CN104906073A - 一种包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的制备方法，采用壳聚糖季铵盐和透明质酸钠为原料，通过离子交联、聚合物凝聚两步法合成目标产物，首先将壳聚糖季铵盐溶液与碱性成纤维细胞生长因子溶液混合，然后向混合溶液中滴加三聚磷酸钠溶液，得到离子交联的混合液，最后向离子交联后的混合液中滴入透明质酸钠进行聚合物凝聚得到包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶，产品的平均粒径在150—230nm；Zeta电位为-28.6—-36.7mV。可用于治疗口腔溃疡，具有良好的研究和开发利用前景。

Description

一种包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的制备方法

技术领域

本发明属于药剂学领域的一种纳米凝胶缓释微粒的制备技术，具体涉及一种包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的制备方法。

背景技术

口腔溃疡是一种生活常见病，多发于舌尖、舌腹、颊粘膜处，伴随间歇性、碰触式刺痛，严重影响病患的生活质量。目前对于口腔溃疡的治疗尚缺乏有效方法，传统的治疗方法着重于局部的止痛，而对于如何加快溃疡面的愈合重视程度不够。碱性成纤维细胞生长因子是一种多功能蛋白类生物活性物质，对创面和神经损伤均有较强的修复作用。利用碱性成纤维细胞生长因子治疗口腔溃疡已有报道。存在的突出问题是：1、碱性成纤维细胞生长因子在口腔环境中容易降解失活；2、随着人体唾液的分泌，碱性成纤维细胞生长因子在溃疡表面处会被迅速清除，限制了其治疗效果。因此，如何保留碱性成纤维细胞生长因子活性，延长碱性成纤维细胞生长因子在溃疡表面处的滞留时间是本发明所解决的关键问题。壳聚糖是一种天然阳离子聚多糖，具有资源量大、生物可降解、稳定性好、生物亲和性好、安全无毒性等优点,是开发生物医用材料的良好资源。壳聚糖季铵盐作为壳聚糖的水溶性衍生物，在保留壳聚糖分子良好生物相容性的同时，具有良好的抑菌性、成膜和成胶性，是理想的粘膜药物辅料。有报道指出壳聚糖季铵盐能够与口腔粘膜粘液层蛋白发生静电作用并形成氢键，表现出良好的粘膜粘附性。本发明采用两部法(离子交联——聚电解质凝聚)制备包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸复合纳米凝胶，旨在长时间维持碱性成纤维细胞生长因子在口腔溃疡部位的有效活性浓度，提高临床治疗效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶制备方法，以弥补现有技术的不足。

本发明采用两步法合成目标产物即包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。其具体步骤是：

步骤一：将壳聚糖季铵盐溶解于去离子水中，再将碱性成纤维细胞生长因子溶液加入该溶液中，搅拌30分钟，控制转速、壳聚糖季铵盐浓度。

步骤二(离子交联法)：将三聚磷酸钠溶液滴加入壳聚糖季铵盐/碱性成纤维细胞生长因子混合液中进行离子交联反应，控制壳聚糖季铵盐浓度、三聚磷酸钠浓度以及三聚磷酸钠的滴加速度；

步骤三(聚电解质凝聚法)：向步骤二中发生离子交联的壳聚糖季铵盐溶液中，加入透明质酸钠溶液，控制转速、透明质酸钠的浓度和滴加速度。调节溶液的酸碱度至pH 4.0–6.0，最后将其分离纯化，干燥得到包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。

本发明更具体的实施方案如下：

步骤一：将壳聚糖季铵盐溶解于去离子水中，壳聚糖季铵盐浓度为0.3-0.6％(w/v)；向壳聚糖季铵盐溶液中加入浓度为2-5mg/mL的碱性成纤维细胞生长因子溶液；

步骤二：将三聚磷酸钠溶液滴加入壳聚糖季铵盐溶液中进行离子交联反应，其中三聚磷酸钠与壳聚糖季铵盐游离氨基的摩尔比为0.1-0.3：1；滴加在20分钟内完成，室温下搅拌，搅拌速度是200转/分钟，反应时间是30分钟；

步骤三：将透明质酸钠溶解于去离子水中，溶液浓度分别控制在0.3％-0.5％(w/v)；将透明质酸钠溶液滴入第二步所得到的三聚磷酸钠——壳聚糖季铵盐混合溶液中，其添加量为透明质酸钠与壳聚糖的质量比为1-1.7:1，滴加在30分钟内完成，调节酸碱度至pH 4.0-6.0，室温下搅拌，搅拌速度为500转/分钟，反应时间为3小时；15000转/分钟离心1小时分离产物，干燥得到固体产品，即包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。

本发明进一步具体的实施方案如下：

一种包载碱性成纤维生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的制备方法，取壳聚糖季铵盐30-60mg，溶于10mL去离子水中，在搅拌条件下滴入10mL 2-5mg/mL碱性成纤维细胞生长因子溶液，1ml 0.2-0.5％(w/v)三聚磷酸钠溶液，20分钟滴完，室温下200转/分钟搅拌30分钟，在搅拌条件下滴加10mL含有0.3-0.5％(w/v)的透明质酸钠溶液,30分钟滴完，用氢氧化钠调节酸碱度至pH 4.0-6.0,室温下搅拌，200转/分搅拌5小时，15000转/分离心1-2小时，冷冻干燥得到固体产物。

所述透明质酸分子量范围10-50kDa。

本发明具有操作方便、制备技术工艺简便和制造成本低廉等优点。所形成的包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶呈规则球形。本发明的重要意义在于形成的核壳结构的载药纳米凝胶对碱性成纤维细胞生长因子的包载量高；具有良好的药物缓释作用和粘膜粘附性，在医药、医用材料以及口腔粘膜给药等许多方面具有良好的研究和开发应用前景，因此，该发明技术具有很好的经济开发潜力。本发明的包载碱性成纤维生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶产品的平均粒径在150—230nm；Zeta电位为-28.6—-36.7mV，包覆率60-75％。

以下结合附表、附图和实施例对本发明做出进一步说明。

附图说明

图1为包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶透射电镜照片。

具体实施方式

本发明采用壳聚糖季铵盐、透明质酸钠和三聚磷酸钠为原料，通过离子交联、聚合物凝聚法目标产物。具体实施方案为：

步骤一：将壳聚糖季铵盐溶解于去离子水中，壳聚糖季铵盐浓度为0.3％(w/v)；向壳聚糖季铵盐溶液中加入浓度为2mg/mL的碱性成纤维细胞生长因子溶液；

步骤二：将三聚磷酸钠溶液滴加入壳聚糖季铵盐溶液中进行离子交联反应，其中三聚磷酸钠与壳聚糖季铵盐游离氨基的摩尔为0.1-0.3：1；滴加在20分钟内完成，室温下搅拌，搅拌速度是200转/分钟，反应时间是30分钟；

步骤三：将透明质酸钠溶解于去离子水中，溶液浓度分别控制在0.3％-0.5％(w/v)；将透明质酸钠溶液滴入第一步所得到的三聚磷酸钠——壳聚糖季铵盐混合溶液中，其添加量为透明质酸钠与壳聚糖的质量比为1-1.7:1，滴加在30分钟内完成，调节酸碱度至pH 4.0-6.0，室温下搅拌，搅拌速度为500转/分钟，反应时间为3小时；15000转/分钟离心1小时分离产物，干燥得到固体产品，即包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。

本发明中的壳聚糖季铵盐的分子量范围40-150kDa,脱乙酰度大于90％，取代度大于40％；所指的透明质酸分子量范围10-50kDa。所得产物的透射电镜照片如图1所示。将产物进行粒径以及Zeta电位分析，结果表明所制备的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的粒径分布较窄，平均粒径在150—230nm(表1)；Zeta电位为-28.6—-36.7mV(表1)。

实施例1

取分子量为40kDa的壳聚糖季铵盐30mg，溶于10mL去离子水中，在搅拌条件下滴入10mL 2mg/mL碱性成纤维细胞生长因子溶液，1ml 0.2％(w/v)三聚磷酸钠溶液，20分钟滴完，室温下200转/分钟搅拌30分钟，在搅拌条件下滴加10mL含有0.3％(w/v)的透明质酸钠溶液,30分钟滴完，用氢氧化钠调节酸碱度至pH 4.0,室温下搅拌，200转/分搅拌5小时，15000转/分离心2小时，去除上清，冷冻干燥即得载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。

实施例2

取分子量为90kDa的壳聚糖季铵盐30mg，溶于10mL去离子水中，在搅拌条件下滴入10mL 2mg/mL碱性成纤维细胞生长因子溶液，1mL 0.3％(w/v)三聚磷酸钠溶液，20分钟滴完，室温下200转/分钟搅拌30分钟，在搅拌条件下滴加10mL含有0.4％(w/v)的透明质酸钠溶液,30分钟滴完，用氢氧化钠调节酸碱度至pH 5.0,室温下搅拌，200转/分搅拌5小时，15000转/分离心2小时，去除上清，冷冻干燥即得载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。

实施例3

取分子量为150kDa的壳聚糖季铵盐30mg，溶于10mL去离子水中，在搅拌条件下滴入10mL 2mg/mL碱性成纤维细胞生长因子溶液，1mL 0.5％(w/v)三聚磷酸钠溶液，20分钟滴完，室温下200转/分钟搅拌30分钟，在搅拌条件下滴加10mL含有0.5％(w/v)的透明质酸钠溶液,30分钟滴完，用氢氧化钠调节酸碱度至pH 6.0,室温下搅拌，200转/分搅拌5小时，15000转/分离心2小时，去除上清，冷冻干燥即得载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。

附表说明

表1为实施例1-3包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的物理性质以及载药性能(碱性成纤维细胞生长因子浓度保持2mg/mL)

Claims (7)

1.一种包载碱性成纤维生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：

(1)将壳聚糖季铵盐溶解于去离子水中，再将碱性成纤维细胞生长因子溶液加入该溶液中，搅拌30分钟，制得壳聚糖季铵盐/碱性成纤维细胞生长因子混合液；

(2)将三聚磷酸钠溶液滴加入壳聚糖季铵盐/碱性成纤维细胞生长因子混合液中进行离子交联反应；

(3)向步骤(2)中发生离子交联的壳聚糖季铵盐溶液中，加入透明质酸钠溶液，调节溶液的酸碱度至pH 4.0－6.0，最后将其分离纯化，干燥得到包载碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中碱性成纤维生长因子溶液浓度为2-5mg/mL，壳聚糖季铵盐溶液浓度为0.3-0.6％(w/v)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中三聚磷酸钠与壳聚糖季铵盐游离氨基的摩尔比为0.1-0.3:1，透明质酸水溶液的浓度范围为0.3％-0.5％(w/v)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中透明质酸钠与壳聚糖季铵盐的质量比为1-1.7:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：壳聚糖季铵盐的分子量范围40-150kDa,脱乙酰度大于90％，取代度大于40％。

6.一种包载碱性成纤维生长因子的壳聚糖季铵盐透明质酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：取壳聚糖季铵盐30-60mg，溶于10mL去离子水中，在搅拌条件下滴入10mL 2-5mg/mL碱性成纤维细胞生长因子溶液，1ml 0.2-0.5％(w/v)三聚磷酸钠溶液，20分钟滴完，室温下200转/分钟搅拌30分钟，在搅拌条件下滴加10mL含有0.3-0.5％(w/v)的透明质酸钠溶液,30分钟滴完，用氢氧化钠调节酸碱度至pH 4.0-6.0,室温下搅拌，200转/分搅拌5小时，15000转/分离心1-2小时，冷冻干燥得到固体产物。

7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于：所述透明质酸分子量范围10-50kDa。