CN116535436A - 一种氟离子荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生化分析技术领域中的一种氟离子荧光探针的合成方法，其以试卤灵为荧光团，硅氧键为识别基团，设计新的合成路线合成了一种氟离子荧光探针，从而实现对氟离子的检测。本申请不需要大型仪器，操作简单，反应条件温和，便捷高效，在紫外和荧光光谱上氟离子荧光探针对氟离子有显著的信号响应性能，以及运用到牙齿上可与其游离氟发生反应并成像。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种氟离子荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
氟是人体的必需元素之一，对人体健康起着至关重要的作用。氟对于牙齿和骨骼的生长发育以及钙化尤为重要，当人体摄入适量的氟时，有助于釉质的形成、降低患龋率和牙釉质脱矿的风险，也能保证人体骨骼与牙齿的健康。当摄入氟不足时，容易导致人体骨质疏松等疾病，而摄入氟过量又会对人体健康产生严重的不良影响，如导致罹患氟斑牙、氟骨症、肾损伤等疾病。因此，对环境水、食物、血液尿液和牙齿等样品中氟离子检测对监测人体健康，以及对氟斑牙等疾病的发生发展机制研究有重要意义。
目前，氟的检测方法主要有离子色谱法、离子选择性电极法、气相色谱法、比色法、荧光探针法等，其中离子色谱法、气相色谱法法等需借助大型色谱仪器进行检测，并且前处理等操作繁琐费时，比色法抗干扰能力较差，离子选择性电极法无法对氟分布成像监测，而荧光探针法则具有可设计性，并具有高灵敏性、高特异性等优点。基于此，研究人员设计合成了许多特异性检测氟离子的荧光探针，应用于饮水、食品、环境和人体体液样本中的氟离子含量检测，对于饮食安全和人体健康监测起到非常重要的作用。
氟是自然界中电负性最大的元素，与硅原子有着极强的亲和力，其亲和力大于探针分子内部硅原子与氧原子的结合能，导致氟离子的存在能使分子中的硅-氧键断裂。基于此原理，科研人员以带硅-氧键的基团作识别基团，与荧光报告基团结合，设计合成荧光分子探针。如王小春等人(Journal of Hazardous Materials,2021,413:125384.)合成了一种具有硅氧键结构的新型荧探针，成功应用于饮用水、尿液等氟离子的检测。曲晓刚等人(Sensors and Actuators B:Chemical,2020,321:128630.)构建氟离子检测的荧光探针，该探针可对牙齿中氟离子进行检测和显影，具有诊断氟斑牙的潜能。然而上述探针的合成方法较为繁琐，合成步骤多，因此有必要设计新的氟离子荧光探针合成路径并对其进行应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，设计一种方法可一步合成氟离子荧光探针(RF-Probe)，该探针对氟离子具有显著信号响应，可以用于牙齿中氟离子的成像及检测。
本发明的目的之一是提供一种氟离子荧光探针的合成方法，将试卤灵(Resorufin)和咪唑(Imidazole)溶解在N,N-二甲基甲酰胺溶剂(DMF)中，再向混合物中加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS)，连续搅拌直到反应完成，得到氟离子荧光探针；
合成路线如下所示：
进一步，反应完成后，向反应物质中加入水淬灭，再用乙醚萃取混合物，合并有机层并用氯化铵饱和溶液和氯化钠饱和溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后柱层析纯化，继续减压浓缩合并的有机层得到氟离子荧光探针。
进一步，试卤灵、叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑的摩尔比为1:(1～1.5):(1.5～2.5)。优选为1:1:1.5、1:1.5:2.5、1:1:2，最优选为1:1.5:2.5。
进一步，连续搅拌反应温度为0～30℃。优选为4～25℃。
进一步，连续搅拌反应完成时间为1～12h。时间优选为4～8h。
本发明的目的之二是提供上述方法合成的氟离子荧光探针，其特征在于：具体结构式如下：
本发明的目的之三是提供氟离子荧光探针在氟离子检测方面的应用。
进一步的，所述氟离子荧光探用于对牙齿上游离氟的检测。
具体检测时，包括以下步骤：
步骤一：分别将上述合成的氟离子荧光探针溶于有机溶剂中，配制成氟离子荧光探针的溶液；
步骤二：将配置的氟离子荧光探针溶液与氟化钠和超纯水混合，分别用荧光分光光度计(激发波长均为467nm)，以及紫外-可见分光光度计检测其光谱响应；
步骤三：用硬组织切片机对牙齿进行片切，切片后左右分开备用。将氟离子荧光探针溶解于乙醇中配置成氟离子荧光探针溶液，使用探针溶液涂覆牙齿表面，静置3h待溶液中乙醇挥发完毕，在可见光以及365nm紫外灯下拍照观察。
进一步，氟离子荧光探针溶于有机溶剂中，有机溶剂优选为：二甲亚砜(DMSO)、乙腈或乙醇。
进一步，氟离子荧光探针溶于有机溶剂的浓度为0.1μM～1mM，浓度优选为1μM～100μM。
进一步，将三种有机溶剂中配置的氟离子荧光探针溶液，氟化钠，超纯水混合，其体系中氟离子荧光探针溶液和水的体积比：V/V＝9:1、V/V＝8:2，体积比优选为V/V＝9:1。
进一步，涂布在牙齿上的试卤灵、氟离子荧光探针浓度为10μM～1mM。
本发明的工作原理：试卤灵是一种有优异的荧光探针，常被用来作为小分子检测以及细胞成像的原料，在其结构上以硅-氧键嫁接一个官能团使其从有荧光的试卤灵变成无荧光的氟离子荧光探针，氟离子可以有效的识别探针的硅-氧键，能切断硅-氧键，使无荧光的氟离子荧光探针变成有荧光的试卤灵，从而根据恢复荧光的试卤灵的荧光强度来定量检测氟离子。
本发明有益效果：
1、利用氟离子对硅-氧键有较强的亲和力，通过对试卤灵进行修饰，设计新的合成路径并成功一步合成了氟离子荧光探针，该合成方法具有简单，快速绿色的特点。
2、该氟离子荧光探针能够对氟离子进行特异性识别的能力，能够对牙齿中的游离氟离子具有明显响应，说明该探针具有在诊断氟斑牙及研究氟斑牙的发生发展机制的研究中具有应用的潜力。
附图说明
图1为本发明基于氟离子荧光探针与氟离子的识别机理图；
图2为本发明实施例1中合成的氟离子荧光探针的HNMR图谱；
图3为本发明应用例1中氟离子荧光探针在DMSO中与氟离子的反应荧光图；
图4为本发明应用例2中氟离子荧光探针在DMSO中与氟离子的反应紫外图；
图5为发明应用例3中氟离子荧光探针与牙齿上的游离氟发生反应的成像图，A.可见光下，B.紫外光照射下；2.试卤灵，4.氟离子荧光探针。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
下述技术方案中，将试卤灵、咪唑、N,N-二甲基甲酰胺的溶液中以及叔丁基二甲基氯硅烷均可通过商购获得。
实施例1
将试卤灵0.2g(0.93mmol)、咪唑0.159g(2.34mmo l)、溶解在N,N-二甲基甲酰胺的溶液(5mL)中，再向混合物中加入叔丁基二甲基氯硅烷0.212g(1.41mmol)，室温反应5h，薄层色谱法检测反应完毕，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取3次(20mL×3)，用氯化铵饱和溶液、氯化钠饱和溶液洗涤有机层(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)。在真空下浓缩合并的有机层得到氟离子荧光探针产物0.162g，产率为53％，并用HNMR对产物进行表征，结果如图2所示。
实施例2
将试卤灵0.2g(0.93mmol)、咪唑0.095g(1.4mmol)、溶解在N,N-二甲基甲酰胺的溶液(10mL)中，再向混合物中加入叔丁基二甲基氯硅烷0.141g(0.73mmol)，室温反应5h，薄层色谱法反应完毕，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取3次(20mL×3)，用氯化铵饱和溶液、氯化钠饱和溶液洗涤有机层(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸除溶剂，柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)。在真空下浓缩合并的有机层得到氟离子荧光探针产物0.168g，产率为55％。
应用例1
将以下四组样品：1:氟离子荧光探针溶液(溶剂为DMSO、终浓度为20μM)。2:氟离子荧光探针溶液(溶剂为DMSO、终浓度为20μM)，氟离子(终浓度为200μM)。3:氟离子荧光探针溶液(溶剂为VDMSO:VWater＝9:1、终浓度为20μM)。4:氟离子荧光探针溶液(溶剂为VDMSO:VWater＝9:1、终浓度为20μM)，氟离子(终浓度为200μM)(VDMSO:VWater＝9:1)，反应30min，后用荧光分光光度计分别测量其荧光光谱变化。
如图3所示：初始时，氟离子荧光探针(溶剂为DMSO)溶液和含水氟离子荧光探针(溶剂为VDMSO:VWater＝9:1)溶液的荧光光谱没有明显的变化，但在加入氟离子后两者荧光光谱均有明显的变化，含水氟离子荧光探针溶液荧光强度与纯DMSO氟离子荧光探针溶液荧光强度相比，含有水的体系具有更高的荧光强度，具有更强的氟离子响应性能，表明氟离子荧光探针对氟离子具有极强的响应性能。
应用例2
将以下四组样品：1:氟离子荧光探针溶液(溶剂为DMSO、终浓度为20μM)。2:氟离子荧光探针溶液(溶剂为DMSO，终浓度为20μM)，氟离子(终浓度为200μM)。3:氟离子荧光探针溶液(溶剂为VDMSO:VWater＝9:1、终浓度为20μM)。4:氟离子荧光探针溶液(溶剂为VDMSO:VWater＝9:1、终浓度为20μM)，氟离子(终浓度为200μM)，样品中加入氟离子反应30min后用紫外分光光度计分别测量其吸收光谱光谱变化。
如图4所示：初始时，氟离子荧光探针(溶剂为DMSO)溶液和含水氟离子荧光探针(溶剂为VDMSO:VWater＝9:1)溶液的紫外吸收光谱没有明显的变化，但在加入氟离子后两者紫外光谱均有明显的变化，含水氟离子荧光探针溶液紫外吸光度与纯DMSO氟离子荧光探针溶液紫外吸光度相比，含有水的体系具有更高的吸光度，具有更强的氟离子响应性能，也表明了氟离子荧光探针对氟离子具有极强的响应性能。
应用例3
将试卤灵溶解于乙醇中配置成500μM的试卤灵溶液，氟离子荧光探针溶解在乙醇中配置成浓度为500μM的氟离子荧光探针溶液备用。取两片已经切好的牙齿，一片牙齿的左边1部分涂布乙醇溶液，右边2的部分涂布试卤灵溶液，另外一片牙齿左边3部分涂布乙醇溶液，右边4部分涂布氟离子荧光探针溶液。静置3h待溶液中乙醇挥发完后，在可见光以及365nm紫外灯下拍照观察。
如图5所示：从可图中可以看出可见光下有试卤灵和氟离子荧光探针的部分有很明显的颜色改变，且在紫外灯下可以看见很明显的荧光，说明氟离子荧光探针涂布在牙齿上后与牙齿上的游离氟发生反应生成有荧光的试卤灵，且与只涂布试卤灵的牙齿上荧光结果差别不大，从而达到检测牙齿上的游离氟的意义，具有在未来诊断氟斑牙的可行性。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种氟离子荧光探针的合成方法，其特征在于，将试卤灵和咪唑溶解在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，再向混合物中加入叔丁基二甲基氯硅烷，连续搅拌直到反应完成，得到氟离子荧光探针；
合成路线如下所示：
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：反应完成后，向反应物质中加入水淬灭，再用乙醚萃取，合并有机层并用氯化铵饱和溶液和氯化钠饱和溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后柱层析纯化，继续减压浓缩合并的有机层得到氟离子荧光探针。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：试卤灵、叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑的摩尔比为1:(1～1.5):(1.5～2.5)。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：连续搅拌反应温度为0～30℃。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：连续搅拌反应完成时间为1～12h。
6.根据权利要求1～5任一所述的方法合成的氟离子荧光探针，其特征在于：具体结构式如下：
7.根据权利要求6所述的氟离子荧光探针在氟离子检测方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述氟离子荧光探用于对牙齿上游离氟的检测。
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