CN116536276A - 一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体公开了一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒及其构建方法和应用。该重组溶瘤病毒能够选择性感染肿瘤细胞，复制，表达可溶性“别吃我”阻断元件，阻断肿瘤细胞膜表面的“别吃我”信号受体，并显著增强抗肿瘤免疫；本发明包含的重组溶瘤腺病毒构建体的药物组合物在制备癌症治疗药物中的应用。本发明通过整合免疫活化、招募和提高巨噬细胞吞噬肿瘤活性等多方面的抗肿瘤机制，达到极其显著的抗肿瘤作用，并减少阻断剂的脱靶效应，从而减少毒副作用的产生；具有极高的临床抗肿瘤药物的开发价值。

Description

一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒及其构建方法和应用。
背景技术
癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，我国每年都有数百万的人死于癌症。多数病人在确诊时已处于中晚期从而失去外科手术治疗的机会，而传统放疗化疗，并没有给肿瘤带来突破性的进展，急需突破性的治疗手段。
肿瘤免疫疗法的兴起给肿瘤治疗带来一线曙光。然而肿瘤细胞能够借助“别吃我(don’t eat me)”信号来逃逸免疫细胞的攻击，包括程序性细胞死亡配体1(PD-L1)[1]，beta-2微球蛋白亚基主要组织相容性I类复合物(B2M)[2]，CD47[3]和CD24[4]。通过阻断“别吃我”信号与表达在免疫细胞表面的受体相互作用，在多种癌症中展示出良好的抗肿瘤效果[5]。
CD47是质膜分子，是一种整合素相关蛋白(IAP)，是血小板反应蛋白家族成员的受体，在肿瘤细胞中广泛表达[6]。跨膜信号蛋白SIRPα是CD47的配体，是一种调节性膜糖蛋白，在髓样细胞(如巨噬细胞)以及其他免疫细胞(如树突细胞)中高表达[7]。
研究证明，阻断CD47在癌细胞上的信号可以促进对巨噬细胞，NK细胞，肿瘤特异性细胞毒性CD8+的T细胞和树突细胞的活化[8]。给小鼠注射SIRPα可以阻断CD47对巨噬细胞的抑制作用，与注射CD47抗体具有相同的抑制肿瘤作用[9]。近十年来，CD47已经成为肿瘤免疫疗法的一个潜在靶点。
CD24也被称为热稳定抗原或小细胞肺癌4簇抗原，是一种高度糖基化糖基-锚定的表面蛋白。CD24与固有免疫细胞上的抑制性受体——唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素10(Siglec-10)相互作用，传递免疫抑制性信号[10]。有研究发现，肿瘤表达的CD24能与肿瘤相关巨噬细胞表达的Siglec-10相互作用而逃逸免疫攻击。CD24在许多肿瘤高表达，而Siglec-10被发现在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)高表达。敲除CD24或Siglec-10，以及使用单克隆抗体阻断CD24-Siglec-10相互作用，均可以增强对表达CD24的肿瘤细胞的吞噬，从而抑制肿瘤生长并延长生存[4]。
然而，由于受肿瘤微环境异质性的影响，免疫检查点抑制剂仅在淋巴细胞浸润水平较高的“热”肿瘤、突变负荷(TMB)高的肿瘤中有效[11]，而对一些肿瘤应答率不足[12]。另外，系统性给予免疫检查点抑制剂会导致免疫相关性不良反应(Immune-Related AdverseEvents,irAEs)，严重者可致死。因此，如何提高临床益处和减少免疫相关性不良事件是亟待解决的问题。
溶瘤病毒是一种新型药物，在癌症免疫治疗中的应用得到了广泛认可。溶瘤病毒通过多种机制选择性地在肿瘤细胞中选择性复制、裂解肿瘤细胞和激活抗肿瘤免疫等[13,14]，近年来，溶瘤病毒在临床应用中也取得了快速进展[15,16]。由于临床试验对晚期黑色素瘤患者显示出有益结果，表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的溶瘤病毒T-VEC在2015年已得到美国FDA批准。
目前有研究针对CD47靶点的溶瘤病毒相关研究，并显示出较好的抗肿瘤效果，然而有多种肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞，其SIRPa的表达水平较低，限制了SIRPα/CD47封闭的疗效。目前还没有针对Siglec10/CD24靶点的溶瘤病毒，也没有同时抑制和Siglec10/CD24调控轴的抗肿瘤药物。
参考文献:
[1]S.R.Gordon et al.,“PD-1expression by tumour-associated macrophagesinhibits phagocytosis and tumour immunity,”Nature,vol.545,no.7655,pp.495–499,2017.
[2]A.A.Barkal et al.,“Engagement of MHC class I by the inhibitoryreceptor LILRB1 suppresses macrophages and is a target of cancerimmunotherapy article,”Nat.Immunol.,vol.19,no.1,pp.76–84,2018.
[3]R.Majeti et al.,“CD47 Is an Adverse Prognostic Factor andTherapeutic Antibody Target on Human Acute Myeloid Leukemia Stem Cells,”Cell,vol.138,no.2,pp.286–299,2009.
[4]A.A.Barkal et al.,“CD24 signalling through macrophage Siglec-10isa target for cancer immunotherapy,”Nature,vol.572,no.7769,pp.392–396,Aug.2019.
[5]R.Advani et al.,“CD47 blockade by Hu5F9-G4 and rituximab in non-Hodgkin’s lymphoma,”N.Engl.J.Med.,vol.379,no.18,pp.1711–1721,2018.
[6]S.Lian et al.,“Simultaneous blocking of CD47 and PD-L1 increasesinnate and adaptive cancer immune responses and cytokine release,”EBioMedicine,vol.42,pp.281–295,2019.
[7]Y.Murata,T.Kotani,H.Ohnishi,and T.Matozaki,“The CD47-SIRPαsignalling system:Its physiological roles and therapeutic application,”J.Biochem.,vol.155,no.6,pp.335–344,2014.
[8]M.N.McCracken,A.C.Cha,and I.L.Weissman,“Molecular pathways:Activating T cells after cancer cell phagocytosis from blockade of CD47‘Don’teat Me’signals,”Clin.Cancer Res.,vol.21,no.16,pp.3597–3601,2015.
[9]C.M.Alvey et al.,“SIRPA-Inhibited,Marrow-Derived MacrophagesEngorge,Accumulate,and Differentiate in Antibody-Targeted Regression of SolidTumors,”Curr.Biol.,vol.27,no.14,pp.2065-2077.e6,2017.
[10]G.Y.Chen,N.K.Brown,P.Zheng,and Y.Liu,“Siglec-G/10 in self-nonselfdiscrimination of innate and adaptive immunity,”Glycobiology,vol.24,no.9,pp.800–806,2014.
[11]Yarchoan,M.et al.PD-L1 expression and tumor mutational burden areindependent biomarkers in most cancers.JCI Insight 4,doi:10.1172/jci.insight.126908,2019.
[12]Bonaventura,P.et al.Cold Tumors:A Therapeutic Challenge forImmunotherapy.Front Immunol 10,168,doi:10.3389/fimmu.2019.00168,2019.
[13]Bartlett DL,Liu Z,Sathaiah M,Ravindranathan R,Guo Z,He Y and GuoZS.Oncolytic viruses as therapeutic cancer vaccines.Mol Cancer 12,103,2013.
[14]Woller N,Gurlevik E,Ureche CI,Schumacher A and Kuhnel F.Oncolyticviruses as anticancer vaccines.Front Oncol 4,188,2014
[15]Pol J,Bloy N,Obrist F,Eggermont A,Galon J,Cremer I,Erbs P,Limacher JM,Preville X,Zitvogel L et al.Trial watch:oncolytic viruses forcancer therapy.Oncoimmunology 3,e28694,2014.
[16]Vacchelli E,Eggermont A,Sautes-Fridman C,Galon J,Zitvogel L,Kroemer G and Galluzzi L.Trial watch:oncolytic viruses for cancertherapy.Oncoimmunology 2,e24612,2013.
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒；该重组溶瘤病毒既能激活机体免疫，又能同时阻断固有免疫检查点SIRPα/CD47和Siglec10/CD24调控轴，通过整合免疫活化、招募和提高巨噬细胞吞噬肿瘤活性等多方面的抗肿瘤机制，达到极其显著的抗肿瘤作用，并减少阻断剂的脱靶效应，从而减少毒副作用的产生；
本发明的第二个目的是提供上述靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒的构建方法；
本发明的第三个目的是提供上述靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用了下列发明内容：
第一方面，本发明保护一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒，该重组溶瘤病毒既能激活机体免疫，又能同时阻断固有免疫检查点SIRPα/CD47和Siglec10/CD24调控轴。
优选的，所述重组溶瘤病毒为重组溶瘤腺病毒，所述腺病毒载体选自C血清型亚群，为Ad2、Ad5、Ad55等，优选Ad2或Ad5。
本发明保护一种靶向“别吃我”信号的重组人5型溶瘤病毒(Ad5)，其包含修饰的Ad5基因组；该修饰包含：(i)缺失野生型Ad5基因组的E1和/或E3区序列；(ii)编码阻断肿瘤“别吃我”信号的外源性核酸序列，其中所述的外源性核酸序列被稳定地加入到至少是所述经修饰的Ad5基因组的被缺失区域。
更具体的，一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒(Ad5)，其基因组E1和E3区域缺失，但包括早期复制所需的E1A序列，缺失区域被稳定地插入靶向阻断“别吃我”信号功能元件的外源核苷酸序列，所述的阻断“别吃我”信号功能元件选自靶向结合肿瘤细胞表面的CD24和/或CD47受体的元件；所述的靶向结合肿瘤细胞表面的CD24和/或CD47受体的功能元件选自包含Siglec-10和/或SIRPα配体的胞外区组件的组合；所述的胞外区组件的组合以Siglec-10单独，SIRPα单独，SIRPα-linker-Siglec10融合，或Siglec10-linker-SIRPα融合方式可操作地连接至信号肽序列3’端后。
更具体的，所述的胞外区组件是以可操作地连接方式连接至外源调控序列，包括启动子序列、增强子序列、标签序列和PA序列，形成功能元件。
优选的，所述启动子序列选自组成型、组织特异型或诱导型启动子；
更优选的，所述组成型启动子选自CMV、SV40或EF1α。
优选的，所述Siglec-10和/或SIRPα胞外区组件为人源化的，并可操作地通过Linker连接融合表达或单独表达；
SIRPα胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或与SEQ ID NO：1所述的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；
Siglec-10胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或与SEQ ID NO：2所述的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；
SIRPα-Linker-Siglec-10融合胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或与SEQ ID NO：3所述的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；
所述的Linker组件选自4GS或encodes linker peptide，所述encodes linkerpeptide的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，或与SEQ ID NO：4所述的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。
更优选的，所述SIRPα胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或与SEQ IDNO：1所述的序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性的核苷酸序列；
Siglec-10胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或与SEQ ID NO：2所述的序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性的核苷酸序列；
SIRPα-Linker-Siglec-10融合胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或与SEQ ID NO：3所述的序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性的核苷酸序列；
所述的Linker组件选自4GS或encodes linker peptide，所述encodes linkerpeptide的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，或与SEQ ID NO：4所述的序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同源性的核苷酸序列。
优选的，所述的信号肽为胞外分泌信号肽，选自人OSM、IgG2 H、Chymotrypsinogen、trypsinogen-2、IL-2或insulin。
更优选的，所述胞外分泌信号肽为人IL-2信号肽。
本发明还保护一种前述重组溶瘤病毒优化构建体1，在双特异性SIRPα与Siglec10胞外区功能组件的3’端可操作地连接Fc，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明还保护另一种前述重组溶瘤腺病毒优化构建体2，在双特异性SIRPα与Siglec10胞外区功能组件的Linker的5’端或3’端可操作地连接Trimer三聚体元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明还保护一种重组溶瘤腺病毒，重组溶瘤病毒优化构建体1，或重组溶瘤病毒优化构建体2的构建方法，包括如下步骤：
步骤1，质粒构建：首先合成目的基因，与pShuttle穿梭质粒酶切后连接，将连接产物用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，筛选阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得重组溶瘤腺病毒全长质粒；
步骤2，病毒拯救：重组溶瘤腺病毒全长质粒使用PacI线性化，纯化后转染293T细胞，至80％细胞出现病变，使用培养基将细胞吹下收集至离心管，反复冻融后离心，收集病毒上清-80℃保存做为毒种。
第二方面，本发明还保护前述溶瘤病毒，或前述重组溶瘤病毒优化构建体1，或前述重组溶瘤腺病毒优化构建体2在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还涉及所述重组溶瘤病毒，或前述重组溶瘤病毒优化构建体1，或前述重组溶瘤腺病毒优化构建体2在治疗癌症的方法中的应用。
本发明还提供上述溶瘤病毒、前述重组溶瘤病毒优化构建体1，或前述重组溶瘤腺病毒优化构建体2，与第二治疗药物联合在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，联合用药时，采用同时给药、或不分次序先后单独给药。
本发明还涉及前述溶瘤病毒，前述重组溶瘤病毒优化构建体1，或前述重组溶瘤腺病毒优化构建体2，与第二治疗药物联合在治疗癌症的方法中的应用。
第三方面，本发明还保护一种药物组合物，其包含上述重组溶瘤病毒，前述重组溶瘤病毒优化构建体1，或前述重组溶瘤腺病毒优化构建体2，以及药学上可接受的载体。该药物组合物被用于治疗肿瘤。
优选的，该组合物可被配制用于肿瘤内施用，优选被配制成瘤内注射制剂用于瘤内施用。
优选的，药学上可接受的载体包括填充剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等等。
优选的，所述的肿瘤选自恶性腹水瘤、胶质瘤、食道癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤，淋巴瘤中的一种或多种。
更优选的，所述瘤选自恶性腹水瘤、肝癌、胶质瘤或结肠癌。
第四方面，本发明还请求保护一种治疗癌症的方法，所述方法包括向施用对象施加有效量的本发明所述的重组溶瘤病毒，或所述药物组合物。
优选的，所述的施用对象是指人。
优选的，在施用所述重组溶瘤病毒、所述药物组合物之前、之中或之后，施用第二种疗法。
更优选的，所述的第二种疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法或手术介入疗法。
有益效果
本发明提供的一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒及其构建方法和应用，与现有技术相比，具有如下有益效果：该重组溶瘤病毒既能激活机体免疫，又能同时阻断固有免疫检查点SIRPα/CD47和Siglec10/CD24调控轴，通过整合免疫活化、招募和提高巨噬细胞吞噬肿瘤活性等多方面的抗肿瘤机制，达到极其显著的抗肿瘤作用，并减少阻断剂的脱靶效应，从而减少毒副作用的产生；具有极高的临床抗肿瘤药物的开发价值。
附图说明
本发明的各个方面及优点可从下面参考附图的详细描述中获得。
图1.表达不同基因的重组溶瘤腺病毒构建示意图：实施例中以腺病毒E1区域插入目的基因序列，分别表达SIRPα、Siglec10、SIRPα-Siglec10融合蛋白、SIRPα-Siglec10-Fc和三聚化SIRPα-Siglec10功能元件。
图2.重组溶瘤腺病毒表达并分泌目标蛋白：组溶瘤腺病毒感染293T细胞48h后，收取细胞上清，western blot检测三聚化SIRPα-Siglec10、SIRPα-Siglec10融合蛋白(图2上左)、SIRPα-Siglec10-Fc(图2上右)和SIRPα(图2中)的表达。组溶瘤腺病毒Ad5-Siglec10感染293T细胞48h后，收取细胞总RNA，用定量反转录PCR检测目的基因Siglec10的表达(图2下)。
图3Ad5-SS具有同时封闭CD47和CD24的功能：用Ad5-SS、Ad5-SIRPα、或Ad5-Siglec10分别感染293T细胞，48h后收集培养基上清液中所分泌的蛋白(包括SIRPα-Siglec10融合蛋白、SIRPα蛋白和Siglec10蛋白)。再将上清与结肠癌细胞CT26或肝癌细胞H22共孵育30min，收获细胞与抗CD47或抗CD24抗体孵育，再用流式细胞术检测CD47或CD24的表达。
图4重组溶瘤腺病毒显著增强巨噬细胞吞噬肿瘤功能：Ad5-con、Ad5-SIRPα、Ad5-Siglec10、Ad5-SSFC、Ad5-STS或Ad5-SS分别感染293T细胞，48h后收集培养基上清液中所分泌的蛋白(包括SIRPα蛋白、Siglec10蛋白、SIRPα-Siglec10-Fc、三聚化SIRPα-Siglec10蛋白和SIRPα-Siglec10融合蛋白)。在神经胶质瘤细胞GL261-LUC与巨噬细胞RAW264.7的共培养体系中，分别加入上述蛋白。24h后检测荧光素酶强度(反映巨噬细胞吞噬肿瘤的功能)。**P<0.01。
图5表达融合蛋白的重组溶瘤腺病毒不影响其溶瘤作用：不同感染复数(MOI＝0、0.1、1、10)的重组溶瘤腺病毒Ad5-con、Ad5-SS、Ad5-SSFC和Ad5-STS分别感染胰腺癌、肝细胞癌、结肠癌及神经胶质瘤细胞，72h后用MTT的方法检测细胞的活性。
图6表达融合蛋白的重组溶瘤腺病毒显著延长肝癌腹水瘤小鼠的生存时间：建立小鼠肝癌H22腹水瘤模型，腹水形成后，分别用Ad5-con、Ad5-SS、Ad5-SSFC、Ad5-STS进行小鼠腹腔内隔天注射，连续3次，第一次注射剂量为4×108PFU，第二次和第三次均为2×108PFU剂量，连续观察小鼠的生存时间。
图7重组溶瘤腺病毒具有显著的治疗肝癌作用：建立小鼠肝癌H22实体肿瘤模型，当皮下肿瘤体积>50mm3时，给予小鼠瘤内注射溶瘤病毒Ad5-SIRPα(图7第一行)、Ad5-Siglec10(图7第二行)、Ad5-SSFC(图7第三行)、Ad5-STS(图7第四行)和Ad5-SS(图7第五行)，隔天注射一次共3次，第一次以4×108PFU剂量，第二次和第三次以2×108PFU剂量。隔天监测肿瘤体积变化，并监测小鼠生存时间。CR表示肿瘤实体消失而完全治愈。*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。
图8重组溶瘤腺病毒具有显著的治疗结直肠癌的作用：建立小鼠结直肠癌MC38皮下瘤模型，当肿瘤体积增长>100mm3时，给予小鼠瘤内注射重组溶瘤腺病毒Ad5-SIRPα(图8第一行)、Ad5-Siglec10(图8第二行)、Ad5-SSFC(图8第三行)、Ad5-STS(图8第四行)、Ad5-SS(图8第五行)，隔天一次5×108PFU共3次，隔天监测肿瘤体积变化，并监测小鼠生存时间。*P<0.05，NS表示没有统计学意义。
图9重组溶瘤腺病毒具有显著的治疗神经胶质瘤的作用：建立小鼠神经胶质瘤GL261皮下瘤模型，当肿瘤体积增长>100mm3时，给予小鼠瘤内注射重组溶瘤腺病毒Ad5-SIRPα(图9第一行)、Ad5-Siglec10(图9第二行)、Ad5-SSFC(图9第三行)、Ad5-STS(图9第四行)、Ad5-SS(图9第五行)，隔天一次5×108PFU共3次。隔天监测肿瘤体积变化，并监测小鼠生存时间。CR表示完全治愈。*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。
图10重组溶瘤腺病毒能够诱导长期抗肿瘤免疫记忆：在前期重组溶瘤腺病毒治愈的肝癌H22皮下瘤模型小鼠中，给予原消失肿瘤部位的对侧皮下再次接种同种肝癌H22细胞，并连续检测小鼠肿瘤生长情况。正常未经治疗小鼠皮下接种相同肝癌H22细胞，作为对照。
图11重组溶瘤腺病毒Ad5-SS诱导巨噬细胞和CD8+T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫：建立小鼠肝癌H22皮下瘤模型，当肿瘤体积增长>100mm3时，给予小鼠腹腔注射抗CD4、抗CD8及抗NK中和抗体治疗，或给予巨噬细胞清除剂CL注射，同时给予小鼠瘤内注射重组溶瘤腺病毒Ad5-SS，隔天一次5×108PFU共3次。隔天监测肿瘤体积变化。**P<0.01,****P<0.0001。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1：表达目标基因的重组溶瘤腺病毒的构建及拯救
本实验室使用的Ad5重组溶瘤腺病毒在AdEasy系统上进行改造，包括：5个步骤：1)构建连接目的基因的穿梭质粒pShuttle；2)穿梭质粒与病毒载体同源重组；3)溶瘤腺病毒的拯救；4)病毒的扩增与纯化；5)病毒的滴度检测。
其中，步骤1)的方法如下：首先合成目的基因，与pShuttle穿梭质粒酶切后连接，将连接产物用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，筛选阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得重组溶瘤腺病毒全长质粒。
步骤2)和步骤3)的方法如下：重组溶瘤腺病毒全长质粒使用PacI线性化，纯化后转染293T细胞，至80％细胞出现病变，使用培养基将细胞吹下收集至离心管，反复冻融后离心，收集病毒上清-80℃保存做为毒种。
全合成CMV-E1A-P2A-EGFP-BGH polyA基因片段连接到pShuttle上的多克隆位点BamHI和HindIII之间构成Ad5-con；
全合成CMV-E1A-P2A-EF1α-SIRPα-Flag-BGH polyA基因片段连接到pShuttle上的多克隆位点BamHI和HindIII之间构成Ad5-SIRPα；
全合成CMV-E1A-P2A-EF1α-Siglec10-Flag-BGH polyA基因片段连接到pShuttle上的多克隆位点BamHI和HindIII之间构成Ad5-Siglec10；
全合成CMV-E1A-P2A-EF1α-SIRPα-Siglec10-Flag-BGH polyA基因片段连接到pShuttle上的多克隆位点BamHI和HindIII之间构成Ad5-SS；
全合成CMV-E1A-P2A-EF1α-SIRPα-Siglec10-Fc-BGH polyA基因片段连接到pShuttle上的多克隆位点BamHI和HindIII之间构成Ad5-SSFc；
全合成CMV-E1A-P2A-EF1α-SIRPα-trimerization domain-Siglec10-Flag-BGHpolyA基因片段连接到pShuttle(上的多克隆位点BamHI和HindIII之间构成Ad5-STS；
将所表达的基因片段克隆联接至腺病毒骨架质粒的CMV启动子上；再将构建好的pShuttle经PmeI酶切线性化之后，与骨架质粒pAdEasy-1同时转染大肠杆菌BJ5183，经卡那霉素抗性筛选阳性克隆菌落，扩增后提取质粒测序鉴定，再经PacI酶切后转染293T细胞，进行腺病毒的包装和拯救。
正确重组的质粒进行质粒大提，PacI酶切线性化病毒基因组、转染293T细胞完成病毒的包装、扩增和纯化。各重组溶瘤腺病毒Ad5结构，如图1所示SIRPα核酸序列如SEQ IDNO：1，Siglec10核酸序列如SEQ ID NO：2所示SIRPα-Linker-Siglec10核酸序列如SEQ IDNO：3所示SIRPα-Siglec10-Fc核酸序列如SEQ ID NO：5所示SIRPα-trimerization domain-Siglec10核酸序列如SEQ ID NO：6所示。
实施例2：重组溶瘤腺病毒目的基因的表达及蛋白的检测
本发明所构建的多个重组溶瘤腺病毒以感染复数MOI为10，分别感染2×106个293T细胞，48h后收集细胞培养上清，western Blot检测Flag蛋白和Fc蛋白，以确定上清中SIRPα、SIRPα-Siglec10融合蛋白、SIRPα-Siglec10-Fc和三聚化SIRPα-Siglec10的表达情况；通过qPCR检测细胞内Siglec10表达。结果如图2所示，各构建的重组溶瘤腺病毒Ad5均能表达并分泌相应的功能蛋白。
实施例3：重组溶瘤腺病毒表达的融合蛋白阻断免疫检查点的功能检测
Ad5-SIRPα、Ad5-Siglec10或Ad5-SS分别感染2×106个293T细胞(MOI＝10)48h收集培养基上清液中的蛋白。CT26和H22分别与PBS、Ad5-SIRPα、Ad5-Siglec10或Ad5-SS上清液(1ml)预孵育30min后，细胞分别用抗CD47或抗CD24抗体孵育，经流式细胞术检测CD47或CD24的表达。结果如图3所示，SIRPα能够特异性地与CD47结合，降低抗CD47抗体的结合信号；Siglec10能够特异性地与CD24结合，降低抗CD24抗体的结合信号；而SIRPα-Siglec10融合蛋白，则能够同时特异性地结合CD47和CD24，既能降低抗CD47抗体又能降低抗CD24抗体的结合信号，说明SIRPα-Siglec10融合蛋白具有双重阻断免疫检查点CD47和CD24的功能。
实施例4：重组腺病毒促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的功能验证
Ad5-con、Ad5-SIRPα、Ad5-Siglec10、Ad5-SSFC、Ad5-STS或Ad5-SS分别感染2×106个293T细胞(MOI＝10)48h收集培养基上清液中的蛋白。在96孔板中分别加入3000个神经胶质瘤GL261-LUC细胞和1500个巨噬细胞RAW264.7，分别与上述上清液200μl。24h后检测荧光素信号强度。通过对比Ad5-con的荧光信号强度，计算各组的细胞相对活率。结果如图4所示，相对于对照上清，加入含有SIRPα、Siglec10、融合蛋白SS、SSFC和STS的上清后，肿瘤细胞的活率显著下降，表明重组溶瘤腺病毒所表达的蛋白均能够显著提高巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的功能。
实施例5：重组溶瘤腺病毒体外溶瘤作用验证
96孔板中培养鼠胶质瘤细胞系GL261、鼠肝癌细胞系H22、鼠胰腺癌细胞系Panc02、鼠结肠癌细胞系CT26，每孔接种1×104个细胞，隔夜待细胞贴壁后接种不同MOI(0、0.1、1、10)的重组溶瘤Ad5-SSFc、Ad5-STS或Ad5-SS病毒，72h，用MTT法分别检测细胞活力水平，结果如图5所示。
实施例6：重组溶瘤腺病毒治疗肝癌腹水瘤的作用验证
建立小鼠肝癌H22腹水瘤模型，腹水形成后，分别用Ad5-con、Ad5-SS、Ad5-SSFC、Ad5-STS进行小鼠腹腔内隔天注射，连续3次，第一次注射剂量为4×108PFU，第二次和第三次均为2×108PFU剂量，连续观察小鼠的生存时间。结果显示Ad5-SS、Ad5-SSFC显著延长小鼠生存时间，约20～30％个体获得完全缓解。
实施例7：重组溶瘤腺病毒治疗肝癌实体肿瘤的作用验证
建立小鼠肝癌H22实体肿瘤模型，当皮下肿瘤体积>50mm3时，给予小鼠瘤内注射溶瘤病毒Ad5-SIRPα、Ad5-Siglec10、Ad5-SSFC、Ad5-STS和Ad5-SS，隔天注射一次共3次，第一次以4×108PFU剂量，第二次和第三次以2×108PFU剂量。隔天监测肿瘤体积变化，并监测小鼠生存时间。结果显示上述重组溶瘤腺病毒对肝癌实体肿瘤具有极其显著的抑制作用，并显著延长小鼠的生存时间。各组均有治疗后肿瘤完全消失的例数，从30％～70％，其中表达融合蛋白的Ad5-SS达到70％以上的治愈。
实施例8：重组溶瘤腺病毒治疗结直肠癌实体肿瘤的作用验证
建立小鼠结直肠癌MC38皮下瘤模型，当肿瘤体积增长>100mm3时，给予小鼠瘤内注射重组溶瘤腺病毒Ad5-SIRPα、Ad5-Siglec10、Ad5-SSFC、Ad5-STS、Ad5-SS，隔天一次5×108PFU共3次，隔天监测肿瘤体积变化，并监测小鼠生存时间。结果显示Ad5-STS和Ad5-SS能够显著抑制结直肠癌的生长并延长小鼠生存时间。
实施例9：重组溶瘤腺病毒治疗神经胶质瘤的作用验证
建立小鼠神经胶质瘤GL261皮下瘤模型，当肿瘤体积增长>100mm3时，给予小鼠瘤内注射重组溶瘤腺病毒Ad5-SIRPα、Ad5-Siglec10、Ad5-SSFC、Ad5-STS、Ad5-SS，隔天一次5×108PFU共3次。隔天监测肿瘤体积变化，并监测小鼠生存时间。结果显示上述重组溶瘤腺病毒对神经胶质瘤具有极其显著的治疗作用，除了Ad5-SIRPα只有>80％的治愈率，其它都达到全部治愈的效果，说明重组溶瘤腺病毒对胶质瘤极具治疗作用。
实施例10：重组溶瘤腺病毒诱导长期抗肿瘤免疫记忆的验证
在前期重组溶瘤腺病毒治愈的肝癌H22皮下瘤模型小鼠中，给予原消失肿瘤部位的对侧皮下再次接种同种肝癌H22细胞，并连续检测小鼠肿瘤生长情况。正常未经治疗小鼠皮下接种相同肝癌H22细胞，作为对照。结果显示，所有治愈小鼠对接种同种肿瘤细胞，均没有形成新的肿瘤生长，而对照组小鼠则全部成瘤，说明重组溶瘤腺病毒能够诱导长期的特异性免疫监视。
实施例11：重组溶瘤腺病毒Ad5-SS抗肿瘤机制：
建立小鼠肝癌H22皮下瘤模型，当肿瘤体积增长>100mm3时，给予小鼠腹腔注射抗CD4、抗CD8及抗NK中和抗体治疗，或给予巨噬细胞清除剂CL注射，同时给予小鼠瘤内注射重组溶瘤腺病毒Ad5-SS，隔天一次5×108PFU共3次，隔天监测肿瘤体积变化。结果显示，当巨噬细胞和CD8+T细胞被清除后，Ad5-SS的抗肿瘤效果几乎消失，而NK细胞和CD4+T细胞被删除后，Ad5-SS仍具有良好的抗肿瘤效果，说明Ad5-SS的抗肿瘤作用，是通过增强巨噬细胞和CD8+T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
序列表
<110> 南京惟亚德生物医药有限公司
<120> 一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtgttgg ttgcagctgg agagacagcc 60
actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 120
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 180
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 240
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 300
gtggagttta agtctgga 318
<210> 2
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgggagat tctggatacg agtgcaggag tcagtgatgg tgccggaggg cctgtgcatc 60
tctgtgccct gctctttctc ctacccccga caagactgga cagggtctac cccagcttat 120
ggctactggt tcaaagcagt gactgagaca accaagggtg ctcctgtggc cacaaaccac 180
cagagtcgag aggtggaaat gagcacccgg ggccgattcc agctcactgg ggatcccgcc 240
aaggggaact gctccttggt gatcagagac gcgcagatgc aggatgagtc acagtacttc 300
tttcgggtgg ag 312
<210> 3
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 120
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 180
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 240
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 300
gtggagttta agtctggagg tggaggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 360
tcggatggga gattctggat acgagtgcag gagtcagtga tggtgccgga gggcctgtgc 420
atctctgtgc cctgctcttt ctcctacccc cgacaagact ggacagggtc taccccagct 480
tatggctact ggttcaaagc agtgactgag acaaccaagg gtgctcctgt ggccacaaac 540
caccagagtc gagaggtgga aatgagcacc cggggccgat tccagctcac tggggatccc 600
gccaagggga actgctcctt ggtgatcaga gacgcgcaga tgcaggatga gtcacagtac 660
ttctttcggg tggag 675
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggagtgcat ccgccccaaa gcttgaagaa ggtgaatttt cagaagcacg cgta 54
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<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 180
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 240
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 300
gtggagttta agtctggagg gagtgcatcc gccccaaagc ttgaagaagg tgaattttca 360
gaagcacgcg tagatgggag attctggata cgagtgcagg agtcagtgat ggtgccggag 420
ggcctgtgca tctctgtgcc ctgctctttc tcctaccccc gacaagactg gacagggtct 480
accccagctt atggctactg gttcaaagca gtgactgaga caaccaaggg tgctcctgtg 540
gccacaaacc accagagtcg agaggtggaa atgagcaccc ggggccgatt ccagctcact 600
ggggatcccg ccaaggggaa ctgctccttg gtgatcagag acgcgcagat gcaggatgag 660
tcacagtact tctttcgggt ggaggacaaa actcacgagt gtcccccatg cgcagctcca 720
gacctcttgg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg 780
atctccctga gccccatggt cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagac 840
gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 900
agagaggatt acaacagtac tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 960
tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca gagccctccc atcccccatc 1020
gagaaaacca tctcaaaacc cagagggcca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct 1080
ccaccagcag aagagatgac taagaaagag ttcagtctga cctgcatgat cacaggcttc 1140
ttacctgccg aaattgctgt ggactggacc agcaatgggc gtacagagca aaactacaag 1200
aacaccgcaa cagtcctgga ctctgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctcagagta 1260
caaaagagca cttgggaaag aggaagtctt ttcgcctgct cagtggtcca cgagggtctg 1320
cacaatcacc ttacgactaa gaccatctcc cggtctctgg gtaaatga 1368
<210> 6
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtgttgg ttgcagctgg agagacagcc 60
actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 120
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 180
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 240
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 300
gtggagttta agtctggaca gaccatgctg gacaagatcc gggaggtgcc ggagggctgg 360
ctcatctttg tggccgagag ggaagagctc tatgtacgcg ttagaaatgg cttccggaag 420
gtgctgctgg aggcccggac agccctcccg agaggcacgg gcaatgagga tgggagattc 480
tggatacgag tgcaggagtc agtgatggtg ccggagggcc tgtgcatctc tgtgccctgc 540
tctttctcct acccccgaca agactggaca gggtctaccc cagcttatgg ctactggttc 600
aaagcagtga ctgagacaac caagggtgct cctgtggcca caaaccacca gagtcgagag 660
gtggaaatga gcacccgggg ccgattccag ctcactgggg atcccgccaa ggggaactgc 720
tccttggtga tcagagacgc gcagatgcag gatgagtcac agtacttctt tcgggtggag 780

Claims (12)

1.一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒，其特征在于，该重组溶瘤病毒既能激活机体免疫，又能同时阻断固有免疫检查点SIRPα/CD47 和Siglec10/CD24调控轴；优选的，所述重组溶瘤病毒为重组溶瘤腺病毒，所述腺病毒载体选自C血清型亚群，为Ad2或Ad5。
2.一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒包含修饰的Ad5基因组；该修饰包含：（i）缺失野生型Ad5基因组的E1和/或E3区序列；（ii）编码阻断肿瘤“别吃我”信号的外源性核酸序列，其中所述的外源性核酸序列被稳定地加入到至少是所述经修饰的Ad5基因组的被缺失区域。
3.根据权利要求1或2所述的一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒包含修饰的Ad5基因组，其基因组E1和E3区域缺失，但包括早期复制所需的E1A序列，缺失区域被稳定地插入靶向阻断“别吃我”信号功能元件的外源核苷酸序列，所述的阻断“别吃我”信号功能元件选自靶向结合肿瘤细胞表面的CD24和/或CD47受体的元件；
所述的靶向结合肿瘤细胞表面的CD24和/或CD47受体的元件选自包含Siglec-10和/或SIRPα配体的胞外区组件的组合；
所述的胞外区组件的组合以Siglec-10单独，SIRPα单独，SIRPα-linker-Siglec10融合，或Siglec10-linker-SIRPα融合方式可操作地连接至信号肽序列3’端后；
优选的，所述的胞外区组件是以可操作地连接方式连接至外源调控序列，包括启动子序列、增强子序列、标签序列和PA序列，形成功能元件；更优选的，所述启动子序列选自组成型、组织特异型或诱导型启动子；所述组成型启动子优选自CMV、SV40或EF1α。
4.根据权利要求3所述的一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述Siglec-10和/或SIRPα胞外区组件为人源化的，并可操作地通过Linker连接融合表达或单独表达；
SIRPα胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或与SEQ ID NO：1所述的序列具有80%以上同源性的核苷酸序列；
Siglec-10胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，或与SEQ ID NO：2所述的序列具有80%以上同源性的核苷酸序列；
SIRPα-Linker-Siglec-10融合胞外区组件的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，或与SEQID NO：3所述的序列具有80%以上同源性的核苷酸序列；
所述的Linker组件选自4GS或encodes linker peptide，所述encodes linkerpeptide的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，或与SEQ ID NO：4所述的序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的一种靶向“别吃我”信号的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述的信号肽为胞外分泌信号肽，选自人OSM、IgG2 H、Chymotrypsinogen、trypsinogen-2、IL-2或insulin；
优选的，所述胞外分泌信号肽为人IL-2信号肽。
6.一种权利要求3所述的重组溶瘤病毒优化构建体，其特征在于：在双特异性SIRPα与Siglec10胞外区功能组件的3’端可操作地连接Fc，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.一种权利要求3所述的重组溶瘤腺病毒优化构建体，其特征在于：在双特异性SIRPα与Siglec10胞外区功能组件的Linker的5’端或3’端可操作地连接Trimer三聚体元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
8.一种权利要求1-5任一所述的重组溶瘤腺病毒，或权利要求6所述的重组溶瘤病毒优化构建体，或权利要求7所述的重组溶瘤病毒优化构建体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，质粒构建：合成目的基因，与pShuttle穿梭质粒酶切后连接，将连接产物用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，筛选阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得重组溶瘤腺病毒全长质粒；
步骤2，病毒拯救：重组溶瘤腺病毒全长质粒使用PacI线性化，纯化后转染293T细胞，至80%细胞出现病变，使用培养基将细胞吹下收集至离心管，反复冻融后离心，收集病毒上清-80℃保存做为毒种。
9.权利要求1-5任一所述的重组溶瘤病毒，或权利要求6所述的重组溶瘤病毒优化构建体，或权利要求7所述的重组溶瘤病毒优化构建体在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-5任一所述的重组溶瘤病毒，或权利要求6所述的重组溶瘤病毒优化构建体，或权利要求7所述的重组溶瘤病毒优化构建体，与第二治疗药物联合在制备抗肿瘤药物中的应用。
11.一种药物组合物，其含有权利要求1-5中任一所述的重组溶瘤病毒，或权利要求书6所述的重组溶瘤腺病毒优化构建体，或权利要求书7所述的重组溶瘤腺病毒优化构建体，以及药学上可接受的载体；优选的，所述的组合物被配制用于肿瘤内施用；更优选的，所述的组合物被配制成瘤内注射制剂施用于瘤内。
12.根据权利要求9-10任一所述的应用，或权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述的肿瘤选自恶性腹水瘤、胶质瘤、食道癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、胶质瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤，淋巴瘤中的一种或多种；优选的，所述瘤选自恶性腹水瘤、肝癌、胶质瘤或结肠癌。
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