一定的体积比分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间设置0.1-0.3μm的聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出进行分层包覆结合，得到动物奶外泌体包覆的聚多巴胺。
进一步地，所述动物奶外泌体溶液的质量浓度为0.5-3mg/mL，聚多巴胺溶液的质量浓度为0.5-5mg/mL，动物奶外泌体溶液和聚多巴胺溶液的体积比为(1-4)：1。
配制动物奶外泌体溶液或聚多巴胺溶液所用的溶剂可以为超纯水或PBS缓冲液。
本申请中PDA具有一定的抗炎能力可与外泌体共同作用促进皮肤新生和伤口愈合，在此基础上，利用外泌体独特的囊泡结构对PDA产生包裹，通过延缓PDA的释放，提高组合物的持效性。值得注意的是，本申请中需要控制两者的相对含量保持在特定的范围内，以保证在PDA更够短时间释放、快速抗炎修复伤处的同时，还能够达到良好的缓释效果，保证以上两方面的平衡。外泌体的免疫排斥作用非常小，含量增加时可以明显提升治疗效果，但是基于成本的考量，其浓度在0.5-3mg/mL的范围内更加合适；PDA含量增加时，组合物抗炎效果提高，但是过量则不利于组合物的快速治疗；此外，PDA还会与生物交联剂产生分子间作用，参与凝胶体系的构成并维持凝胶体系的流动性；因此，PDA的浓度也需要被综合控制。
优选地，所述动物奶外泌体溶液的质量浓度为0.5-2mg/mL，聚多巴胺溶液的质量浓度为0.5-3mg/mL，动物奶外泌体溶液和聚多巴胺溶液的体积比为(1-3)：1。
在一种优选的实施方式中，所述动物奶外泌体溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL，PDA溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL，动物奶外泌体溶液和聚多巴胺溶液的体积比为(1.5-3)：1。
进一步地，所述活性成分可制成粉状，也可呈液体。
进一步地，所述组合物还包括生物交联剂，所述生物交联剂为水凝胶，所述活性成分与水凝胶的体积比为1：1-6；生物交联剂对组合物的活性成分形成再次包裹，通过交联控制体系状态，提高组合物的使用灵活性、稳定性，并进一步促进活性物质的作用持续性。
进一步地，所述活性成分与水凝胶的体积比为1：2-5。
进一步地，所述水凝胶由羧甲基纤维素、羧甲基纤维素盐、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、葡聚糖、氧化葡聚糖、透明质酸、透明质酸盐、果胶、壳聚糖、羧甲基壳聚糖及以上物质衍生物中的至少一种制备而成。
在具体实施方式中，如果以上用于制备水凝胶的物质单独不能成胶，则可额外配合成胶物质来形成水凝胶，比如，海藻酸盐需要搭配含有金属离子的金属盐(例如海藻酸钠溶液中加入葡萄糖酸钙溶液才能成胶)。
优选地，所述生物交联剂为羧甲基壳聚糖和氧化葡聚糖。
优选地，所述生物交联剂由体积比为1：1-5的羧甲基壳聚糖溶液和氧化葡聚糖溶液混合获得，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为0.5-5wt％，所述氧化葡聚糖溶液的浓度为1-10wt％。
优选地，所述生物交联剂由体积比为1：2-4的羧甲基壳聚糖溶液和氧化葡聚糖溶液混合获得，所述羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1-3wt％，所述氧化葡聚糖溶液的浓度为2-8wt％。
本申请组合物的内部注射和外部涂覆两种使用方式对其物性存在一定的矛盾：内部注射要求具有较好的流动性，保证推挤注射的顺利进行，而外部涂覆则要求具有较好的伤口覆盖和皮肤表面驻留效果；两个使用方式对组合物的流动状态即粘度要求存在很大的差别。羧甲基壳聚糖和氧化葡聚糖两者分子中含有大量的极性基团如：羧基、羟基、醚键或氨基等，其组合能够产生最佳的生物相容性和交联状态；为了解决以上所述的矛盾，本申请优化使用羧甲基壳聚糖和氧化葡聚糖两种生物交联剂，在特定的浓度范围内使两者与PDA产生特殊的分子交联作用，对PDA@MEs起到进一步的保护和包封性能，避免有效活性物质被分解失效，并使组合物具有合适的流动性能，优异的粘附性、缓释性和透皮性能，使其适用于内部注射和外部涂覆两种使用方法。但是羧甲基壳聚糖、氧化葡聚糖和PDA的含量过多过少时，均会打乱体系特定的交联状态从而导致不合适的流动态，甚至影响外泌体对PDA的包封作用。
进一步地，本申请还提供了所述组合物的制备方法，具体为：将组合物的活性成分、生物交联剂混合后充分搅拌即可。
进一步地，本申请所述组合物用于治疗和修复皮肤伤口，本申请对所述的组合物存在形式不做严格规定，可为溶剂型、粉状、凝胶型、膏状中的任意一种；根据实际需要对其再次处理。
进一步地，本申请组合物的施药方式包括涂覆或注射中的任意一种。
有益效果
1、本申请利用牛奶外泌体的修复性能和抗炎成分的抗炎性能，通过工程化手法利用外泌体独特的囊泡结构对PDA产生黏附和包裹，改善组合物在病理环境中的驻留效果并延缓了彼此的释放，提高组合物的持效性和整体疗效；
2、本申请生物交联剂的加入进一步为皮肤疾病的治疗提供了良好的黏附、缓释、透皮性能，并且通过材料整体含量的调控，使凝胶态的组合物不仅可用于伤口涂覆，还可用于注射治疗，提高了使用灵活性；
3、本申请的组合物生物相容性好，具有优异的自愈合和自修复效果，可通过多种方式用于皮肤伤口修复。
说明书附图
图1：透射电镜TEM图；左图对应MEs，中间为PDA，右图为PDA@MEs；
图2：不同组别的细胞迁移实验及结晶紫染色结果。
图3：不同组别的细胞体外成血管实验结果。
图4：体内动物实验中，不同组别的小鼠伤口恢复情况；上部分为伤口面积及模拟图、左下为伤口面积愈合百分比数据条形图、右下为伤口愈合率百分比数据图；
图5：体内动物实验中，不同组别的小鼠体内炎症水平；左图为TNF-α炎症相关因子含量随治疗时间的变化，右图为IL-1β炎症相关因子含量随治疗时间的变化；
图6：实施例1生物活性组合物的成胶效果图片；
图7：实施例1生物活性组合物的自愈合效果图片；
图8：实施例1生物活性组合物的可注射效果图片。
具体实施方式
实施例
实施例1
本实施例提供了一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，成分包括：牛奶外泌体包覆的聚多巴胺(PDA@MEs)。
组合物的制备方法包括：
(1)牛奶外泌体(MEs)的制备：将巴氏杀菌牛奶在4℃下以13000g离心30分钟，收集上清液A；上清液A在4℃下以100000g离心60分钟，收集上清液B；上清液B在4℃以145000g离心120分钟，收集沉淀即为外泌体，并用0.22μm的微滤膜过滤除菌；
(2)聚多巴胺(PDA)的合成：将10mM 3-羟酪胺盐酸盐与1M氢氧化钠溶液在室温下以350rmp转速混合搅拌5小时，反应后在10000rpm下离心20分钟，去上清液，收集沉淀；
(3)PDA@MEs的制备：将MEs溶于超纯水中形成1mg/mL的MEs溶液，再用超纯水制备1mg/mL的PDA溶液，将MEs溶液和PDA溶按照2：1的体积比分别装入小型脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间为0.2μm聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出结合为PDA@MEs。
从图1可以看出，牛奶外泌体(MEs)与聚多巴胺(PDA)成功结合，复合颗粒呈现外表包覆膜结构的球状。
实施例2
本实施例提供了一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，所述组合物呈凝胶状，成分包括：牛奶外泌体包覆的聚多巴胺(PDA@MEs)和水凝胶，PDA@MEs与水凝胶的体积比为1：4。
组合物的制备方法包括：
(1)牛奶外泌体(MEs)的制备：将巴氏杀菌牛奶在4℃下以13000g离心30分钟，收集上清液A；上清液A在4℃下以100000g离心60分钟，收集上清液B；上清液B在4℃以145000g离心120分钟，收集沉淀即为外泌体，并用0.22μm的微滤膜过滤除菌；
(2)聚多巴胺(PDA)的合成：将10mM 3-羟酪胺盐酸盐与1M氢氧化钠溶液在室温下以350rmp转速混合搅拌5小时，反应后在10000rpm下离心20分钟，去上清液，收集沉淀；
(3)PDA@MEs的制备：将MEs溶于超纯水中形成1mg/mL的MEs溶液，再用超纯水制备1mg/mL的PDA溶液，将MEs溶液和PDA溶按照2：1的体积比分别装入小型脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间为0.2μm聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出结合为PDA@MEs；
(4)凝胶状组合物的制备：将PDA@MEs与水凝胶(体积比1：3的1.67wt％的羧甲基壳聚糖溶液和5wt％的氧化葡聚糖溶液)按照1:4的体积比混合后充分搅拌即可。
实施例3
本实施例提供了一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，所述组合物呈凝胶状，成分包括：牛奶外泌体包覆的聚多巴胺(PDA@MEs)和水凝胶，PDA@MEs与水凝胶的体积比为1：2。
组合物的制备方法包括：
(1)牛奶外泌体(MEs)的制备：将巴氏杀菌牛奶在2℃下以10000g离心40分钟，收集上清液A；上清液A在2℃下以110000g离心50分钟，收集上清液B；上清液B在2℃以140000g离心130分钟，收集沉淀即为外泌体，并用0.25μm的微滤膜过滤除菌；
(2)聚多巴胺(PDA)的合成：将50mM 3-羟酪胺盐酸盐与1M氢氧化钠溶液在室温下以200rmp转速混合搅拌10小时，反应后在8000rpm下离心40分钟，去上清液，收集沉淀；
(3)PDA@MEs的制备：将MEs溶于PBS缓冲液中形成0.5mg/mL的MEs溶液，再用超纯水制备0.5mg/mL的PDA溶液，将MEs溶液和PDA溶按照3：1的体积比分别装入小型脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间为0.2μm聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出结合为PDA@MEs；
(4)凝胶状组合物的制备：将PDA@MEs与水凝胶(体积比1：5的1.5wt％的羧甲基壳聚糖溶液和8wt％的氧化葡聚糖溶液)按照1:2的体积比混合后充分搅拌即可。
实施例4
本实施例提供了一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，所述组合物呈凝胶状，成分包括：聚多巴胺包覆的牛奶外泌体(PDA@MEs)和水凝胶，PDA@MEs与水凝胶的体积比为1：5。
组合物的制备方法包括：
(1)牛奶外泌体(MEs)的制备：将非变性牛奶在8℃下以15000g离心15分钟，收集上清液A；上清液A在8℃下以90000g离心70分钟，收集上清液B；上清液B在8℃以150000g离心100分钟，收集沉淀即为外泌体，并用0.2μm的微滤膜过滤除菌；
(2)聚多巴胺(PDA)的合成：将8mM 3-羟酪胺盐酸盐与1M氢氧化钠溶液在室温下以700rmp转速混合搅拌3小时，反应后在12000rpm下离心10分钟，去上清液，收集沉淀；
(3)PDA@MEs的制备：将MEs溶于PBS缓冲液中形成2mg/mL的MEs溶液，再用超纯水制备3mg/mL的PDA溶液，将MEs溶液和PDA溶按照1：1的体积比分别装入小型脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间为0.2μm聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出结合为PDA@MEs；
(4)凝胶状组合物的制备：将PDA@MEs与水凝胶(体积比1：2的1wt％的羧甲基壳聚糖溶液和2wt％的氧化葡聚糖溶液)按照1:5的体积比混合后充分搅拌即可。
实施例5
本实施例提供了一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，所述组合物呈凝胶状，成分包括：聚多巴胺包覆的牛奶外泌体(PDA@MEs)和水凝胶，PDA@MEs与水凝胶的体积比为1:6。
组合物的制备方法包括：
(1)牛奶外泌体(MEs)的制备：将巴氏杀菌牛奶在6℃下以30000g离心15分钟，收集上清液A；上清液A在6℃下以130000g离心40分钟，收集上清液B；上清液B在6℃以160000g离心80分钟，收集沉淀即为外泌体，并用0.1μm的微滤膜过滤除菌；
(2)聚多巴胺(PDA)的合成：将200mM 3-羟酪胺盐酸盐与1M氢氧化钠溶液在室温下以500rmp转速混合搅拌6小时，反应后在10000rpm下离心20分钟，去上清液，收集沉淀；
(3)PDA@MEs的制备：将MEs溶于超纯水中形成3mg/mL的MEs溶液，再用超纯水制备4mg/mL的PDA溶液，将MEs溶液和PDA溶按照4：1的体积比分别装入小型脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间为0.2μm聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出结合为PDA@MEs；
(4)凝胶状组合物的制备：将PDA@MEs与水凝胶(体积比1：3的2wt％的羧甲基壳聚糖溶液和6wt％的氧化葡聚糖溶液)按照1:6的体积比混合后充分搅拌即可。
对比例1
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于，本对比例将实施例2中的牛奶外泌体包覆的聚多巴胺(PDA@MEs)替换为单纯的牛奶外泌体(MEs)，即本对比例组合物中的组分包括牛奶外泌体和水凝胶。
制备方法为：将牛奶外泌体与水凝胶(体积比1：3的1.67wt％的羧甲基壳聚糖溶液和5wt％的氧化葡聚糖溶液)按照1:4的体积比混合后充分搅拌即可。
对比例2
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于，本对比例将实施例2中的牛奶外泌体包覆的聚多巴胺(PDA@MEs)替换为单纯的聚多巴胺(PDA)，即本对比例组合物中的组分包括聚多巴胺和水凝胶。
制备方法为：将聚多巴胺与水凝胶(体积比1：3的1.67wt％的羧甲基壳聚糖溶液和5wt％的氧化葡聚糖溶液)按照1:4的体积比混合后充分搅拌即可。
对比例3
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于，本对比例的组合物产品单独为实施例2中的水凝胶。
制备方法为：将体积比1：3的1.67wt％的羧甲基壳聚糖溶液和5wt％的氧化葡聚糖溶液混合后充分搅拌即可。
性能测试方法：
一、体外细胞实验
说明：分为对照组、脂多糖刺激阳性组、治疗组A1、治疗组A2、治疗组D1、治疗组D2共六组进行对照实验；其中对照组仅用磷酸盐缓冲液PBS处理，治疗组A1、A2、D1、D2均为脂多糖刺激后再加入相应的治疗成分。治疗组A1的治疗成分采用实施例1的组合物，治疗组A2的治疗成分采用实施例2的组合物，治疗组D1的治疗成分采用对比例1的组合物，治疗组D2的治疗成分采用对比例2的组合物。
(1)细胞迁移实验：目的是观察治疗成分(即对应组合物)对细胞迁移的恢复作用；测试结果见图2。
由图2可以得出：对照组可见视野内细胞迁移数量最多，为正常状态。脂多糖刺激阳性组导致细胞处于炎性环境，可见其细胞迁移数量骤减，为阳性对照的异常状态。治疗组A1及治疗组A2导致的细胞迁移数量最多，其中治疗组A2表现最佳，几乎能够恢复至对照组的正常状态。而采用单一活性成分的治疗组D1和治疗组D2均无法实现与复合活性成分(即A1和A2)同样的治疗效果；由此可见本申请的组合物有助于促进细胞迁移与正常增殖。
(2)细胞体外成血管实验：目的为观察治疗成分(即对应组合物)对细胞成管的恢复作用；测试结果见图3。
由图3可以得出：对照组仅用磷酸盐缓冲液PBS处理，可见其能够形成网络状交联细胞结构，且结构清晰，细胞状态明亮饱满，为正常状态。脂多糖刺激阳性组导致细胞处于炎性环境，可见其网络交联结构断裂，细胞为单簇状态且有贴壁不良状态，为阳性对照的异常状态。治疗组A1和治疗组A2导致的细胞成管数量结构最为清晰，细胞状态最佳，其中治疗组A2几乎能够恢复至对照组正常状态。而治疗组D1和治疗组D2均无法实现较好的治疗效果，由此可见本申请的组合物有良好的持效性和缓释作用，成血管效果更佳，有利于伤口血供恢复。
二、体内动物实验
说明：分为皮损造模模型组、治疗组A1、治疗组A2、治疗组D1、治疗组D2、治疗组D3共六组进行对照实验；其中治疗组A1的治疗成分采用实施例1的组合物，治疗组A2的治疗成分采用实施例2的组合物，治疗组D1的治疗成分采用对比例1的组合物，治疗组D2的治疗成分采用对比例2的组合物，治疗组D3的治疗成分采用对比例3的组合物。
制备小鼠皮损模型，在不同组给药治疗后第5、10、15天记录伤口恢复情况(结果见图4)，并在治疗第5、10、15天后提取小鼠外周血上清液，利用ELISA试剂盒检测炎症因子表达水平(结果见图5)。
根据伤口面积及模拟图(图4上)可看出：治疗组D1、治疗组A1、治疗组A2在治疗后第十五天伤口(即红色区域)面积最小，表明实施例1、实施例2和对比例1的组合物具有良好的伤口修复能力，与模型组对比可见其疗效明显；此三组中均有牛奶外泌体成分，表明了牛奶外泌体在促进伤口修复中的重要作用。
根据伤口面积愈合百分比数据条形图(左下)以及伤口愈合率百分比数据图(右下)对比得出：在伤口修复最有效的三组中，治疗组A1和A2均具有相对较优的治疗效果，说明实施例1和实施例2的组合物具有较好的伤口治疗效果，其中，治疗组A2的伤口面积最小、愈合率曲线最快，充分证明本申请实施例2的组合物在所有组别中最佳的伤口治疗效果。
TNF-α与IL-1β均为炎症相关因子，代表了模型小鼠体内的炎症水平及不同组的抗炎疗效。由图5可证明：两类炎症因子水平根据治疗时间的延长均有所降低，治疗组D1、治疗组A1和治疗组A2的降低效果相对较好，但其中治疗组A2的降低速率最快、炎症因子水平最低，几乎与正常小鼠相当，由此可见本申请的组合物具有良好的体内抗炎疗效。
三、成胶效果
图6中的左图显示了实施例2中组合物PDA@MEs+GEL的未成胶状态(偏灰色透明，混合水溶液)，混合后约1-2min组合物即可成为凝胶状状态(图6右)，且粘性良好。
四、自愈合性能
将实施例2的组合物分为两部分，其中一部分利用罗丹明B进行荧光标记，随后将另一部分(空白、未标记荧光)和荧光标记的那部分进行贴合，观察状态(见图7)。结果表明：两部分互溶，界限模糊，结合成一体，说明组合物具有优异的自愈合性能。
五、可注射性能
利用罗丹明B对实施例2的组合物进行荧光标记，随后通过1mL注射器进行注射演示(见图8)。可观察到凝胶的成功注射及落地成胶。
总结：本申请的生物活性组合物在体外体内均能表现出良好的伤口修复能力，且与对照组和其他单一活性成分的组合物相比效果明显。其中修复性能得益于牛奶外泌体，抗炎性能得益于聚多巴胺，二者通过工程化手法结合形成分层包覆，通过两者的共同作用提升了整体疗效，生物交联剂的加入为皮肤疾病的治疗提供了良好的粘附、缓释、透皮性能，能够提升用药依从性，为患者带来福音；并且通过材料整体含量的调控，使凝胶态的组合物不仅可用于伤口涂覆，还可用于注射治疗，提高了使用灵活性。

Claims (10)

1.一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物，其特征在于，所述组合物的活性成分包括抗炎成分和源自动物奶的外泌体。
2.根据权利要求1所述的生物活性组合物，其特征在于，所述动物奶为牛奶、山羊奶、骆驼奶中的至少一种，优选为牛奶；所述抗炎成分包括维生素C、维生素E、聚多巴胺、抗炎药物、对羟基苯甲酸、丹参素中的至少一种，优选为聚多巴胺。
3.根据权利要求1所述的生物活性组合物，其特征在于，所述外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将乳源在10000-30000g转速下离心15-40分钟，收集上清液A；
(2)将上清液A以80000-130000g转速离心40-80分钟，收集上清液B；
(3)将上清液B以140000-160000g转速离心80-150分钟，收集沉淀；
(4)使用0.1-0.37μm的微滤膜对沉淀过滤除菌，即可得外泌体。
4.根据权利要求3所述的生物活性组合物，其特征在于，所述步骤(2)转速为90000-110000g，离心时间为50-70分钟；步骤(3)的转速为140000-150000g，离心时间为100-130分钟。
5.根据权利要求1所述的生物活性组合物，其特征在于，所述组合物的活性成分为动物奶外泌体包覆的聚多巴胺，制备方法为：将源自动物奶的外泌体溶液和聚多巴胺溶液按照一定的体积比分别装入脂质体挤出器的两端气密注射器内，中间设置0.1-0.3μm的聚碳酸酯膜，通过脂质体挤出器反复共挤出进行分层包覆结合，得到动物奶外泌体包覆的聚多巴胺。
6.根据权利要求5所述的生物活性组合物，其特征在于，所述动物奶外泌体溶液的质量浓度为0.5-3mg/mL，聚多巴胺溶液的质量浓度为0.5-5mg/mL，动物奶外泌体溶液和聚多巴胺溶液的体积比为(1-4)：1。
7.根据权利要求5所述的生物活性组合物，其特征在于，所述动物奶外泌体溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL，聚多巴胺溶液的质量浓度为0.8-1.5mg/mL，动物奶外泌体溶液和聚多巴胺溶液的体积比为(1.5-3)：1。
8.根据权利要求1所述的生物活性组合物，其特征在于，所述组合物还包括生物交联剂，所述生物交联剂为水凝胶，所述活性成分与水凝胶的体积比为1：1-6，优选体积比为1：2-5。
9.根据权利要求8所述的生物活性组合物，其特征在于，所述水凝胶由羧甲基纤维素、羧甲基纤维素盐、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、葡聚糖、氧化葡聚糖、透明质酸、透明质酸盐、果胶、壳聚糖、羧甲基壳聚糖及以上物质衍生物中的至少一种制备而成。
10.根据权利要求8所述的生物活性组合物的制备方法，其特征在于，具体为：将组合物的活性成分、生物交联剂混合后充分搅拌即可。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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