CN116539742A - 一种头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，包括步骤：使用高效液相色谱法（HPLC）对头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质进行分离测定，其中聚合物杂质为头孢硫脒与7‑ACA、头孢硫脒β‑内酰胺环水解物以及头孢硫脒β‑内酰胺环水解脱羧物形成的二聚体、三聚体和多聚体，该方法以球状亲水硅胶为填充剂，并以缓冲盐‑有机相溶液作为流动相，色谱柱柱温为30‑40℃。该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高、再现性好，能够对头孢硫脒及其制剂中聚合物杂质在更好分离的前提下得到更准确的含量测定。

Description

一种头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及色谱法测试或分析技术领域，具体来说，涉及头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法。

背景技术

头孢硫脒系第一代头孢菌素，其对革兰阳性菌及部分革兰阴性菌均有抗菌活性，对革兰阳性球菌的作用尤强。临床上主要用于敏感菌所引起呼吸系统、肝胆系统、五官、尿路感染及心内膜炎、败血症。本品通过抑制敏感菌的细胞壁合成产生作用，主要作用于细菌的中隔细胞壁，抑制细菌粘肽合成第三步，阻止粘肽的交叉联结，使完整的细胞壁无法形成，而产生杀菌作用；是一种繁殖期杀菌剂。

头孢硫脒化学结构如下所示：

中国药典2020版中对头孢硫脒钠盐的质量控制包括酸碱度、澄清度与颜色、有关物质(杂质C、杂质D峰等)、残留溶剂、细菌内毒素等。

其中对头孢硫脒聚合物的有关物质的质量控制检测按照HPLC法(中国药典通则0512)测定。色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil100-5C18，4.6mmx250mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以磷酸盐缓冲液(取无水磷酸氢二钠2.76g，枸橼酸1.29g，加水溶解并稀释成1000ml)-乙腈(86:14)为流动相；检测波长为254nm；进样体积10μl。具体测定方法为：精密量取供试品溶液、对照溶液与杂质C对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。

质量控制限度为：杂质C峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍(0.1％)，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(1.5％)，小于灵敏度溶液主峰面积0.5倍的峰忽略不计。

抗生素中的高分子杂质，统称为聚合物。大量研究表明引发头孢菌素过敏反应的过敏原是制剂中高分子聚合物杂质，通过控制聚合物杂质可控制过敏反应的发生。因此，头孢硫脒及其制剂中聚合物杂质的含量水平的高低直接决定了产品的质量及后续临床用药的安全。但是，现行的头孢硫脒及其制剂的国内外现行药典质量标准均未对其聚合物杂质进行控制，仅对笼统的有关物质进行质控，无法具体分离确定聚合物杂质的含量。

中国专利申请CN104910186A公开了一种头孢硫脒水合物晶型。该专利披露该晶型稳定性较好，初始点聚合物杂质含量低，且不随着贮存时间的延长而明显明显。该专利文献也披露头孢硫脒国家药品标准未将头孢硫脒高分子聚合物列为检定项目，国内的药学研究也主要集中在头孢硫脒的合成与纯化，头孢硫脒及其制剂的纯度、含量及相关杂质测定，以及其降解产物的检测等方面；大多从提高含量、降低杂质等方面来提高其稳定性，在聚合物含量的考察中其结果并不理想。该专利文献披露的聚合物含量测定方法参照“高效分子排阻色谱法测定头孢硫脒聚合物含量”一文(晏会根，高效分子排阻色谱法测定头孢硫脒聚合物含量(J)，海峡药学，2010，22(3)：62-64)。该方法具体为采用TSKgel G2000SWxl，规格为7.8mm×30cm，5μm色谱柱，以0.01mol/L醋酸钠溶液：乙腈(93:7)为流动相，流速0.5ml/min，检测波长为254nm；文献披露是在0.4-2.0mg/ml范围内供试品溶液浓度与峰面积的线性相关系数r为0.9989。

但是本发明人团队重现上述聚合物检测方法发现，该专利文献披露的分析方法供试品溶液浓度与峰面积的线性相关系数r相比本发明的方法较低，这可能是由于其分离度不够导致(文献未披露，本发明人团队的重复结果为3.4)。

基于以上现状，有必要建立一种新的用于头孢硫脒及其制剂的聚合物杂质含量的更准确更灵敏的检测分析方法，使杂质特别是聚合物杂质能得到有效控制，保证后续产品的质量，保障临床用药安全。

发明内容

本发明的目的在于建立一种用于头孢硫脒及其制剂中聚合物杂质的HPLC的分析方法，该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高，能够对头孢硫脒及其制剂的聚合物杂质进行更好质量控制，保证产品质量和用药安全。

为此，本发明采用的具体技术方案如下：

一种头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，包括步骤：使用高效液相色谱法(HPLC)对头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质进行分离测定，其中所述聚合物杂质为头孢硫脒与7-ACA、头孢硫脒β-内酰胺环水解物以及头孢硫脒β-内酰胺环水解脱羧物形成的二聚体、三聚体和多聚体，所述HPLC以球状亲水硅胶为填充剂，并以缓冲盐-有机相溶液作为流动相；所述检测方法中色谱柱柱温为30-40℃。

优选地，所述流动相中的缓冲体系选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、枸橼酸-枸橼酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠缓冲体系。进一步优选地，所述流动相中的缓冲体系为60-65％％体积比的磷酸氢二钠溶液和35-40％体积比的磷酸二氢钠溶液组成的混合液。更优选地，所述流动相中的有机相选自乙腈、丙酮、甲醇或乙醇，其与缓冲盐溶液的比例为88-92:12-10。

优选地，所述填充剂为分子量适用范围1000-10000的球状蛋白色谱用亲水硅胶。

优选地，所述检测方法中的色谱柱柱温为35℃。

优选地，所述检测方法中的检测波长为254±5nm。

优选地，所述检测方法中流动相的流速为0.5-0.7mL/min。

最优选地，本发明采用岛津LC-20AT色谱仪和TSK-GEL SW色谱柱，以0.01mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈90:10混合液为流动相，在流速0.6mL/min、柱温35℃、检测波长254nm条件下进行。

由于采用了上述杂质分析方法，使得本发明具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高、再现性好的特点，能够对头孢硫脒及其制剂的聚合物杂质进行更符合杂质实际情况的质量控制，保证整个产品的质量和临床用药安全。故该法可以作为头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的常规监测手段。

本发明的有益效果为：

本发明的建立的一种用于头孢硫脒及其制剂中聚合物杂质的HPLC分析方法，该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高、再现性好，能够对头孢硫脒及其制剂中聚合物杂质在更好分离的前提下得到更准确的含量测定，从而以此方法得到的质量控制标准将更符合实际杂质含量情况，可以让厂家、检验机构、监管部门对药品进行更好的质量控制，保证产品质量和用药安全。

本发明人团队发现，通过本发明新的HPLC分析方法控制的聚合物质量标准，在头孢硫脒及其制剂的制备、贮藏、运输、使用等过程中可以较为方便的实时、现场测试聚合物杂质含量，按此分析方法达标合格的制剂，与通过现有文献方法记载的聚合物杂质质控相比，再现性更高、重复性更好，更能确保由此检测合格的药品在使用过程中发生的过敏等不良反应的大大减少。

附图说明

为了更清楚地说明和阐释本发明的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要结合使用的附图作简要介绍。本领域技术人员明白，本发明所附的说明书附图仅仅是用于例证性解释说明本发明的一些具体实施方案，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，由于具体实验参数的变化，所得到的附图可能产生相应的修改、调整、组合等，但并不影响本发明技术方案的实施。

图1显示了本发明实施例1中以0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(90∶10)混合液为流动相的系统适用性图谱所定位的保留时间约为15min以前的杂质峰即为能和主峰有效分离的头孢硫脒聚合物杂质。

图2显示了本发明实施例2调整流动相为0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(88∶12)混合液后的系统适用性图谱。

图3显示了本发明实施例3调整流动相为0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(92∶8)混合液后的系统适用性图谱。

具体实施方式

为进一步说明本发明的具体技术方案，结合本发明提供的以上说明书附图，本领域普通技术人员能够更清楚地理解本发明的具体实施方式。但本领域技术人员可以清楚的是，这些实施例仅仅是例证性说明本发明的具体实施方案，不对本发明的保护范围具有任何限制。本领域技术人员应能理解其他可能的实施方式以及基于本发明的构思和效果，对以下实施例中使用的各种设备、试剂、测试参数等进行各种等同的替换性选择、组合等，而无需付出创造性劳动，这些调整、改变和组合等均在本发明的保护范围内。本发明的具体保护范围以权利要求书的记载为准。

本发明的高效液相色谱仪优选使用日本岛津(Shimadzu)公司LC-20AT产品，其输液方式为串联双柱塞，柱塞容量为主泵头47μl和副泵头23μl，最大排液压力40MPa，流量设定范围为0.001mL/min-10.000mL/min，流量准确度为2％或2μL/min中较大值以内(0.01mL/min-5mL/min)，流量精密度为0.3以下。本发明也可以使用本领域技术人员可以获得的其他效能相当的高效液相色谱仪进行实施。

本发明的色谱柱优选使用日本东曹(TOSOH)公司的TSK-GEL G2000SWxl色谱柱。TSK-GEL SW系列色谱柱的填料是以刚性的球形硅胶为基质，在其表面通过共价键化学键合亲水团而成，该填料具有低吸附性和良好的孔径分布，其pH适合范围为2.5-7.5，可以使用与水完全互溶的有机溶剂，如乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等。本发明选用的TSK-GEL G2000SWxl色谱柱规格为7.8mm×30cm×5μm，其填料球形亲水硅胶的分子量适用范围为1000-10000。本发明也可以使用本领域技术人员可以获得的其他效能相当的色谱柱进行实施。

本发明具体以0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.005mol/L磷酸二氢钠溶液]为流动相的缓冲液。根据本发明的技术方案，需要在流动相中添加缓冲盐，其原因是聚合物杂质中含羧基，通过在流动相中添加缓冲盐可使被测物增强离子化，提高溶解度，从而有助于分离。流动相中的缓冲盐添加剂可以是无水磷酸氢二钠和枸橼酸、柠檬酸和柠檬酸钠、乙酸和乙酸钠以及本领域技术人员可获得的其他任何合适的缓冲盐。优选地，缓冲盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的组合。

本发明流动相中使用的有机相可选自乙腈、丙酮、甲醇或乙醇。优选地，所述有机相为乙腈。更优选地，流动相中磷酸盐缓冲液与乙腈的比例为88-92:12-8，最优选90:10。

在色谱条件中，本发明HPLC的检测波长为254±5nm，优选检测波长为254nm；流动相流速为0.5-0.7mL/min，优选为0.6mL/min；色谱柱的柱温为30-40℃，优选为35℃。

其他未特别说明的操作条件，本领域技术人员可根据仪器操作手册或说明书的规定和具体情况，选用符合要求的合适条件即可。

未特别指明的情况下，本发明所指的比例或百分比均为体积比或体积百分比。当使用百分比形式表达时，应理解为所指两种物质按照所述范围的体积百分比进行混合且两者的体积百分比之和为100％；当使用比例形式表达时，应理解为所指两种物质按照所述范围的体积份数进行混合且两者的体积份数之和为100。这两种方式可以互换表达，其含义是相同的。

实施例1

仪器与条件

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT

色谱柱：TSK-GEL G2000SWxl，7.8mm×30cm×5μm

流速：0.6mL/min

检测波长：254nm

柱温：35℃

进样量：20μL

流动相：0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(90:10)

实验步骤：

步骤1：溶液配制

系统适用性：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1ml，室温放置1分钟，再加0.1mol/L盐酸溶液1ml，摇匀，即得。头孢硫脒峰与其前相邻杂质峰的分离度大于2.0，主成分峰峰高的信噪比大于10。

供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：取头孢硫脒对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

步骤2：测定

精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按外标法以对照溶液中头孢硫脒的峰面积计算，保留时间小于头孢硫脒峰的杂质总量不得过0.5％。

实施例1的典型系统适用性图谱如图1所示。

实施例2

仪器与条件

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT

色谱柱：TSK-GEL G2000Wxl，7.8mm×30cm×5μm

流速：0.6mL/min

检测波长：254nm

柱温：35℃

进样量：20μL

流动相：0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(88:12)

实验步骤：

步骤1：溶液配制

系统适用性：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1ml，室温放置1分钟，再加0.1mol/L盐酸溶液1ml，摇匀，即得。头孢硫脒峰与其前相邻杂质峰的分离度大于2.0，主成分峰峰高的信噪比大于10。

供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：取头孢硫脒对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

步骤2：测定

精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按外标法以对照品溶液中的头孢硫脒峰面积计算，保留时间小于头孢硫脒峰的杂质峰的总量不得过0.5％。

实施例2的典型系统适用性图谱如图2所示。.

实施例3

仪器与条件

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT

色谱柱：TSK-GEL G2000SWxl，7.8mm×30cm×5μm

流速：0.6mL/min

检测波长：254nm

柱温：35℃

进样量：20μL

流动相：0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(92:8)

实验步骤：

步骤一：溶液配制

系统适用性：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1ml，室温放置1分钟，再加0.1mol/L盐酸溶液1ml，摇匀，即得。头孢硫脒峰与其前相邻杂质峰的分离度大于2.0，主成分峰峰高的信噪比大于10。

供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：取头孢硫脒对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

步骤二：测定

精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按外标法以对照品溶液中的头孢硫脒峰面积计算，保留时间小于头孢硫脒峰的杂质峰的总量不得过0.5％。

实施例3的典型系统适用性图谱如图3所示。

结果表明，现有技术方法对头孢硫脒及其制剂的聚合物杂质的分离度和再现性太低，不够灵敏也无法很好地再现，故无法准确检测出实际存在的更多聚合物杂质，对于用药质量安全存在较大隐患。通过本发明的检测方法可以更为灵敏地分离并检测到更多的实际存在的聚合物杂质，且再现性更好，有助于更好地控制药品质量，减少用药过敏反应等副作用。

以上所述实施例仅为本发明的较佳实施方案而已，并不对本发明构成任何限制。凡在本发明的基本精神和原则之内，由本领域技术人员无需创造性劳动即可作出的任何修改、等同替换、改进、组合等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于包括步骤：使用高效液相色谱法（HPLC）对头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质进行分离测定，其中所述聚合物杂质为头孢硫脒与7-ACA、头孢硫脒β-内酰胺环水解物以及头孢硫脒β-内酰胺环水解脱羧物形成的二聚体、三聚体和多聚体，所述HPLC以球状亲水硅胶为填充剂，并以缓冲盐-有机相溶液作为流动相；所述检测方法中色谱柱柱温为30-40℃。

2.根据权利要求1所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述流动相中的缓冲体系选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、枸橼酸-枸橼酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠缓冲体系。

3.根据权利要求2所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述流动相中的缓冲体系为60-65%体积比的磷酸氢二钠溶液和35-40%体积比的磷酸二氢钠溶液组成的混合液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述流动相中的有机相选自乙腈、丙酮、甲醇或乙醇，其与缓冲盐溶液的比例为88-92:12-10。

5.根据权利要求1-4任一项所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述填充剂为分子量适用范围1000-10000的球状蛋白色谱用亲水硅胶。

6.根据权利要求1-5任一项所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述检测方法中的色谱柱柱温为35℃。

7.根据权利要求1-6任一项所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述检测方法中的检测波长为254±5nm。

8.根据权利要求1-7任一项所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，所述检测方法中流动相的流速为0.5-0.7mL/min。

9.根据权利要求1-8任一项所述的头孢硫脒及其制剂中的聚合物杂质的HPLC检测方法，其特征在于，采用岛津LC-20AT色谱仪和TSK-GEL SW色谱柱，以0.01mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈90:10混合液为流动相，在流速0.6mL/min、柱温35℃、检测波长254nm条件下进行。