CN111621518B - 一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用，涉及转基因技术领域。具体而言，该构建方法将外植体接种于固态且预培养有发状根农杆菌菌落的基础培养基上，共培养后筛选培养至外植体内浸染有发状根农杆菌，该构建方法耗时短，无需进行摇液，也无需控制菌液OD值，在浸染过程中，平均每株植物的操作时间不超过5min，显著降低了实验时间和操作难度，且转化效率高，为转基因植物的培育提供了一种新的方法。

Description

一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，具体而言，涉及一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用。

背景技术

根癌农杆菌介导的杨树转基因技术，虽然一定程度上促进了杨树遗传转化和基因功能研究的发展，然而现有的根癌农杆菌介导的杨树转基因方法仍存在实验周期长，操作繁琐，效率不高，转基因植物多为嵌合体等缺陷。鉴于根癌农杆菌(A.tumefaciens)在杨树遗传转化中的这些不足，同样具有将外源基因引入杨树基因组能力的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)逐渐进入了人们的视野。

目前发根农杆菌介导的杨树转基因基本采用与根癌农杆菌相似的转化方法，包括使用叶片或者茎段作为外植体，与一定OD值的菌液共培养以获得转基因根。按照农杆菌侵染操作的不同，现有的农杆菌介导的杨树转基因方法可简单分为两组：菌液侵染法和注射器针头刺入法。菌液侵染法需要特定OD值的菌液，需要对转化的外植体(叶子或茎段)进行预处理(划痕与切块)，实验时间长；再有，在筛选的过程中，残留在外植体伤口的农杆菌因无法接触到培养基中的抗生素，菌体过度生长，导致外植体萎蔫或死亡，转化率降低。注射器针头刺入法虽然避免了外植体制备和菌液侵染的繁琐步骤，但是操作难度较高，力度不容易掌控，转化效率比较随机。此外，对于木本植物杨树来说，茎的硬度也进一步限制了注射法的应用空间。

综上所述，目前已有的发根农杆菌介导的杨树转基因方法仍然存在操作要求较高，费时较长，转化效率较低等一系列问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，实施例提供了一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其包括以下步骤：将外植体接种于固态且预培养有发状根农杆菌菌落的基础培养基上，共培养后筛选培养至外植体内浸染有发状根农杆菌。

第二方面，实施例提供如前述实施例所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法在植物育种中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其包括以下步骤：将外植体接种于固态且预培养有发状根农杆菌菌落的基础培养基上，共培养后筛选培养至外植体内浸染有发状根农杆菌，该构建方法耗时短，无需进行摇液，也无需控制菌液OD值，在浸染过程中，平均每株植物的操作时间不超过5min，显著降低了实验时间和操作难度，且转化效率高，为转基因植物的培育提供了一种新的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为试验例1中激光共聚焦显微镜观察K599-AspAT5转基因毛状根的亚细胞定位(物镜20X)；

图2为试验例1中激光共聚焦显微镜观察K599-AspAT10转基因毛状根的亚细胞定位(物镜20X)；

图3为试验例1中激光共聚焦显微镜观察空白对照组的根的亚细胞定位(物镜10X)；

图4为试验例1中K599-AspAT5植株在筛选培养基上生长10d(A)和30d(B)后的形态；

图5为试验例1中K599-AspAT10植株在筛选培养基上生长30d后的形态；其中，(A)为野生型植株，(B)为K599-AspAT10植株，(C)为发状根形态，(D)为伸出培养基的发状根，(E)为野生型植株地上部分形态，(F)为K599-AspAT10植株地上部分形态；

图6为试验例1中毛状根的基因组rolB基因的PCR扩增结果；

图7为试验例2中不同浓度IBA诱导外植体产生发状根的比率。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

首先，本发明实施例提供了一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其包括：将外植体接种于固态且预培养有发状根农杆菌菌落的基础培养基上，共培养后筛选培养至外植体内浸染有发状根农杆菌。

经发明人研究发现，在预培养有发状根农杆菌菌落的固态培养基上直接接种外植体，进行培养，能够有效浸染外植体，植物受伤部位会释放一些酚类化合物，由于趋化性，共培养时农杆菌会将植物受伤部分包裹并浸染。相比于现有的注射器刺入法浸染，外植体受伤部位表面积更大，农杆菌浸染部位更多，因而转化效率也更高。同时，在省略了传统技术需要将培养基上培养的菌落进行摇菌和控制OD值等步骤的情况下，也能达到有效浸染外植体的目的，每株植物从浸染开始至结束的操作时间不超过5min，降低了操作时间和难度，直接点单菌落在培养基表面预培养，将植物插入在菌落中即可，避免了注射对植物造成的伤害，简化实验流程。

优选地，所述预培养的培养时间为1～3天；

优选地，基础培养基的组分包括：MS粉末0.59～4.74g/L、蔗糖25g/L和琼脂6～8g/L，pH为5.6～6.0。在一些实施方式中，在接种外植体之前，所述构建方法包括农杆菌的转化和验证，以获得阳性菌落。具体地，将目的基因导入农杆菌中的方式为本领域的公知技术，对目的基因的选择以及农杆菌的转化过程没有任何特殊的限定。

优选地，所述发状根农杆菌为携带有目的基因的发根农杆菌。优选地，所述发状根农杆菌的类型选自：发根农杆菌K599、Ar.Qual、A4、C5851中的至少一种。

在一些实施方式中，采用YEB固体培养基进行发状根农杆菌(阳性菌落)的培养，具体地，YEB固体培养基含有50mg/L硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)，50mg/L硫酸链霉素(sterptomycin sulfate)，28℃暗培养48h获得单菌落。

在一些实施方式中，采用接种棒或牙签轻沾阳性菌落表面，点在基础培养基上，进行预培养。

在一些实施方式中，外植体在基础培养基上接种的区域为生长有菌落的区域。

在一些实施方式中，外植体与农杆菌共培养的培养条件为10℃～25℃，黑暗培养。具体地，培养温度可以为15℃、23℃或25℃。

在一些实施方式中，所述构建方法还包括将共培养后的外植体转移至筛选培养基中培养，筛选能够生长毛状根的外植体。

优选地，所述构建方法包括将共培养的外植体从培养基上移出，用200～500mg/L的头孢霉素漂洗两次，之后再插在筛选培养基中。

在一些实施方式中，外植体在筛选培养基中的培养条件为：23～25℃，7500～8500lx，光照12～18h。在另一些实施方式中，采用普通植物组培环境条件即可。

优选地，所述筛选培养基中包括有生长素。生长素可大幅度提高毛状根的形成率，并降低非毛状根的成活率。

优选地，所述筛选培养基的组分包括：MS粉末0.59～4.74g/L、琼脂6～8g/L、头孢霉素200～500mg/L和生长素0.1～0.5mg/L，pH为5.6～6.0。

优选地，所述生长素选自吲哚丁酸IBA。

在一些实施方式中，所述构建方法包括将筛选培养基中培养获得的毛状根进行继代培养，并筛选转基因阳性株系。

在一些实施方式中，培养毛状根的液体培养基的组分包括：MS粉末0.59～4.74g/L和头孢霉素50～200mg/L，pH为5.6～6.0。

在一些实施方式中，所述外植体选自：顶芽、茎段和叶片中的至少一种。

优选地，所述外植体为顶芽。当选择顶芽时，因顶芽为幼嫩组织，分裂能力强，分化程度低，易脱分化诱导成愈伤组织。当选择叶片时，插菌操作困难；当选择茎段时，由于无法提供给发状根充足的营养，转化效果不好。

在一些实施方式中，所述杨树选自：毛果杨、美洲黑杨、胡杨和白杨中的至少一种。

综上，采用上述任一实施方式提供的构建方法可在15天内获得含有转基因的复合杨树，转化效率高达75～95％，得到的转基因复合杨树既可以直接作为实验材料，也可将转基因杨树的毛状根切下再生成完整的植株，进行后续基因功能等方面的研究。

此外，本发明的构建方法所得到的转基因根数量也多(平均每株3～根以上)，生长速度快，分枝多，很容易得到足够数量的转基因根，根作为植物吸收营养的主要器官，强大的根系可为地上部分提供充足的营养物质。转基因杨树及后续的再生苗具有强大复杂的根系，吸收营养能力增强，生长能力相较于野生杨树也会提高，可见，本发明实施例提供的构建方法为杨树转基因的遗传改良提供了一种快速有效的途径。

此外，本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的构建方法在植物育种中的应用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法。在该构建方法中，用到的培养基的成分如表1记载。

表1培养基配方

该构建方法具体包括以下步骤。

(1)发根农杆菌的转化和培养。

发根农杆菌为K599，携带Ri2659质粒，外源性质粒载体上具CaMV35S启动子、EGFP报告基因和目的基因AspAT(天冬氨酸转氨酶)。

采用YEB固体培养基(含有50mg/L硫酸卡那霉素，50mg/L硫酸链霉素，pH7.1)，28℃暗培养48h获得单菌落。

(2)植物材料准备

植物材料为南林895杨组培苗，在基础培养基上培养至4～6周。

(3)预培养

用牙签轻沾阳性菌落表面，轻点在基础培养基的表面，暗培养1～2天，直到肉眼可见菌落。

(4)侵染和共培养

将来源于步骤(2)的植株顶芽(具3～5片健康叶片的顶芽)用剪刀剪下，以此作为外植体，接种于步骤(3)的固态的预培养的农杆菌菌落上，暗培养2-3天，直到肉眼可见菌体已将顶芽底部切面部位包围。

(5)筛选

将步骤(4)获得的共培养的顶芽从培养基中移出，用300mg/L的头孢霉素漂洗两次，目的是清洗掉根和叶片上的肉眼可见的多余农杆菌，而不是完全抑制农杆菌的生长。清洗之后在筛选培养基中进行筛选培养，培养条件为23℃，8000lx，16h光照/8h黑暗。

(6)发状根培养

约3-4周后，待筛选培养基培养的外植体上的毛状根长至2cm左右，将其转移至毛状根培养基(液体)中进行培养，培养条件为23℃，80rpm。

(7)筛选转基因阳性株系

结合植株的根系形态特点、PCR检测结果和/或荧光检测结果筛选转基因阳性株系。

试验例1

不同实验人员使用实施例1描述的构建方法，对南林895杨无菌苗进行转基因植株的构建，设置5组试验组，组1和组3对应菌株为K599-AspAT5，组2和组4对应菌株为K599-AspAT10，组5为空白对照组，具体参照表2。

4周后对5组转基因毛状根的目的基因进行亚细胞定位分析，组1～4的定位结果依次参照图1～3。图1～3中，从左到右4张照片依次为(1)EGFP通道，强度800；(2)叶绿素A通道，强度800；(3)明场通道；(4)融合照片。

5组转基因植物的统计结果如表2所示。

表2毛状根诱导率统计结果

表2中，组1与组3，组2与组4的实验时间不同，其余培养条件完全一致。转化效率可达75％～90％。

经由发根农杆菌处理后，外植体生根率发生显著变化，处理后生根的外植体根部或多或少出现与正常根表型差异较大的根。与正常根相比，发根农杆菌诱导出的毛状根侧根分支多而长，而且由于具有负向地性特征，侧根大多伸出培养基表面；此外，毛状根(尤其侧根)的颜色，为乳白色，而正常根则为淡黄色或淡绿色。这与前人(Christey et al.，2001)观察基本一致。因而，可通过植株表型初步筛选出转基因株系。

图4中A和4中B分别为试验例1中K599-AspAT5转基因植株在筛选培养基上生长10d和30d后的形态。

图5为试验例1中K599-AspAT10植株在筛选培养基上生长30d后的形态。从图中可看出转基因植株的毛状根侧根多且长(图5中B和5中C)；而且由于失去向地性，一些毛状根会伸出培养基表面(图5中D)。从图5中F中可看出转基因植株茎尖生长缓慢，叶片生长较密；而野生型植株生长速度正常，相比转基因植株，叶片生长较疏。野生型植株的根，可能由于光照影响，少量叶绿素积累，会偏黄或偏绿(图5中A)，而转基因植株的毛状根，尤其侧根，为乳白色(图5中B)。

由图4～5可知，相比野生型植株的根，转基因植株的毛状根的侧根明显多且长，一些侧根会伸出培养基表面，且侧根颜色为乳白色。以上毛状根的特点都可用肉眼直接观察，易于区分发状根与普通根。转基因植株与野生型植株也可通过比较其地上部分植株的高度，以及叶片和茎段生长疏松程度，用肉眼直接区分。

提取毛状根基因组DNA，利用农杆菌基因rolB特异性引物rolB-FW：5'-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3'和rolB-REV：5'-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3'进行PCR扩增。

图6为利用rolB基因特异性引物对转基因获得的毛状根的基因组DNA进行PCR扩增的结果。图中，M：1kb DNA ladder；1-9是rolB引物扩增毛状根的基因组DNA获得的结果。阳性对照是rolB引物扩增K599菌落的结果。阴性对照为反应体系不加模板。

由图6可知，随机选取的9个毛状根中都具有rolB基因的PCR条带，因此毛状根具有rolB基因的概率为100％。

试验例2

验证实施例1提供构建方法中，筛选培养基中IBA的工作浓度。

本实施例提供了一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，大致与实施例1相同，区别在于，IBA浓度不同，本实施例中，采用不同浓度的IBA进行筛选，不同浓度具体包括0mg/L，0.1mg/L，0.175mg/L，0.25mg/L和0.5mg/L，每一组浓度外植体个数为10个。由图7可知，IBA浓度为0.175mg/L最佳。

试验例3

将已有的杨树转基因方法与本发明实施例1提供的构建方法进行对比，结果请参照表3。

表3已有转基因方法和本发明方法的对比

由表3可知，本申请实施例1提供的构建方法不需要控制菌液OD值，避免了摇菌，测菌液OD值，离心，再重悬等繁琐的实验步骤。操作简单且用时较少。在侵染操作的整个过程中，平均每株植物操作时间不超过5min，大大缩短了实验时间。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：将外植体接种于固态且预培养有发状根农杆菌菌落的基础培养基上，共培养后筛选培养至外植体内浸染有发状根农杆菌，所述预培养的培养时间为1~3天；基础培养基的组分包括：MS粉末0.59~4.74g/L、蔗糖25g/L和琼脂6~8g/L，pH为5.6~6.0；所述共培养的培养条件为：23~25℃，时间为1~3天；外植体接种的区域为生长有菌落的区域；所述发状根农杆菌为携带有目的基因的发根农杆菌；

所述外植体选自：顶芽、茎段和叶片中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，所述发状根农杆菌的类型选自：发根农杆菌K599、Ar.Qual、A4和C5851中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括将共培养后的外植体转移至筛选培养基中培养，然后筛选能够生长毛状根的外植体。

4.根据权利要求3所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，外植体在筛选培养基中的培养条件为：23~25℃，7500~8500lx，光照12~18h。

5.根据权利要求4所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，所述筛选培养基中包括有生长素。

6.根据权利要求5所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，所述筛选培养基的组分包括：MS粉末0.59~4.74g/L、琼脂6~8g/L、头孢霉素200~500mg/L和生长素0.1~0.5mg/L，pH为5.6~6.0。

7.根据权利要求6所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，所述生长素选自吲哚丁酸IBA，浓度为0.1~0.25 mg/L。

8.根据权利要求3所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将筛选培养基中培养获得的毛状根进行继代培养，并筛选转基因阳性株系。

9.根据权利要求8所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，培养毛状根的液体培养基的组分包括：MS粉末0.59~4.74g/L和头孢霉素50~200mg/L，pH为5.6~6.0。

10.根据权利要求1~9任一项所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法，其特征在于，所述外植体为顶芽。

11.如权利要求1~9任一项所述的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法在植物育种中的应用。

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