CN116536348A - VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法 - Google Patents
VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116536348A CN116536348A CN202310469142.1A CN202310469142A CN116536348A CN 116536348 A CN116536348 A CN 116536348A CN 202310469142 A CN202310469142 A CN 202310469142A CN 116536348 A CN116536348 A CN 116536348A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vvmybpro
- callus
- tannin
- gene
- transgenic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 title claims abstract description 53
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 title claims abstract description 53
- 239000001648 tannin Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 44
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 4
- 229920002414 procyanidin Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 claims description 18
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 claims description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims description 4
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims description 4
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000012879 subculture medium Substances 0.000 claims description 4
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 3
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 claims 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 abstract description 6
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 abstract description 6
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 4
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 4
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DMZOKBALNZWDKI-JBNLOVLYSA-N 4-Coumaroyl-CoA Natural products S(C(=O)/C=C/c1ccc(O)cc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@@](=O)(O[P@@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C DMZOKBALNZWDKI-JBNLOVLYSA-N 0.000 description 2
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710087643 Anthocyanidin reductase ((2S)-flavan-3-ol-forming) Proteins 0.000 description 2
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- DMZOKBALNZWDKI-MATMFAIHSA-N trans-4-coumaroyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 DMZOKBALNZWDKI-MATMFAIHSA-N 0.000 description 2
- DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N trans-chalcone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 2
- FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N (S)-naringenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- 229940093681 4-coumaric acid Drugs 0.000 description 1
- 101150017719 ANR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010004539 Chalcone isomerase Proteins 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- 102000005870 Coenzyme A Ligases Human genes 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010011449 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Proteins 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108700023158 Phenylalanine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010036937 Trans-cinnamate 4-monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000002594 fluoroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N naringenin Natural products C1(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC(C1)C1=CC=C(CC1)O WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117954 naringenin Drugs 0.000 description 1
- 235000007625 naringenin Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 polyphenol compound Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法。本发明通过构建过表达载体、基因敲除和基因沉默载体，转化至农杆菌后通过农杆菌侵染的方法，得到转基因过表达愈伤组织（PRI‑VvMYBPro）、基因敲除（Crispr‑VvMYBPro）和基因沉默（RNAi‑VvMYBPro）愈伤组织，将质地柔软并快速生长的PRI‑VvMYBPro和含有空载（EV）的对照愈伤以及野生型（WT）愈伤同时用同种条件进行培养，而后对比分析其单宁含量，可知PRI‑VvMYBPro愈伤组织中的单宁含量明显高于空载组（EV）和野生组（WT）。VvMYBPro基因可应用于酿酒葡萄愈伤组织细胞工厂高效合成葡萄单宁。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程和基因工程技术领域，具体涉及一种VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法。
背景技术
单宁是一种广泛存在于葡萄中的多酚类化合物，其含量的多少影响葡萄酒的色泽及口感，对研究食品抗氧化，清除自由基等功能具有重要意义。
植物中的单宁主要通过类黄酮通路合成，以苯丙氨酸作为代谢底物，在苯丙氨酸解氨酶的作用下生成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸4-羟化酶的催化下生成香豆酸，接着由4-香豆酸辅酶A连接酶催化形成4-香豆酰-CoA，4-香豆酰-CoA同丙二酰-CoA共同合成查尔酮，查尔酮在查尔酮异构酶作用下产生无色柚皮素，为进一步在类黄酮途径下合成单宁提供条件，其中能够合成花青素还原酶的ANR基因在类黄酮通路中是控制单宁合成关键基因。
目前，我国葡萄酒产业正处于快速发展期，我国酿酒葡萄优质产区宁夏、新疆等地在气候上呈现日照强，积温高等特点，导致种植的酿酒葡萄普遍存在糖高酸低，单宁积累量不足，品质不协调等问题。为了改善葡萄酒的感官特点，常常选择添加化学合成的单宁改善葡萄酒品质，该方法不仅成本高，而且由于人工合成的单宁与葡萄自然产生单宁组成存在差异，使葡萄酒的风味不协调，因此，外源添加单宁的应用效果仍有较大提升空间。
因此，发掘一种高效合成酿酒葡萄单宁的方法是目前我国酿酒产业发展的迫切需求。
发明内容
本发明为解决现有酿酒产业单宁不足的问题，提供一种VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法。
为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：VvMYBPro基因在酿酒葡萄赤霞珠愈伤组织细胞工厂高效合成葡萄单宁的应用。
VvMYBPro基因编码序列为：
ATGGGGAGAGCTCCATGTTGTGAGAAGATGGGGTTGAAGAAAGGTCCATGGACTCCCGAAGAAGATCAGATTTTGGTCAATTACATCCACCTTTATGGCCATGGAAACTGGAGGGCACTTCCCAAACAAGCTGGCTTATTGAGGTGTGGAAAGAGTTGCAGACTTCGATGGACGAATTATCTGAGGCCGGATATCAAACGGGGAAACTTCACCAGTGAAGAAGAAGAAACCATCATCGAGTTACATGAAAGGCTGGGCAATAGATGGTCAGCGATAGCAGCGAAACTACCGGGGAGGACAGACAATGAGATAAAAAATGTGTGGCACACCCACTTGAAGAAGAGGCTCAAGCACAACCACGCCACGCCACCCCCTAAAAGACACTCTCTTGATGCGTCCCAAGTCGAAAAACAACAAAACCCCATTAATTCTGCAACCAATTCGAGATCGGAGAGCCTTGGGTATGGACCAGTACTGTCCCCACAGCCGTCCTTTAGCGATATCTCCTCAGCCGCCACCACCACGACCACCACGACCACCGCCACCATGTCCGACATTACTACACCCTGCATTAAGGTCGATTCACCGGAGGATTTCCCAGAAATGGACGAGAATTTCTGGTCGGAAGTACTGTCATCCAACAAATCCGGCGCGGCGGGTGATTTGCCAGGGGCGGCCAGTGGTCCACAGCTTCAGTTTCCATTCTCTCCGCGTGCTGTCATTGGCAGTAGTCCATATAGCACGTATGACATGGACATGGAATTTTGGTACAATATTTTCACAAGGTCCGGGGAGTTGCATGAATTATCAGAAATATGA。
一种利用VvMYBPro基因高效合成单宁的方法，利用基因VvMYBPro构建过表达载体，侵染至赤霞珠愈伤组织，通过培养提高单宁合成量。
所述赤霞珠愈伤组织获得培养方法为：在葡萄花序变大、小花蕾之间刚刚分离开始于田间采集葡萄花序，将花序切成花生粒大小，在MS培养基接种消毒后的花序，接种外植体后放入组培室于25℃黑暗条件下培养，4周继代一次。
转基因赤霞珠愈伤组织培养条件为：侵染后将愈伤转移至表面铺一张无菌滤纸的新的继代培养基，暗培养2-4天，将转基因愈伤组织转移至含有卡那、头孢、羧卞霉素的选择培养基上，诱导转基因愈伤，后续每隔4周更换继代至新的选择培养基上，24±2℃下遮光培养，直至农杆菌侵染的材料表面长出一层新的愈伤组织，将其转移进行扩繁。
优选第3天将转基因愈伤组织转移至含有卡那、头孢、羧卞霉素的选择培养基上。
与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1、本发明中过表达VvMYBPro基因能够提高类黄酮通路中单宁合成相关基因ANR和LAR2的表达，从而促进葡萄愈伤中单宁含量的积累。
2、本发明方法可稳定合成单宁。
附图说明
图1是荧光镜下拍摄的转基因组织。
图2是不同转基因愈伤中VvMYBPro基因表达量的分析
图3是使用RT-qPCR方法对PRI-MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤中单宁合成相关基因表达量的分析；
图4是使用RT-qPCR方法对Crispr-MYBPro愈伤和含有空载(Crispr-Cas9)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤中单宁合成相关基因表达量的分析；
图5是使用RT-qPCR方法对RNAi-MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤中单宁合成相关基因表达量的分析；
图6是PRI-MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，其单宁含量的分析；
图7是Crispr-MYBPro愈伤和含有空载(Crispr-Cas9)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，其单宁含量的分析；
图8是RNAi-MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，其单宁含量的分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
VvMYBPro基因的编码序列为：
ATGGGGAGAGCTCCATGTTGTGAGAAGATGGGGTTGAAGAAAGGTCCATGGACTCCCGAAGAAGATCAGATTTTGGTCAATTACATCCACCTTTATGGCCATGGAAACTGGAGGGCACTTCCCAAACAAGCTGGCTTATTGAGGTGTGGAAAGAGTTGCAGACTTCGATGGACGAATTATCTGAGGCCGGATATCAAACGGGGAAACTTCACCAGTGAAGAAGAAGAAACCATCATCGAGTTACATGAAAGGCTGGGCAATAGATGGTCAGCGATAGCAGCGAAACTACCGGGGAGGACAGACAATGAGATAAAAAATGTGTGGCACACCCACTTGAAGAAGAGGCTCAAGCACAACCACGCCACGCCACCCCCTAAAAGACACTCTCTTGATGCGTCCCAAGTCGAAAAACAACAAAACCCCATTAATTCTGCAACCAATTCGAGATCGGAGAGCCTTGGGTATGGACCAGTACTGTCCCCACAGCCGTCCTTTAGCGATATCTCCTCAGCCGCCACCACCACGACCACCACGACCACCGCCACCATGTCCGACATTACTACACCCTGCATTAAGGTCGATTCACCGGAGGATTTCCCAGAAATGGACGAGAATTTCTGGTCGGAAGTACTGTCATCCAACAAATCCGGCGCGGCGGGTGATTTGCCAGGGGCGGCCAGTGGTCCACAGCTTCAGTTTCCATTCTCTCCGCGTGCTGTCATTGGCAGTAGTCCATATAGCACGTATGACATGGACATGGAATTTTGGTACAATATTTTCACAAGGTCCGGGGAGTTGCATGAATTATCAGAAATATGA。
在葡萄愈伤组织中过表达VvMYBPro基因能够显著提高ANR的表达量，从而提高单宁合成量，为在植物体外合成单宁提供一个新方法。
一种利用VvMYBPro基因高效合成单宁的方法为：
利用基因VvMYBPro构建过表达VvMYBPro载体(PRI-VvMYBPro)，利用农杆菌转化法将构建的载体转化至诱导的赤霞珠葡萄愈伤组织中，通过培养提高单宁合成量。
上述赤霞珠愈伤组织获得培养方法为：在葡萄花序变大、小花蕾之间刚刚分离开始于田间采集葡萄花序，将花序切成花生粒大小，在MS培养基接种消毒后的花序，接种外植体后放入组培室于25℃黑暗条件下培养，4周继代一次。
上述转基因赤霞珠愈伤培养条件为：侵染后将愈伤转移至表面铺一张无菌滤纸的新的继代培养基，暗培养2-4天，优选第3天将转基因愈伤组织转移至含有卡那、头孢、羧卞霉素的选择培养基上，诱导转基因愈伤，后续每隔4周更换继代至新的选择培养基上，24±2℃下遮光培养，直至农杆菌侵染的材料表面长出一层新的愈伤组织，将其转移进行扩繁。
研究转基因的葡萄愈伤组织中与单宁合成相关的ANR、LAR2基因的表达量及单宁的合成量，同时构建了基因敲除(Crispr-VvMYBPro)和基因沉默(RNAi-VvMYBPro)载体，转入赤霞珠葡萄愈伤组织中，对比VvMYBPro基因对单宁合成的影响。在三种转基因葡萄愈伤组织中，PRI-VvMYBPro愈伤组织中的单宁含量明显高于EV组和WT组。而相反地，基因沉默RNAi-VvMYBPro组和基因敲除Crispr-VvMYBPro组中的大部分株系单宁含量比其对照组和WT组低，不同转基因株系间存在单宁含量差异，过表达VvMYBPro基因葡萄愈伤组织能够显著提高单宁含量。下面对其进行验证：
一、转PRI-VvMYBPro、Crispr-VvMYBPro、RNAi-VvMYBPro基因葡萄愈伤对MYB-Pro基因表达量的影响
1、构建带有不同基因的组织
(1)构建PRI-VvMYBPro、Crispr-VvMYBPro、RNAi-VvMYBPro载体
(2)转化农杆菌
(3)活化农杆菌：取200微升接种于10ml YEB中(50mg/lRIF和50mg/lKan)三角瓶小摇12h，28℃，12h；后接大瓶50ml，摇床培养6-7h，28℃，180rpm。
(3)侵染农杆菌：当菌液摇至浑浊时，5000rpm离心10min；再用无菌水重悬浮菌液，将上述液体转至对应三角瓶中，加入乙酰丁香酮(简称AS)。
将愈伤组织材料分组分批次加入上述菌液中，避光侵染，摇床震荡120-130rpm，8-10min。将上述三角瓶内混合物，倒入盖好纱布的组培瓶中吸水过滤，再转移至干滤纸，反复吸水。直至吸干多余液体。转移至表面铺一张无菌滤纸的新的B5继代培养基，暗培养2-4天。一般选择第三天将转基因愈伤组织转移至Kan、Cerf、Carb选择培养基上，诱导转基因愈伤。
后续每隔4周更换继代至新的选择培养基上，24±2℃遮光培养，直至农杆菌侵染的材料表面长出一层新的愈伤组织，则可以将其转移进行扩繁。
(4)继代葡萄愈伤组织至其性状稳定。
2、试验结果
如图1所示，在荧光显微镜下拍摄转基因愈伤组织，在细胞核中出现荧光亮点，证明基因成功转入。
培养一段时间后，对不同转基因愈伤组织VvMYBPro基因含量进行分析：
由图2可知，PRI-VvMYBPro、Crispr-VvMYBPro、RNAi-VvMYBPro和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，定量分析VvMYBPro基因表达量，可知PRI-MYBPro愈伤组织中VvMYBPro基因表达量明显高于EV组和WT组，Crispr-VvMYBPro和RNAi-VvMYBPro愈伤组织中VvMYBPro基因表达量低于EV组和WT组。。
二、转PRI-MYBPro、Crispr-MYBPro、RNAi-MYBPro基因葡萄愈伤对单宁合成相关基因表达量的影响
1、技术方案
在前期获得PRI-VvMYBPro、Crispr-VvMYBPro、RNAi-VvMYBPro转基因愈伤的基础上对单宁合成相关基因表达量进行分析。
2、试验结果
培养一段时间后，对不同转基因愈伤组织中单宁合成相关基因表达量进行分析：
如图3所示，RT-PCR分析可知，在过表达转基因愈伤组织中，VvANR基因表达量的显著升高，同时VvLAR2表达水平也有所升高。
在基因沉默和基因敲除的转基因愈伤中，如图4和图5所示，VvANR和VvLAR2表达水平都相对于对照和空载组有所下降。
三、转PRI-MYBPro、Crispr-MYBPro、RNAi-MYBPro基因葡萄愈伤对单宁积累量的影响
1、技术方案
在前期获得PRI-VvMYBPro、Crispr-VvMYBPro、RNAi-VvMYBPro转基因愈伤的基础上对单宁积累量进行分析。
2、试验结果
培养一段时间后，对不同转基因愈伤组织中单宁积累量进行分析：
由图2可知，PRI-VvMYBPro和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，而后对比分析其单宁含量，可知PRI-VvMYBPro愈伤组织中的单宁含量明显高于EV组和WT组。
基因沉默RNAi-VvMYBPro组和基因敲除Crispr-VvMYBPro组株系单宁含量比其对照组和WT组低，如图7和图8所示。
Claims (6)
1.VvMYBPro基因在酿酒葡萄赤霞珠愈伤组织细胞工厂高效合成葡萄单宁的应用。
2.VvMYBPro基因，其特征在于：其编码序列为：ATGGGGAGAGCTCCATGTTGTGAGAAGATGGGGTTGAAGAAAGGTCCATGGACTCCCGAAGAAGATCAGATTTTGGTCAATTACATCCACCTTTATGGCCATGGAAACTGGAGGGCACTTCCCAAACAAGCTGGCTTATTGAGGTGTGGAAAGAGTTGCAGACTTCGATGGACGAATTATCTGAGGCCGGATATCAAACGGGGAAACTTCACCAGTGAAGAAGAAGAAACCATCATCGAGTTACATGAAAGGCTGGGCAATAGATGGTCAGCGATAGCAGCGAAACTACCGGGGAGGACAGACAATGAGATAAAAAATGTGTGGCACACCCACTTGAAGAAGAGGCTCAAGCACAACCACGCCACGCCACCCCCTAAAAGACACTCTCTTGATGCGTCCCAAGTCGAAAAACAACAAAACCCCATTAATTCTGCAACCAATTCGAGATCGGAGAGCCTTGGGTATGGACCAGTACTGTCCCCACAGCCGTCCTTTAGCGATATCTCCTCAGCCGCCACCACCACGACCACCACGACCACCGCCACCATGTCCGACATTACTACACCCTGCATTAAGGTCGATTCACCGGAGGATTTCCCAGAAATGGACGAGAATTTCTGGTCGGAAGTACTGTCATCCAACAAATCCGGCGCGGCGGGTGATTTGCCAGGGGCGGCCAGTGGTCCACAGCTTCAGTTTCCATTCTCTCCGCGTGCTGTCATTGGCAGTAGTCCATATAGCACGTATGACATGGACATGGAATTTTGGTACAATATTTTCACAAGGTCCGGGGAGTTGCATGAATTATCAGAAATATGA。
3.一种利用VvMYBPro基因高效合成单宁的方法，其特征在于：利用基因VvMYBPro构建过表达载体，侵染至赤霞珠愈伤组织，通过培养提高单宁合成量。
4.根据权利要求3所述的一种利用VvMYBPro基因高效合成单宁的方法，其特征在于：所述赤霞珠愈伤组织获得培养方法为：在葡萄花序变大、小花蕾之间刚刚分离开始于田间采集葡萄花序，将花序切成花生粒大小，在MS培养基接种消毒后的花序，接种外植体后放入组培室于 25 ℃黑暗条件下培养，4 周继代一次。
5.根据权利要求4所述的一种利用VvMYBPro基因高效合成单宁的方法，其特征在于：转基因赤霞珠愈伤组织培养条件为：侵染后将愈伤转移至表面铺一张无菌滤纸的新的继代培养基，暗培养2-4天，将转基因愈伤组织转移至含有卡那、头孢、羧卞霉素的选择培养基上，诱导转基因愈伤，后续每隔4周更换继代至新的选择培养基上，24±2℃下遮光培养，直至农杆菌侵染的材料表面长出一层新的愈伤组织，将其转移进行扩繁。
6.根据权利要求5所述的一种利用VvMYBPro基因高效合成单宁的方法，其特征在于：优选第3天将转基因愈伤组织转移至含有卡那、头孢、羧卞霉素的选择培养基上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310469142.1A CN116536348B (zh) | 2023-04-27 | VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310469142.1A CN116536348B (zh) | 2023-04-27 | VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116536348A true CN116536348A (zh) | 2023-08-04 |
| CN116536348B CN116536348B (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2429031A1 (en) * | 2000-11-17 | 2002-05-23 | Agriculture And Agri-Food Canada | Regulation of flavonoid expression in alfalfa using maize regulatory genes |
| CA2592533A1 (en) * | 2007-01-11 | 2008-07-11 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Novel gene encoding myb transcription factor involved in proanthocyanidin synthesis |
| CN103444524A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-12-18 | 河南省农业科学院烟草研究所 | 一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法 |
| CN104744579A (zh) * | 2015-04-02 | 2015-07-01 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 抗逆相关蛋白GmL16在调控植物抗逆性中的应用 |
| KR101723309B1 (ko) * | 2015-11-17 | 2017-04-05 | 경희대학교 산학협력단 | 안토시아닌의 생합성이 증진된 형질전환 식물 |
| WO2021220268A1 (en) * | 2020-04-26 | 2021-11-04 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) | Phenol-rich grapes |
| WO2022227102A1 (zh) * | 2021-04-28 | 2022-11-03 | 齐鲁工业大学 | γ-聚谷氨酸在植物中异源合成提高植物抗逆性和产量的方法 |
| CN116769793A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-09-19 | 西北农林科技大学 | 葡萄细胞分裂素响应调节因子基因VvRR1及其应用 |
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2429031A1 (en) * | 2000-11-17 | 2002-05-23 | Agriculture And Agri-Food Canada | Regulation of flavonoid expression in alfalfa using maize regulatory genes |
| CA2592533A1 (en) * | 2007-01-11 | 2008-07-11 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Novel gene encoding myb transcription factor involved in proanthocyanidin synthesis |
| CN103444524A (zh) * | 2013-01-08 | 2013-12-18 | 河南省农业科学院烟草研究所 | 一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法 |
| CN104744579A (zh) * | 2015-04-02 | 2015-07-01 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 抗逆相关蛋白GmL16在调控植物抗逆性中的应用 |
| KR101723309B1 (ko) * | 2015-11-17 | 2017-04-05 | 경희대학교 산학협력단 | 안토시아닌의 생합성이 증진된 형질전환 식물 |
| WO2021220268A1 (en) * | 2020-04-26 | 2021-11-04 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) | Phenol-rich grapes |
| CN116390645A (zh) * | 2020-04-26 | 2023-07-04 | 以色列农业和农村发展部农业研究组织(范卡尼中心) | 富含酚的葡萄 |
| WO2022227102A1 (zh) * | 2021-04-28 | 2022-11-03 | 齐鲁工业大学 | γ-聚谷氨酸在植物中异源合成提高植物抗逆性和产量的方法 |
| CN116769793A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-09-19 | 西北农林科技大学 | 葡萄细胞分裂素响应调节因子基因VvRR1及其应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JIANG J等: "VvWRKY8 represses stilbene synthase genes through direct interaction with VvMYB14 to control resveratrol biosynthesis in grapevine", J. EXP. BOT., vol. 70, no. 2, 15 January 2019 (2019-01-15), pages 719 - 729 * |
| MATUS等: "Analysis of the grape MYB R2R3 subfamily reveals expanded wine quality-related clades and conserved gene structure organization across Vitis and Arabidopsis genomes", BMC PLANT BIOL., vol. 83, no. 8, 22 July 2008 (2008-07-22), pages 1 - 15 * |
| MATUS等: "Vitis vinifera R2R3 Myb14 transcription factor (MYB14) mRNA, complete cds", GENBANK DATABASE, 1 October 2008 (2008-10-01), pages 181424 * |
| 宋晓云等: "调控黄酮合成的主要MYB转录因子及其在苜蓿品质改良中的应用", 中国草地学报, vol. 38, no. 3, 25 May 2016 (2016-05-25), pages 101 - 107 * |
| 张付春: "砧木对酿酒葡萄生长及果实类黄酮物质代谢调控机制的比较研究", 中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑, no. 8, 15 August 2023 (2023-08-15), pages 048 - 21 * |
| 汪丽君: "杨树转录因子MYB6调控类黄酮和木质素生物合成的机制研究", 中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑, no. 1, 15 January 2019 (2019-01-15), pages 006 - 71 * |
| 陈冠宇: "葡萄转录因子MYB14和MYB15调控芪类物质积累与抗白粉病研究", CNKI硕士学位论文, 1 May 2022 (2022-05-01), pages 1 - 80 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bentebibel et al. | Effects of immobilization by entrapment in alginate and scale‐up on paclitaxel and baccatin III production in cell suspension cultures of Taxus baccata | |
| RU2289914C2 (ru) | Картофель с повышенным выходом крахмала в пересчете на отдельное растение и способ его получения | |
| CN102533782A (zh) | 一种控制水稻籽粒粒宽和粒重基因OsAGSW1的克隆及应用 | |
| CN103993036A (zh) | 一种用于紫萍愈伤诱导并且能实现转基因稳定遗传的转化体系 | |
| CN116536348B (zh) | VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法 | |
| LT3083B (en) | Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production | |
| CN116536348A (zh) | VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法 | |
| CN102316721B (zh) | 使用了苹果潜隐球形病毒载体的蔷薇科果树的开花促进方法 | |
| CN105063086A (zh) | 一种快速获得大量转基因佛甲草新品种的分子育种方法 | |
| CN113025623A (zh) | 一种玫瑰花香调控基因RrTPS1及其应用 | |
| CN102559748B (zh) | 一种简便的农杆菌介导甘蔗转基因方法 | |
| CN110305894A (zh) | 一种快速高效的楸遗传转化方法 | |
| KR20100053456A (ko) | 선발마커가 제거된 형질전환 벼의 제조방법 | |
| CN102399795A (zh) | 利用颠茄托品酮还原酶i型基因提高颠茄莨菪烷类生物碱含量的方法 | |
| CN105039391A (zh) | 一种建立农杆菌介导东农冬麦1号成熟胚遗传转化的方法 | |
| CN111621518B (zh) | 一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用 | |
| CN114134169A (zh) | 一种烟草毛状根遗传转化体系的建立方法 | |
| Osuna et al. | Immobilization of Galphimia glauca plant cell suspensions for the production of enhanced amounts of Galphimine-B | |
| KR101397838B1 (ko) | 감귤 캘러스 세포의 제조방법 | |
| CN115216489B (zh) | 一种宽叶独行菜的遗传转化方法及其应用 | |
| CN115354047B (zh) | 一种农杆菌介导的雷公藤遗传转化方法及甲素获取方法 | |
| US20130189765A1 (en) | Algal bio-flocculation by inactivation of photoreceptors | |
| KR101198648B1 (ko) | 직접 신초 유도를 통한 오이 계통의 형질전환 방법 및 상기방법에 의해 제조된 오이 계통 형질전환체 | |
| CN113652434B (zh) | 一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实dna分子及其应用 | |
| CN106801061A (zh) | 玉米ZmNST3基因及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |